(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE蛋白电泳检测标准操作规程(非还原&还原)
GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICESDS-PAGE蛋白电泳检测标准操作规程（还原&非还原）编号：SDS-PAGE蛋白电泳检测起草人：部门审核：QA审核：替代：□新订：□日期：日期：日期：修订号：0批准：年月日生效日期：年月日文件分发部门：GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICESDS-PAGE蛋白电泳检测编号：SDS-PAGE蛋白电泳检测一目的保证产品电泳电泳分子量和纯度检测按规范进行和检定结果的准确可靠。
二范围用于规范电泳电泳分子量和纯度的测定。
三责任质量控制部人员。
四内容1试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。
2 溶液的配制2.1A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取90.75gTris碱(分析纯)加适量的超纯水（约400ml）溶解,用6M盐酸调pH值至8.8,加超纯水定容至500 ml。
贴上标贴，室温储存。
此溶液有效使用期限为三个月。
6M盐酸（调pH用）：浓盐酸50ml，加50ml纯化水，混匀。
2.2、B液: 0.5MTris·HCl pH6.8称取60.5gTris碱(分析纯)加适量的超纯水（约400ml）溶解,用6M盐酸调pH值至6.8,加超纯水定容至1000 ml。
贴上标贴，室温储存。
2.3C液: 30%丙烯酰胺-0.8%N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶液称取300g丙烯酰胺(分析纯),8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解(一般500ml，因为丙烯酰胺具有溶胀性的特点),再定容至1000 ml,用滤纸过滤。
贴上标贴，避光4℃保存。
2.4D液:1%SDS称取2gSDS(分析纯),用超纯水溶解至200 ml.贴上标贴，4℃保存。
2.5E液:10%过硫酸铵GOOD RESEARCH & DEVELOPMENT PRACTICESDS-PAGE蛋白电泳检测编号：称取10g过硫酸铵(分析纯)，用超纯水溶解至100 ml，以1ml/支分装，贴上标贴，－20℃保存。
蛋白质电泳操作步骤
SDS-PAGE电泳操作步骤：试剂配制：（实验中采用均为分析纯）（1）丙烯酰胺贮液（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）丙烯酰胺贮液（T=30%，C=3%）称取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100 ml，过滤备用。
(试剂有毒，操作中注意防护)（2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）6.06 g Tris溶解于35 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水定容至50 ml。
（3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）18.16 g Tris溶解于75 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水定容至100 ml。
（4）10% SDS（5）10% 过硫酸铵（APS）：使用前新鲜配制，低浓度APS一般当天用当天配制，勿过夜使用。
（6）尿素（7）TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)（8）电极缓冲液(1×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.025 mol/L Tris，0.192 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（9）电极缓冲液(2×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.050 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（10）样品缓冲液（pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）1.6 ml浓缩胶缓冲液（pH 6.8）+ 4 ml 10% SDS + 0.6 g二硫苏糖醇(DTT) +2.5 ml 87%甘油+0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20 ml.（11）考玛斯亮蓝R-250染色方法：a．固定液20%三氯乙酸b．脱色液250 ml乙醇，80 ml冰醋酸，加水稀释至1000 ml。
c．染色液称取0.29 g考玛斯亮蓝R-250溶于250 ml上述脱色液中样品处理：处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20℃下。
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作规程
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作----(纯度检测)一.目的：检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。
二.依据：《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。
三. 职责：质量控制部。
四.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。
五. 器皿与耗品：所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。
