SDS-PAGE电泳实验步骤
SDS-PAGE电泳实验步骤
SDS-PAGE电泳实验步骤垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋⽩质⼀、实验⽬的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋⽩质的分⼦量的原理和基本操作技术。
⼆、实验原理蛋⽩质是两性电解质，在⼀定的pH条件下解离⽽带电荷。
当溶液的pH⼤于蛋⽩质的等电点(pI)时，蛋⽩质本⾝带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH⼩于蛋⽩质的等电点时，蛋⽩质带正电，在电场中将向负极移动；蛋⽩质在特定电场中移动的速度取决于其本⾝所带的净电荷的多少、蛋⽩质颗粒的⼤⼩和分⼦形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶是由⼀定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合⽽成的三维⽹状孔结构。
本实验采⽤不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺⽤量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分⼦量的蛋⽩质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同⽽表现出不同的迁移率。
由于上层胶的孔径较⼤，不同⼤⼩的蛋⽩质分⼦在通过⼤孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进⼊⼩孔胶时，分⼦量⼤的蛋⽩质移动速度减慢，因⽽在两层凝胶的界⾯处，样品被压缩成很窄的区带。
这就是常说的浓缩效应和分⼦筛效应。
同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采⽤两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris⽤于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离⼦；CI-是前导离⼦。
在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离⼦，⽽在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离⼦的解离度，进⽽达到控制其有效迁移率之⽬的。
不同蛋⽩质具有不同的等电点，在进⼊分离胶后，各种蛋⽩质由于所带的静电荷不同，⽽有不同的迁移率。
由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分⼦筛效应及电荷效应，使不同的蛋⽩质在同⼀电场中达到有效的分离。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加⼊⼀定浓度的⼗⼆烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有⼤量的负电荷，且这种阴离⼦表⾯活性剂能使蛋⽩质变性，特别是在强还原剂如巯基⼄醇存在下，蛋⽩质分⼦内的⼆硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋⽩质分⼦与SDS充分结合，形成带负电性的蛋⽩质—SDS复合物；此时，蛋⽩质分⼦上所带的负电荷量远远超过蛋⽩质分⼦原有的电荷量，掩盖了不同蛋⽩质间所带电荷上的差异。
SDS-PAGE超详细实验步骤
SDS-PAGE超详细实验步骤1定义SDS-PAGE：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中SDS为十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate），PAGE为聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electropheresis）；该电泳用于分离蛋白质和寡核苷酸。
1.1试验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质的静电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
1.2试验相关设备与试剂配制1.2.1相关设备(1)电泳仪(2)凝胶成像仪(3)干浴器(4)微型离心机(5)电泳槽1.2.2试剂配制(1)染色液：用量筒分别量取250ml甲醇或乙醇、80ml乙酸；用电子天平称取考马斯亮蓝R250 1.25g，再将其一一加到1000ml蓝盖瓶中（加入顺序为考马斯亮蓝R250，甲醇或者乙醇，蒸馏水，乙酸），用纯化水补足至1000ml，充分混合均匀后进行用滤纸过滤，收集滤液备用。
（当过滤速度变慢时及时更换滤纸，快速过完，不可隔夜以免影响染色效果）(2)脱色液：用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸、670ml纯化水加入烧杯中，待溶液混合均匀后加入蓝盖瓶中。
(3)1X电泳缓冲液：分别用量筒量取10X电泳缓冲液100ml、900ml纯化水加入烧杯中，混合均匀既得。
（注：以上甲醇、乙醇、乙酸均用分析级试剂，纯度>95.0%）1.3电泳试验步骤1.3.1电泳胶配制（配方如表1）：表1分离胶浓度(10ml) 6%(ml) 8%(ml) 10%(ml) 12%(ml) 15%(ml) 去离子水 5.4 4.7 4.1 3.4 2.4 30%Acrylamide mix 2.0 2.7 3.3 4.0 5.04X Resolving-gel buffer 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 10%SDS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.110%APS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1TEMED 0.008 0.006 0.004 0.004 0.004 表2堆积胶(ml) (ml)去离子水 6.930%Acrylamide mix 1.78X Stacking-gel buffer 1.2510%SDS 0.110%APS 0.1TEMED 0.01按照表1配方将所需浓度的分离胶配置好（加入顺序由上到下），加入到电泳胶配胶板中（约3/4配胶版高度），加入5mm高的纯化水，等待30-60min使分离胶凝固（可微微倾斜看胶面是否凝固聚合）。
SDS-PAGE电泳实验流程
SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量实验原理SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。
⏹1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。
⏹2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
⏹3. 当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：1gMr =K―bmR式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。
在条件一定时，b和K均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。
未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
仪器、原料和试剂⏹仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。
⏹原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1样品溶解液配制。
