第二章植物组织培养基本技术与设施
植物组织培养设备及条件
光照设备：提供植物生 长所需的光照
温度控制系统：控制培 养箱内的温度，保持恒
定
培养基制备设备：制备 培养基，包括培养基的
配制、灭菌等
灭菌设备
高压灭菌 锅：用于 培养基、 器皿、工 具等灭菌
紫外灯： 用于培养 室、操作 台等空间 灭菌
酒精灯： 用于培养 基、器皿、 工具等灭 菌
超净工作 台：用于 培养基、 器皿、工 具等灭菌
培养环境控制
温度：植物组织 培养的最佳温度 为25-30℃
光照：植物组织 培养的光照强度 为2000-3000勒 克斯
湿度：植物组织 培养的湿度为7080%
气体：植物组织 培养的气体成分 为氧气和二氧
恒温培养箱：提供稳定的温度条件，保证 植物组织的正常生长
显微镜：观察植物组织的生长和发育情 况，进行细胞学研究
培养设备
培养箱：提供稳定的温度、 湿度和光照条件
气体交换设备：提供植物 生长所需的氧气和二氧化
碳
湿度控制系统：控制培养 箱内的湿度，保持恒定
培养瓶：用于培养植物 组织，包括培养基、培
养液等
植物组织培养设备及条件
汇报人：
植物组织培养设备 植物组织培养条件
植物组织培养设备
实验室设备
培养箱：用于培养植物组织，提供适宜的 温度、湿度和光照条件
超净工作台：提供无菌环境，防止植物 组织受到污染和感染
光照培养箱：提供光照条件，促进植物 组织的生长和发育
离心机：用于分离植物组织中的细胞和 细胞器，提高培养效率
培养条件
温度：植物组织培养的温度一般在20-30℃之间，不同植物种类和培养阶段对温度的要求不同。
光照：植物组织培养的光照强度和光照时间对植物生长和分化有重要影响，一般采用人工光源 进行光照。
【安徽】中职农业生物技术(主编曹春英、丁雪珍第二版 高教版)教案：第二章 植物组织培养技术04
第三节植物组织培养操作技术（2）一、授课章节第三节植物组织培养操作技术（2）。
二、学时安排2学时。
三、教学目标1．掌握培养基的作用。
2．掌握培养基中生长调控物质的作用。
3．了解培养基的类型。
四、教学重点、难点分析重点：培养基的基本成分。
难点：培养基中生长调节物质的作用。
五、教具电化教学设备。
六、教学方法讲授法，演示法。
七、教学过程Ⅰ.导入培养基是进行植物组织培养的基质，进行植物组织培养必须掌握培养基的基本知识，今天我们就学习培养基的种类和基本成分。
II.新课三、培养基制备技术（一）配制培养基的目的配制培养基的目的是人为提供离体培养材料的营养源。
配制的不同培养基，是为满足不同类型植物材料对营养的不同需要。
没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一种合适的培养基，培养才有可能成功。
（二）培养基的种类1.培养基的种类划分2.常用培养基的配方和特点 目前已公开报道的基本培养基有许多种类，各有不同的特点和适用范围，在植物组织培养生产中应根据不同的植物种类和培养部位及不同的培养目的选用不同的培养基。
常用的培养基配方：表1 常用培养基配方只含有无机盐、蔗糖、维生素和水等最基本成分的合继代培养中促进培养物快速增殖的培养基，也称扩繁培养基。
培养基主要有水、无机盐、有机物、植物生长调节物质、培养基的支持材料五大类组成。
1.水水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。
它是生命活动过程中不可缺少的物质。
配制培养基母液时要用蒸馏水，以确保母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质，大规模生产时可用自来水。
但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。
2.无机元素(1)大量元素指浓度大于0.5 mmol／L的元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。
常由KN03、NH4NO3、KH2P04、NaH2P04、KCl、MgS04·7H20、CaCl2·2H20等化合物来提供。
第二章植物组织培养基本原理
第二节 植物的脱分化
一、愈伤组织的形成
1、形成条件： ① 外植体的细胞类型不同，形成的愈伤组织也常常异质。 ② 离体培养条件对于愈伤组织的诱导至关重要。两个因素起主要作
用：激素种类、浓度。此外，光照、基本培养基的选择、外植体 的不同生育期等条件也很重要。
诱导愈伤组织产生的主要激素有：生长素和细胞分裂素类。 生长素类主要有：2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）, NAA（α-萘乙酸），IBA（吲
第二章 植物组织培养的基本原理
第二章植物组织培养基本原理
第一节 细胞全能性与细胞分化 一、细胞全能性理论的提出与发展：
植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论。