tube、tip一次性使用。
六. 仪器设备：电泳仪（电源1--300V）电泳槽灌胶模具染色具凝胶扫描仪七. 环境要求：相对洁净环境，室温。
八. 溶液的配置：1.A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）2.B液: 1MTris·HCl pH6.8称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）3.C液: 30%丙烯酰胺称取29.2g丙烯酰胺(分析纯),0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解,再定容至100 ml,用滤纸过滤,。
贴上标贴，避光4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）4.D液:10%SDS称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）5.E液:10%过硫酸胺称取10g过硫酸胺(分析纯), 用超纯水溶解至100 ml。
贴上标贴，-20℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）6.F液:TEMED(amersco)7.电泳缓冲液(10X)称取60.57g Tris碱(分析纯),288.268g甘氨酸(分析纯),20gSDS(分析纯),加超纯水定容至2000ml，临用前加超纯水稀释10倍，贴上标贴，室温储存。
SDS-PAGE-蛋白电泳分析
SDS－PAGE 蛋白电泳分析一、目的掌握SDS-PAGE 电泳原理与方法二、电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。
这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。
由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。
三、试剂配制1．30% 丙烯酰胺：将29g 丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml 的水中。
加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。
用过滤器（0.45μm 孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温(丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。
称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料)。
2．1M Tris-Cl: 称取12.191g Tris 碱溶于80ml 蒸馏水中，用浓HCl 调到所需pH 值，定容至100ml。
蛋白质sds-page凝胶电泳实验步骤
蛋白质sds-page凝胶电泳实验步骤嘿，朋友们！今天咱就来讲讲蛋白质 SDS-PAGE 凝胶电泳实验那些事儿。
首先呢，得准备好各种材料和试剂，这就好比要出门得先把鞋穿好一样重要。
什么电泳槽啦、玻璃板啦、丙烯酰胺溶液啦等等，一个都不能少。
然后就是配胶啦！这就像做菜，得把各种材料按照一定的比例调好。
先配分离胶，小心翼翼地把各种溶液倒在一起，搅拌均匀，可别搅出气泡来哟，不然就像蛋糕里有了疙瘩，可不好看啦。
接着让它静置一会儿，等它凝固得差不多了，再倒上浓缩胶，这浓缩胶就像是给蛋糕加上一层漂亮的奶油。
胶配好啦，接下来就是上样啦！把处理好的蛋白质样品加到孔里，就好像是给小格子里放上宝贝。
这时候可得细心点，别把样品洒出来啦。
接着就是电泳啦！通上电，让蛋白质在电场里欢快地奔跑起来。
它们就像一群小朋友在赛跑，跑得快慢不一样，最后就分开啦。
在这个过程中，可别闲着呀，要时刻盯着，就像看着自己的宝贝在比赛一样。
看看电泳液有没有变少呀，电泳的情况怎么样呀。
等电泳结束啦，就可以染色啦！把胶放到染色液里泡一泡，就像给它洗个彩色的澡。
等染上颜色了，就能清楚地看到蛋白质的条带啦。
哎呀，你说这蛋白质 SDS-PAGE 凝胶电泳实验是不是很有趣呀？就像一场小小的冒险，每一步都充满了惊喜和挑战。
虽然过程可能有点繁琐，但当你看到那清晰的条带时，就会觉得一切都值得啦！就好像辛苦种的花儿终于开了一样开心。
所以呀，别害怕，大胆地去尝试吧！只要按照步骤一步一步来，肯定能做出漂亮的结果。
就像学走路一样，一开始可能会跌跌撞撞，但只要坚持，总会走得稳稳当当的。
加油哦，朋友们！相信你们一定能在蛋白质 SDS-PAGE 凝胶电泳实验中找到属于自己的乐趣和成就感！。
SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE 测量蛋白分子量所需试剂及仪器：试剂：丙烯酰胺，双丙烯酰胺，Tris-base，TEMED，SDS，过硫酸铵，甘油，溴酚兰，甘氨酸，DTT，考马斯亮蓝R-250，甲醇，冰醋酸，蛋白Marker5只（50ul装），小牛血清白蛋白10mg。
仪器设备：电泳仪、槽、板5套；10ml小烧杯10只，微量移液器5把，普通移液器5套，足量滤纸，0.45μm滤器。
母液：1、2M Tris-HCL (pH8.8)100ml：24.2g Tris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH8.8，最后定容至100ml。
高压灭菌处理。
2、1M Tris-HCL (pH6.8)100ml：12.1g Tris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH6.8，最后定容至100ml。
高压灭菌处理。
3、10%SDS100ml：10gSDS，加入70ml蒸馏水在60℃搅拌溶解，待泡沫消失后，定容至100ml。
4、50%（w/v）甘油100ml：50ml甘油，50ml蒸馏水，混匀即可。
5、1%（w/v）溴酚兰10ml：100mg溴酚兰，蒸馏水定容至10ml。
6、0.01mol/L乙酸钠溶液100ml：0.139g乙酸钠溶于100ml蒸馏水中，调pH至5.2。