可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。
⏹试剂：（1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。
（3）30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr）30g及N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃保存。
蛋白质sds-page凝胶电泳实验步骤
蛋白质sds-page凝胶电泳实验步骤嘿，朋友们！今天咱就来讲讲蛋白质 SDS-PAGE 凝胶电泳实验那些事儿。
首先呢，得准备好各种材料和试剂，这就好比要出门得先把鞋穿好一样重要。
什么电泳槽啦、玻璃板啦、丙烯酰胺溶液啦等等，一个都不能少。
然后就是配胶啦！这就像做菜，得把各种材料按照一定的比例调好。
先配分离胶，小心翼翼地把各种溶液倒在一起，搅拌均匀，可别搅出气泡来哟，不然就像蛋糕里有了疙瘩，可不好看啦。
接着让它静置一会儿，等它凝固得差不多了，再倒上浓缩胶，这浓缩胶就像是给蛋糕加上一层漂亮的奶油。
胶配好啦，接下来就是上样啦！把处理好的蛋白质样品加到孔里，就好像是给小格子里放上宝贝。
这时候可得细心点，别把样品洒出来啦。
接着就是电泳啦！通上电，让蛋白质在电场里欢快地奔跑起来。
它们就像一群小朋友在赛跑，跑得快慢不一样，最后就分开啦。
在这个过程中，可别闲着呀，要时刻盯着，就像看着自己的宝贝在比赛一样。
看看电泳液有没有变少呀，电泳的情况怎么样呀。
等电泳结束啦，就可以染色啦！把胶放到染色液里泡一泡，就像给它洗个彩色的澡。
等染上颜色了，就能清楚地看到蛋白质的条带啦。
哎呀，你说这蛋白质 SDS-PAGE 凝胶电泳实验是不是很有趣呀？就像一场小小的冒险，每一步都充满了惊喜和挑战。
虽然过程可能有点繁琐，但当你看到那清晰的条带时，就会觉得一切都值得啦！就好像辛苦种的花儿终于开了一样开心。
所以呀，别害怕，大胆地去尝试吧！只要按照步骤一步一步来，肯定能做出漂亮的结果。
就像学走路一样，一开始可能会跌跌撞撞，但只要坚持，总会走得稳稳当当的。
加油哦，朋友们！相信你们一定能在蛋白质 SDS-PAGE 凝胶电泳实验中找到属于自己的乐趣和成就感！。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
一、材料准备1M Tris-HCl, pH8.8、10% SDS、Ammonnium persulfate (过硫酸铵)和1M Tris-HCl, pH6.8室温保存。
30% Acr-Bis (29:1)和TEMED 4℃避光保存。
过硫酸铵配制成10%溶液后，分装成小管-20℃保存，通常半年内有效。
1.10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。
配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。
2.10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。
能产生自由氧基，使丙烯酰胺聚合。
配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于 1ml双蒸水中。
过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。
过硫酸铵配制成10%溶液后，应当-20℃保存。
同时应尽量减少室温存放时间，以防失效。
3.N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED）：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固，其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。
TEMED易挥发，使用后请盖紧瓶盖。
另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切，可通过适当调节TEMED的用量，控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。
配制方法：原液使用。
应使用电泳级TEMED。
4.30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液） :含有29的丙烯酰胺和1的甲叉基聚丙烯酰胺。
丙烯酰胺单体（Arc）在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺。
N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis），交联剂。
丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)实验原理和操作步骤实验原理：SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。
SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中.SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比.在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后,电荷因素可被忽略。
蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。
试剂和器材：试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml):0。
6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10％的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1％溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。
可在4℃保存数周,或在－20℃保存数月。
2。
凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0。
8g，加重蒸水溶解后,定容到100ml。
过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月.3。
pH8。
9分离胶缓冲液：Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8。
9，定容至100ml，4℃保存。
4。
pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml,加重蒸水80ml使其溶解，调pH6。
7，定容至100ml，4℃保存.5。
TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制）7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8。
3后，用蒸馏水定容至1000ml。
置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液:称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7。
5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml,搅拌1小时,小孔滤纸过滤。
器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。
实验操作（一）样品制备将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul)在一个Eppendorf 管中混合。
SDS-PAGE凝胶电泳操作
