蛋白质电泳的方法及显色方法
蛋白质电泳操作步骤
SDS-PAGE电泳操作步骤：试剂配制：（实验中采用均为分析纯）（1）丙烯酰胺贮液（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）丙烯酰胺贮液（T=30%，C=3%）称取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100 ml，过滤备用。
(试剂有毒，操作中注意防护)（2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）6.06 g Tris溶解于35 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水定容至50 ml。
（3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）18.16 g Tris溶解于75 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水定容至100 ml。
（4）10% SDS（5）10% 过硫酸铵（APS）：使用前新鲜配制，低浓度APS一般当天用当天配制，勿过夜使用。
（6）尿素（7）TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)（8）电极缓冲液(1×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.025 mol/L Tris，0.192 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（9）电极缓冲液(2×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.050 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（10）样品缓冲液（pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）1.6 ml浓缩胶缓冲液（pH 6.8）+ 4 ml 10% SDS + 0.6 g二硫苏糖醇(DTT) +2.5 ml 87%甘油+0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20 ml.（11）考玛斯亮蓝R-250染色方法：a．固定液20%三氯乙酸b．脱色液250 ml乙醇，80 ml冰醋酸，加水稀释至1000 ml。
c．染色液称取0.29 g考玛斯亮蓝R-250溶于250 ml上述脱色液中样品处理：处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20℃下。
(完整版)SDS-PAGE蛋白电泳方法
SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。
在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4:1。
由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。
蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。
基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。
二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。
分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至8.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至6.8，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L (自然pH值为8.3，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中0.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH6.8) 2.0mL10%SDS溶液 4.0mL甘油 2.0mL巯基乙醇 2.0mL溴酚蓝 0.02g，混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于10.0mL双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。
蛋白质电泳与操作
3. 分离；
1
4. 染色和脱色。
2
3
应用：用于分析蛋白质的分子量，常用于蛋白质 纯度鉴定和相对定量。
案例二：2-DE分析
• 2-DE简介：2-DE即双向凝胶电泳，是一种分离复杂 蛋白质混合物的方法。通过第一向等电聚焦和第二 向SDS-PAGE分离蛋白质，可展示蛋白质的等电点和 分子量。
案例二：2-DE分析
采用自动化技术，减少人为误差，提高电泳操作的重复性和可靠性。
04 蛋白质电泳实验注意事项
安全注意事项
1 2
避免使用未经灭菌的器具
在实验过程中，应确保所有使用的器具均经过严 格的灭菌处理，以防止微生物污染。
避免直接接触缓冲液
某些缓冲液可能含有刺激性或腐蚀性成分，应避 免直接接触皮肤或眼睛。
3
正确处理废弃物
03 蛋白质电泳技术优化
优化电泳条件
01
02
03
缓冲液选择
根据蛋白质的性质选择合 适的缓冲液，以提高电泳 分离效果。
电压与电流控制
优化电泳过程中的电压和 电流，以获得更好的分辨 率和分离效果。
电泳温度
选择适当的电泳温度，以 减少热量对蛋白质的干扰， 提高分辨率。
改进样品制备方法
样品溶解与变性
采用适当的溶解和变性方法，使蛋白质充分溶解并保持其天然构 象。
琼脂糖凝胶电泳
根据蛋白质分子的电荷和分子 量进行分离，常用于基因工程 和分子生物学研究。