1839年, Schwann提出有机体的每一个生活细胞在适宜的外部 环境条件下都有独立发育的潜能。
1901年, Morgan首次提出一个细胞应具有发育出一个完整植 株的能力。
第二章植物组织培养基本原理
分裂期
第二章植物组织培养基本原理
(3)分化期. 细胞体积大小稳定、细胞由平周分裂转为垂周分裂。 在分化末期，细胞的形态和结构上出现形态、功能不同的 区域。
第二章植物组织培养基本原理
5、 愈伤组织的生长过程的特点：
1）体积、重量： 2）生理生化特性：
诱导期、分裂期的细胞中RNA含量增加迅速、分化期含量 减少。 培养条件的改变影响了某些物质的合成。 继代培养时间的加长，愈伤组织可能出现“驯化现象”。 即在没有生长素的培养基上也能生长一段时间。
第二章植物组织培养基本原理
二、细胞分化：
分化： 植物体各个部分出现异质性的现象。 细胞分化
是导致细胞形成不同结构、引起功能改变或潜在的发育方 式改变的过程。 细胞分化 是基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果。 一个活细胞从植物体内分离出来，脱离开原有的环境，其被抑 制的功能将得以恢复，重新表现出全能性。
第2章植物组织培养的设备与培养条件
试管——特别适合于用少量培养基及试验各种不同配方 时选用，在茎尖培养及花药和单子叶植物分化长苗培 养时更显方便。有圆底的和平底的两种。 三角瓶——是植物组织培养中最常用的培养器皿，适合 于各种培养，固体或液体、大规模或小规模都行。 其优点是：采光好、瓶口较小不易失水和污染。 L形管和T形管——为专用的旋转式液体培养试管。 培养皿——适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培 养和无菌发芽。 角形培养瓶和圆形培养瓶——适于液体培养用。 果酱瓶或罐头瓶——常用于试管苗大量繁殖，200ml500ml规格 太空玻璃杯——可机械化洗瓶，适于工厂化生产
（3）磨口瓶 用于存装试剂、分装母液。 （4）滴瓶 盛装酸液（1N盐酸和1N氢氧化钠） （5）锅具：配置和熬制培养基
2.2.1.3计量容器 （1）容量瓶：培养基配置时定容 （2）移液管和移液枪 （3）量筒、量杯
2.2.2器械用具 组织培养所需要的器械用具，可选 用医疗器械和微生物实验所用的 器具。常用的器械用具如图： （1）镊子：可用于接种和转移植 物材料 （2）剪刀：一般在转移植株时用。 （3）解剖刀： （4）显微接种工具：包括接种针、 接种钩及接种铲，用来接种花药 或转移植物组织。
（1）功能：植物材料的灭菌、接种以及培养 物的继代转接等。 （2）仪器设备及用品： 超净工作台，紫外灯、小推车、搁架、接种 工具（各种镊子、解剖刀、手术剪、普通 剪刀接种针、酒精灯、手持喷雾器、细菌 过滤器等），紫外灯，换气扇，空调。
超净工作台
接种工具
无菌操作室消毒的方法： 照射灭菌： 紫外灯， 15—20分钟（接种前） 熏蒸灭菌 ：甲醛加高锰酸钾（定期）（一般 每立方米用甲醛2mL、高锰酸钾1g。 ） 超净工作台的消毒方法： 每次接种前，用70%酒精药棉擦拭台面。
第二章——植物组织培养实验室
D、金属用品洗涤
金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤（新的可以用热洗衣粉水 洗净），需要清洗时，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。
E、除菌过滤器
除菌过滤器用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后 用蒸馏水冲洗，晾干备用
（二）灭菌技术
1.灭菌工作是极其重要的。
首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴： 有菌：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物的表面、 超净工作台的台面，未处理的工具和手等。 无菌：高压高温处理（工具、器皿、培养基等）如：火烤后的物体；
（二）药品贮存和配制仪器设备
1.冰箱 • 作用：低温保存材料，存放药品、
培养基母液、激素、酶制剂。
2.天平
• 陈列于制备室中 • 作用：称取大量元素、微量元素、
酶制剂
3.酸度计
• 陈列于制备室中 • 作用：测定培养基及酶制剂的pH值
PHS-802中文台式酸度计
通用型或经济型酸度计
（三）观察分析仪器设备
5.摇床和旋转床
• 进行液体培养时用以改善气体状况
小型臭氧发生器
不锈钢蒸馏水器（单蒸水）
三、玻璃器皿及用具
（一）玻璃器皿 1.培养器皿 培养用的：试管、三角瓶、培养皿等 2.分注器 类型：注射器式分注器、漏斗式分注器、
量筒漏斗式分注器 3.其他玻璃仪器 烧杯、量筒、移液管、容量瓶、试剂瓶等