7、1M DTT20ml：20ml0.01mol/L乙酸钠溶液溶解3.09gDTT，过滤除菌后分装成1ml/份，-20℃保存。
工作液：1、30%聚丙酰胺母液（A液）实际需要250ml100ml：丙烯酰胺29g，双丙烯酰胺1g，去离子水在37℃溶解，定容到100ml。
0.45μm滤器过滤除菌，棕色瓶保存。
pH≤7.0。
2、4×分离胶缓冲液（B液）100ml： 75ml 2M Tris-HCL (pH8.8)4ml 10%SDS21ml蒸馏水4℃存放。
3、4×浓缩胶缓冲液（C液）100ml： 50ml 1M Tris-HCL (pH6.8)4ml 10%SDS46ml蒸馏水4℃存放。
(完整word版)SDS-PAGE电泳具体步骤
SDS电泳具体步骤一、清洗玻璃板1、洗洁精轻轻擦洗2、自来水冲3、蒸馏水冲4、筐里晾干5、梳子用水洗二、配胶材料：玻璃板、梳子、架子、枪（100-1000、20-200、2-20）、DDW、30%Arc-Bis、Tris(pH8.8)、Tris(pH6.8)、10%SDS、10%AP、TEMED。
1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧2、配分离胶3、加入玻璃板中4、加入乙醇1ml等待０.5小时5、用注射器吸出乙醇，6、用水冲洗分离胶3次，第4次最后(加入AP、TEMED前)再用注射器吸出7、配浓缩胶8、将玻璃板加满9、放入小梳子等待０.5小时三、上样材料：蛋白、marker、针筒、电泳槽、电泳液、枪（2-20ul）1、把玻璃板取下，放入小架子，固定于电泳槽（大玻璃板朝外），拔梳子，（若只有一块胶，对面用塑料板）2、将小架子加满电泳液，标记位置，用针筒抽电泳液通膜3、根据要求上样蛋白（如海马），最外侧加马克，用2-20ul枪四、电泳1、放入电泳盒中，盒中加少量电泳液，放上盖子2、开电泳机电压先60V，马克到达分离胶后调制110V，等待约2小时五、转膜材料：6张滤纸、1张PVDF膜（根据分离胶剪，无水甲醇中浸泡1min~2min）、转膜夹、转膜缓冲液1、取胶，将浓缩胶轻轻刮去，去掉多余的分离胶，2、将裁好的胶、浸过甲醇的PVDF膜和滤纸放入转膜缓冲液中，10min左右，3、黑色板在下面，纸—胶—膜—纸（注意赶走气泡）4、转膜夹放入电泳槽，放满转膜缓冲液，外面放冰块，加满水等待120分钟，电压100V六、免疫反应材料：丽春红、TBST、5%牛奶、一抗、二抗1、取出一小盒，加入少量丽春红，（用完回收）2、把膜取出，扔掉胶，依次放丽春红——TBST，（摇床上)3、膜剪成小条带，放入方格盒，放入TBST（摇床），几分钟后放入5%牛奶中封闭抗原（摇床）等待1小时4、配一抗：配5%的牛奶（5g牛奶，加TBST至100ml），将抗体放入牛奶中。
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一.实验目的学习SDS-聚丙烯跌胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。
二、实验原理蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。
当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pl)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点吋，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少.蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺礙胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。
本实验釆用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表現出不同的迁移率。
由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子董大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。
这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。
同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，釆用两种缓冲体系；上层胶pH二一，下层胶pH=; Tris—HCI缓冲液中的Tris 用于维持溶液的电中性及pH,是缓冲配对离子：Cl-是前导离子。
在时，缓冲液中的Gly为尾随离子，而在卩日=吋，Gly的解离度增加：这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。
不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。
由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子拜效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。
A B如果在聚丙烯酰胺;疑胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDS带有大董的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如疏基乙醇存在下，蛋白质分子內的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质一SDS复合物：此时，蛋白质分子上所带的负电荷董远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
SDS-PAGE
一. 实验原理
SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。
在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。