等电聚焦电泳
根据蛋白质分子的等电点进行 分离，常用于蛋白质组学和生
物医学研究。
蛋白质电泳的应用
蛋白质组学研究
用于鉴定、分离和比较不同组织和细胞类型的蛋 白质，有助于深入了解生命活动的分子机制。
westernblot电泳原理及步骤
westernblot电泳原理及步骤一、概述西方印迹（w es te rnb l ot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。
它通过将待检蛋白质进行SD S-P AG E电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。
二、原理1.SD S-PA GE电泳分离-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。
-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（p ol ya cr yl am id eg e l）孔上。
-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。
2.转膜-准备转膜装置：将P V DF或N C膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。
-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。
-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。
3.免疫检测-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。
-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。
三、操作步骤1.准备样品-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。
-完全溶解样品，可加热至95°C处理。
2.SD S-PA GE电泳分离-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。
-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。
-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。
3.转膜-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。
-预处理转膜：将PVD F或N C膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。
蛋白质印迹显色方法
蛋白质印迹显色方法
蛋白质印迹显色方法，又称为Western blotting，是一种用于检测特定蛋白质在混合蛋白质样品中的存在和数量的方法。
其基本原理是将蛋白质样品在凝胶电泳中分离，然后将其转移至膜上，并通过与特异性抗体结合来检测目标蛋白质。
蛋白质印迹显色的具体步骤包括以下几个方面：
1. 凝胶电泳：将待检测的蛋白质样品通过凝胶电泳分离，这可以将蛋白质按照大小分开。
通常采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
2. 转膜：将分离后的蛋白质转移到硝酸纤维素或聚乙烯醇酸酯等半透膜上，这样可以将蛋白质分离出来的凝胶膜转移到膜上。
3. 阻断：在膜上阻止非特异性结合，通常采用牛血清白蛋白或者非脂类牛奶粉等阻断剂进行处理，这可以避免抗体非特异性结合。
4. 检测：将目标蛋白质进行检测，通常采用与目标蛋白质特异性的抗体进行结合，随后采用辅助抗体进行检测。
5. 显色：通过显色剂将目标蛋白质反应出来，一般采用酶标记剂如HRP和AP 等，通过产生化学反应使显色剂发色。
总的来说，蛋白质印迹显色方法是一种精确可靠的蛋白质检测方法，广泛应用于分子生物学、生物化学、免疫学等领域，可以用于检测蛋白质的相对分子量、表达水平、修饰状态等。
蛋白质双向电泳简介
胶条平衡
在第二向SDS-PAGE分离前,必须要平衡IEF 胶。主要目的是用含有SDS的第二向介质 置换含有尿素的第一向介质,使分离蛋白质 与SDS能完全结合,保持蛋白质的巯基呈还 原状态,避免发生重氧化,确保在SDS-PAGE 过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶 内处于其等电点处,净电荷为零,若未进行平 衡过程而直接进入第二向的SDS-PAGE分 离,蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝 胶中正常迁移。胶条平衡包括两个简短的 步骤,每步10~15 min。
复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完 成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
IPG胶条的pH范围
预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长
等电聚焦
胶条水合完成后,将开始运行等电聚焦。首先 在胶条两端接触电极处垫上水饱和的纸芯,以 防在高电压下胶条与电极的直接接触,损坏胶 条,同时可以吸附聚焦过程中迁移至两端的盐 离子。等电聚焦最好在高压电源下运行,在IPG 胶条的限制电流范围内迅速将电压升至最后的 目标电压。电压(V)与时间(h)的整合被称为伏 特小时(Vh),可以作为一个相同样品在不同运行 时间比较重现性的参数,也可以作为聚焦是否 充分的指标
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其 典型代表是尿素和硫尿。