SDS-PAGE凝胶电泳操作一、常规试剂的配制1. 30% 聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺 150g，甲叉双丙烯酰胺4g，双蒸水500ml，滤纸过滤后，棕色瓶避光4℃保存；2.1.5mol/L，pH 8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：18.15g Tris，用1mol/L HCl定容至100ml，棕色瓶避光4℃保存；3. 1.0mol/L，pH 6.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：12g Tris，用1mol/L 调pH至100ml，棕色瓶避光4℃保存；4. 10% SDS溶液：10g SDS加水定容至100ml，完全溶解室温保存；5. 10% AP溶液：0.1g AP（过硫酸铵）加水定容至1ml，用前新鲜配制；6. 1×SDS-PAGE电泳缓冲液：25mM Tris（3.0285g/L），192mM甘氨酸（14.41g/L），0.1%SDS （1g/L），pH 8.30；7. 染色液：0.25g 考马斯亮蓝R-250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸，过滤除去杂质；8. 脱色液：45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；9. 固定液：50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；10. 2×SDS-PAGE上样缓冲液：10% SDS 0.4ml，0.375M Tris-HCl（pH 6.8）0.333ml，甘油0.2ml，1% 溴酚兰10μL，β-疏基乙醇100μL，加水定容至1ml，分装后-20℃保存。
二、样品的处理1. 蛋白含量较低的酶制剂或原料样品（1）粉剂（或颗粒）样品称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解1h（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一.实验目的学习SDS-聚丙烯跌胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。
二、实验原理蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。
当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pl)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点吋，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少.蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺礙胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。
本实验釆用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表現出不同的迁移率。
由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子董大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。
这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。
同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，釆用两种缓冲体系；上层胶pH二一，下层胶pH=; Tris—HCI缓冲液中的Tris 用于维持溶液的电中性及pH,是缓冲配对离子：Cl-是前导离子。
在时，缓冲液中的Gly为尾随离子，而在卩日=吋，Gly的解离度增加：这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。
不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。
由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子拜效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。
A B如果在聚丙烯酰胺;疑胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDS带有大董的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如疏基乙醇存在下，蛋白质分子內的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质一SDS复合物：此时，蛋白质分子上所带的负电荷董远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。
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垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质
一、实验目的
学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。
二、实验原理
蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。
当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。
本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。
由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。
这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。
同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。
在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。
不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。
由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。
蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。
蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是：
M r=K(10-b·m) logM r=LogK—b·R m，
式中 M r——蛋白质的分子量；
logK——截距；
b——斜率；
R m——相对迁移率。
实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量
的对数之间呈线性关系。
蛋白质的相对迁移率R m＝蛋白质样品的迁移距离／染料(溴酚蓝)迁移距离。
这样，在同一电场中进行电泳，把标准蛋白质的相对迁移率与相应的蛋白质分子量对数作图，由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子量。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、重复性好的优点，是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。
三、试剂及主要器材
1．主要试剂
1)标准蛋白混合液
内含：兔磷酸化酶B(Mw 97,400)，牛血清蛋白(Mw 66,200)，兔肌动蛋白(Mw 43,000)，牛磷酸酐酶(Mw 31,000)和鸡蛋清溶菌酶(Mw 14,400)