由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。
蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。
基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。
二. 试剂器材
30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；
注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。
分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；
电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；
2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中
0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL
10%SDS溶液 4.0mL
甘油 2.0mL
巯基乙醇 2.0mL
溴酚蓝 0.02g，
混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；
10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；
TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；
水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。
上层相即水饱和正丁醇，室温下可长期保存。
染色液(100mL)：称取考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入双蒸水40.0mL、甲醇50.0mL 和乙酸10.0mL，搅拌溶解后滤纸过滤除去不溶颗粒；
脱色液(1L)：分别取甲醇50mL和乙酸75mL，加双蒸水875mL稀释。
其他器材：
容量瓶(1L、100ml、10ml)、烧杯、离心管(15ml、1.5ml)、移液器、移液器吸头、干燥器、涡旋振荡器和废液缸等。
分离胶配方(100mL，4块胶)
贮液分离胶中丙烯酰胺的终浓度(%)
8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 凝胶贮液(mL) 26.67 30.00 33.33 36.67 40.00 43.33 46.67 50.00 53.33 56.67 60.00 分离胶缓冲液(mL) 25
双蒸水 (mL) 46.53 43.20 39.87 36.53 33.20 29.87 26.53 23.20 19.87 16.53 13.20 10%SDS (mL) 1.0
10%AP (mL) 0.75
TEMED (mL) 0.05 (抽气后添加)
堆积胶配方(40mL，4块胶)
堆积胶中丙烯酰胺的终浓度(%)
贮液
3.0
4.0
5.0
凝胶贮液(mL) 4.00 5.36 6.66
分离胶缓冲液(mL) 10.0
双蒸水(mL) 25.36 24.00 22.70
10%SDS(mL) 0.4
10%AP(mL) 0.2
TEMED(mL) 0.04 (抽气后添加)
三. 操作步骤
样品处理：
在密封的螺盖微量离心管中，用2×加样缓冲液按1:1稀释蛋白质样品溶液，于100℃煮沸3-5min，分子质量标准品也经上述处理。
凝胶制备：
将玻璃板用蒸馏水清洗干净，再用75%的酒精去脂，干燥后固定在灌胶支架上；
配制12%的分离胶，加入TEMED前抽真空10min以除去丙烯酰胺溶液中的空气；加入TEMED后轻轻振荡混匀，迅速注入安装好的玻璃板的间隙中，
给堆积胶留出约1cm的空间。
在丙烯酰胺溶液上覆盖一层水饱和的正丁醇，以防止空气扩散到凝胶中抑制聚合作用，并保证凝胶表面水平；在室温条件下，凝胶应在30min-50min内聚合完成。
凝胶聚合后凝胶和上层液相之间可见折射率的变化；
倒掉覆盖层并用蒸馏水清洗凝胶顶部数次，并用滤纸条吸净残留的蒸馏水，注意勿破坏凝胶表面；制备堆积胶并迅速注入分离胶上，立即插入干净的梳子，不要混入气泡，以一定的角度将梳子插入堆积胶能减少气泡的产生。
堆积胶聚合后小心移去梳子，避免破坏加样孔，用蒸馏水小心清洗加样孔，以除去未聚合的丙烯酰胺。
加样：
将凝胶固定在电泳装置上，电泳上槽内加入电泳缓冲液没过加样孔，并检查有无渗漏。
倾斜整个装置以赶走凝胶下面可能留有的气泡；按预定顺序加样，每孔加入20μL，在对照孔中加入分子质量标准品6-7 μL，如有空置的加样孔，加入等体积的1×加样缓冲液。
电泳：
将电泳装置与电源相连，正极接下槽、负极接上槽进行电泳，样品在堆积胶阶段电压为80V，而在分离胶阶段电压调整为120V。
直到溴酚蓝到达分离胶的底部后，关闭电源，断开电极。
从电泳装置上卸下玻璃板，用小铲子剥下凝胶后切除一角以标注凝胶方位。
染色：
将凝胶浸泡在染色液中，置于摇床上染色4hr，染色液可回收重复利用。
脱色：
染色结束后，将凝胶浸泡在脱色液中，置于摇床上脱色过夜，其间更换脱色液3次.
记录：
将显示蛋白条带的凝胶用凝胶成像仪拍照，记录试验结果，并根据分子质量标准品计算目标蛋白的分子量。
四. 注意事项：
SDS与蛋白质的结合按质量成比例，蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线，并且SDS-PAGE测定分子量有10%误差。
有些蛋白质由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(α-胰凝乳蛋白酶)组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。
因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。
有的蛋白质(电荷异常或结构异常的蛋白质、带有较大辅基的蛋白质)不能采用该法测相对分子量。
SDS-PAGE的有效分离范围。