表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后， 还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面 活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和 NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS 和SB3-10最好。
《中国药典》(2020版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）SDS-PAGE法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。
本法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
本法用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制以及定量测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂（1）水。
（2）分离胶缓冲液（4×，A液） 1.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调节pH值至8.8，加水稀释至100mL。
（3）30%丙烯酰胺溶液（B液）称取丙烯酰胺58.0g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺2.0g，加温水溶解并稀释至200mL，滤纸过滤（避光保存）。
（4）10%SDS溶液（C液）称取十二烷基硫酸钠10g,加水溶解并稀释至100mL。
（5）四甲基乙二胺溶液（TEMED，D液）商品化试剂。
（6）10%过硫酸铵溶液（E液）称取过硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100mL。
建议临用前配制，或分装于-20℃可贮存2周。
（7）浓缩胶缓冲液（4×，F液）0.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100mL。
（8）电极缓冲液（10×）称取三羟甲基氨基甲烷30g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至约800mL，用盐酸调节pH值至8.1~8.8之间，加水稀释至1000mL。
（9）非还原型供试品缓冲液（4×）称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、溴酚蓝20mg、十二烷基硫酸钠8.0g，量取甘油40m1，加水溶解并稀释至约80mL，用盐酸调节pH值至6.8，加水稀释至100mL。
蛋白质电泳方法
蛋白质电泳方法一、背景介绍蛋白质是生物体内最基本的分子，具有多种功能。
蛋白质电泳是一种用于分离和检测蛋白质的方法，广泛应用于生物化学、生物医学和分子生物学等领域。
二、实验准备1. 样品制备：将待测样品加入适量的样品缓冲液中，使得样品中蛋白质浓度适宜。
2. 电泳缓冲液制备：根据实验需要配制合适的电泳缓冲液。
3. 凝胶制备：选择合适的凝胶类型，如聚丙烯酰胺凝胶或聚丙烯酰胺-SDS凝胶，并按照厂家说明书进行制备。
4. 样品加荧光染料：将待测样品加入荧光染料中，使得样品能够在紫外线下显示出明显的荧光信号。
三、电泳条件设置1. 凝胶预处理：将准备好的凝胶放入电泳槽中，注入足够量的电泳缓冲液，使得凝胶完全浸没在缓冲液中，静置20-30分钟。
2. 样品加载：将样品加入凝胶孔中，注意不要过度加载。
3. 电泳条件设置：根据凝胶类型和样品特性，设置合适的电泳条件，如电压、电流、时间等。
四、电泳操作步骤1. 加载样品：将准备好的样品加入凝胶孔中。
2. 开始电泳：将电泳槽连接至电源，开启电源，开始进行电泳。
3. 停止电泳：根据设定的时间或者运行距离停止电泳。
4. 凝胶染色：将凝胶浸入染色液中，使得蛋白质能够被染色剂染色。
5. 洗涤与成像：将凝胶洗涤干净后，在紫外线下成像或使用荧光成像仪进行成像。
五、结果分析1. 凝胶图谱分析：观察凝胶图谱上出现的蛋白质带型和大小，并与标记蛋白质对照进行比较分析。
2. 蛋白质含量计算：根据标记蛋白质对照和样品带型大小进行计算，得出样品中蛋白质的含量。
3. 蛋白质鉴定：根据凝胶图谱上出现的蛋白质带型和大小，结合其他实验结果进行蛋白质鉴定。
六、注意事项1. 样品制备时应注意避免蛋白质的降解和污染。
2. 电泳缓冲液的配制应严格按照说明书进行，避免出现电泳条件不稳定等问题。
3. 凝胶制备时应注意凝胶浓度、孔径大小等参数的选择，以及凝胶的完全固化和无气泡等问题。
4. 染色剂的选择应根据实验需要进行选择，并严格按照说明书操作。
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一维蛋白质电泳方法——CTAB——CTAB 1: 一维蛋白质电泳方法——CTAB-PAGE
简介： 简介： SDS属于阴离子去垢剂，在低温下会结晶，某些情况 下还会使蛋白质聚集或沉淀，而其有些蛋白质在SDS凝 胶中不能很好的溶解或者出现异常的迁移现象。 而CTAB属于阳离子去垢剂，可以很好的避免上述问 题，如果样品没有经过煮沸和外加还原剂，一些经CTAB 电泳系统分离的蛋白质仍然保持其酶活性。
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2:染色方法 2:染色方法
通常用来与蛋白质非共价结合并使之显色的标记物大致分为几类： ）：有机燃料类 有机燃料类。 （1）：有机燃料类。如考马斯亮蓝，利用吸光度检测。 ）：荧光探针类 荧光探针类。 （2）：荧光探针类。如Sypro染料和尼罗河红，通过荧光检测。 ）：金属离子结合类 金属离子结合类。该类又可分为两类。 （3）：金属离子结合类 一类是通过与不同盐结合而显色（如使用锌-咪唑染料进行复染或反 响染色） 另一类是利用金属离子的还原反映而被检测到，如银染。
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2:染色方法 2:染色方法