2)30％凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g,加双蒸水至100mL。
外包锡纸，4℃冰箱保存，30天内使用。
3)分离胶缓冲液(1.5mol／L): Tris 18.17g,加双蒸水溶解,6mol/L HCl调pH8.8,
定容100mL。
4℃冰箱保存
4)浓缩胶缓冲液(0.5mol／L): Tris 6.06g,加水溶解，6mol/L HCl调pH6.8，并
定容到100mL。
4℃冰箱保存
5)电极缓冲液(pH8.3)：SDS lg，Tris 3g，Gly 14.4g，加双蒸水溶解并定容到1000mL。
4℃冰箱保存。
6)10％SDS，室温保存
7)质量浓度10％过硫酸铵(新鲜配制)
8)上样缓冲液：0.5mol／L Tris-HCl pH6.8 1.25mL，甘油2mL，10％SDS 2mL，
β-巯基乙醇1mL，0.1％溴酚蓝0.5mL，加蒸馏水定溶至10mL。
9)0.25％考马斯亮蓝R-250染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入91ml50%甲醇，
9ml冰醋酸
10)脱色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸与875ml双蒸水混合
11)未知分子量的蛋白质样品(1mg／mL )
2．实验器材
1)DYCZ-24D垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂)
2)电泳仪
3)长滴管及微量加样器
4)烧杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、250m1)、培养皿(15cm l5cm)
5)注射器等
四、实验操作
1．装板
将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃立起来使底端接触桌面，用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内，然后插入斜插板到适中程度, 即可灌胶。
2．凝胶的聚合
分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置10％的分离胶和4.8％的浓缩胶。
按上表各液加入混匀后配制成分离胶后，将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓用滴管滴入，小心不要产生气泡。
将胶液加到距短玻璃板上沿2cm处为止,约5mL。
然后用细滴管或注射器仔细注入少量水,约0.5-1mL。
室温放置聚合30-40min。
待分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，按上表制备浓缩胶。
用长滴管小心加到分离胶的上面，插入样品模子(梳子)；待浓缩胶聚合后，小心拔出样品模子。
3．蛋白质样品的处理
若标准蛋白质或欲分离的蛋白质样品是固体，称取lmg的样品溶解于lmL 0.5mol ／L pH6.8Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中；若样品是液体，要测定蛋白质浓度，按1.0～1.5mg／mL溶液比例，取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀。
本实验所用样品为15～20μg的标准蛋白样品溶液，放置在0.5mL的离心管中，加入15—20μl的样品处理液。
在100℃水浴中处理2min，冷却至室温后备用。
吸取未知分子量的蛋白质样品20μl，按照标准蛋白的处理方法进行处理。
4．加样
SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法
用手夹住两块玻璃板,上提斜插板使其松开,然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶框,注意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力,再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽,插入斜板,将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上,外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处即可,注意避免在电泳槽内出现气泡。
加样时可用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内，以准确定位加样位置，或用微量注射器依次在各样品槽内加样，各加10～15μl(含蛋白质10～15μg)，稀溶液可加20～30μl (还要根据胶的厚度灵活掌握)。
5．电泳
加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电流控制在15～20mA，大约15～20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电流升到30～45mA，电泳过程保持电流稳定。
当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2cm处即停止电泳，约1-2小时。
如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。
6．染色、脱色
电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻
轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入
铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.25％的考马斯亮蓝染液，染色2～4h，必要时可过夜。
弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经
常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。
7．结果处理
1)测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离(即蛋白质带中心到加样孔
的距离)，测量指示染料迁移的距离。
2)按以下公式计算蛋白质样品的相对迁移率(Rm)
相对迁移率＝样品迁移距离(cm)／染料迁移距离(cm)
3)标准曲线的制作：以各标准蛋白质相对迁移率为横坐标，蛋白质分子量的对数为
纵坐标在半对数坐标纸上做图，得到一条标准曲线。
4)测定蛋白质样品的分子量：根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查
得该蛋白质的分子量。
五、思考题
1．聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳的几个不连续性是什么？
2．电泳时的三个物理效应是什么？是怎样造成的？
3．电泳后上下槽缓冲液可否混合后再使用？为什么？
4．上样缓冲液中加入甘油的作用是什么？
5．贮液配制及贮存应注意什么？
6．过硫酸铵、7%乙酸和考马斯亮蓝在实验中有什么作用？
附：不同分离胶的配制方法
分离胶的浓度20% 15% 12% 10% 7.5% 双蒸水/ml 0.75 2.35 3.35 4.05 4.85
1.5mol/L
Tris-Hcl(pH8.8)/ml 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 10%SDS/ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 凝胶储备液
（Acr/Bis）/ml 6.6 5.0 4.0 3.3 2.5 10%过硫酸铵/ul 50 50 50 50 50 TEMED/ul 5 5 5 5 5 总体积/ml 10 10 10 10 10。