（1）有机染料类： 有机染料类： 1: 传统考马斯亮蓝R250(Commassie Blue R-250, CBR-250)染色 CBR-250是一种有机染料，它通常能通过范德华力与NH3+的静电引力， 与蛋白质形成紧密而非共价结合的复合物。与精氨酸和赖氨酸残基结合紧 密，而与芳香族侧链亲和性稍低。 2：快速考马斯亮蓝染色 通过使用微波炉加速了CBR-250染色和脱色的过程，同时提高了灵敏 度。 3：InstaStain Blue凝胶纸染色 通过使用一种含有考马斯亮蓝染料的纸将染料加到凝胶上去，这样就 避免了操作液体染料时产生的问题，而且可以减少染色背景。
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一维蛋白质电泳的方法及显色方法
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一维蛋白质电泳的方法及显色方法
1: 一维蛋白质电泳方法的分类 SDS（1）: SDS-PAGE CTAB（2）: CTAB-PAGE 尿素连续PAGE （3）: 酸-尿素连续PAGE Tricine-SDS（4）: Tricine-SDS-PAGE （5）: Native PAGE 2：凝胶染色方法
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2:染色方法 2:染色方法
（3）金属离子结合类 银染：基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合的原 理，主要实验步骤：固定，敏化，银液注入，显色，终止反映和图像 固定。 GelCode磷蛋白染色 这种方法依赖于在钙离子存在时，用0.5mol/L氢氧化钠水解磷酸 化蛋白质磷酸酯的连接。然后用钼酸铵在稀释的硝酸溶液中处理含有 新生成的不可溶磷酸钙的凝胶，最后用甲基氯染所形成不可溶的硝基 -钼酸盐复合物，脱色之后，磷蛋白被染成绿色。
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一维蛋白质电泳方法—— ——酸 尿素连续PAGE 1: 一维蛋白质电泳方法——酸-尿素连续PAGE
简介： 简介： 非常适合研究同一蛋白的微小结构变体（有细微的 电荷差别）或修饰后的 形式（例如磷酸化，乙酰化 等）。而SDS-PAGE难以将大小相似而电荷不同的两种蛋 白分开。
简介： 简介： SDS 是一种阴离子表面活性剂.当 SDS 与蛋白质混 合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋 白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数 蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位), 而蛋白质结合固定比例之 SDS后,由于 SDS 带强负价, 使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白 质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的 泳动速率就只剩下分子大小一项因素。
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一维蛋白质电泳方法——Tricine-SDS——Tricine 1: 一维蛋白质电泳方法——Tricine-SDS-PAGE
简介： 简介： Tricine-SDS-PAGE Tricine-SDS-PAGE适用与肽类的电泳，用tricine代 替了甘氨酸可以分离小到500Da的肽类，适合SDS-PAGE 肽图谱以及制备氨基末端，羧基末端测序的样品。
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2:染色方法 2:染色方法
（2）荧光探针类 有机染料在水溶液中不发荧光，单在非极性溶液中或者SDS-蛋 白质复合物相连时,就会发处很强的荧光，通过荧光扫描仪检测。 1：SYPRO Ruby 荧光染色， SYPRO Ruby 是一种过度金属有机 复合物，直接通过静电作用与碱性氨基酸相互作用。 2：SYPRO Orange荧光染色。
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一维蛋白质电泳方法——Native——Native 1: 一维蛋白质电泳方法——Native-PAGE
（5）: Native PAGE ） 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入 SDS 和疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行 聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。 未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳 过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁 移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率， 尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物 活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上 进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于 活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所 有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。