第二章 植物组织培养基本技术
5.天然有机附加物：如椰汁、香蕉汁、马铃 薯汁、酵母提取液等。
（四）植物生长调节剂： 1、生长素类： （1）组培中的作用： ①促进细胞伸长； ②促进生根； ③诱导愈伤组织的形成； ④2,4-D会诱导某些植物不定胚的形成。
（2）常用的生长素：吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸 （IBA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸 （2,4-D）
2、微量元素：指小于0.5mmol／L的元素，包括
Fe，B，Mn，Cu，Zn，Mo，Co等。
Fe：常用FeSO4·7H20，因其在pH值5.2以上，易形 成Fe(OH)3的不溶性沉淀，通常FeSO4·7H20 和 Na2—EDTA结合成络合物使用。
B：H3BO3 Mn，Cu，Zn：常用其硫酸盐；
Mo：Na2MoO4 Co: CoCl2
含量较高 （2）适用范围：广泛地用于植物的器官、花
药、细胞和原生质体培养
2.White培养基：其特点是无机机盐数量较低，适用
于生根培养，胚胎培养及一般的组织培养也可以
用，应用较广泛。
3.B5培养基：其主要特点是含有较低的铵，较高的 硝酸盐和VB1，铵对植物的生长有抑制作用。木本 植物尤其适宜在B5培养基上生长。
褐的作用。
3.氨基酸：
培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸， 其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬 氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有时 应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，用量在101000mg／L之间。
4.肌醇：使用浓度一般为50~l00mg／L，适 当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及 胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、 分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作 用。
第二章 植物组织培养的 基本技术
第一节 培养基及其配制
植物组织培养技术
植物组织培养技术第一章绪论第二章植物组织培养实验室组成、仪器设备及无菌操作技术第三章植物组织培养基本原理第四章器官培养技术第五章植物胚胎培养第六章花粉及花药培养第七章细胞及原生质体培养第八章组培培养技术在中药学上的应用第一章绪论一、植物组织培养的概念1. 概念植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。
2.主要特征（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。
（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。
二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。
1、根据培养材料不同分为：（1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。
（2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。
（3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。
（4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。
（5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。
（6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。
2、根据再生途径分为：（1）器官发生途径（Organogenesis）：直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。
如茎尖培养。
间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形成新的组织和器官的过程。
第二章植物组织培养基本操作
第⼆章植物组织培养基本操作教学⽬的：了解植物组织培养培养的培养基种类、成分及其特点，学习植物组织培养基本操作，了解离体培养环境条件，以及炼苗移栽基本⽅法。
职业技能教学点：具有植物组织培养基本操作程序的认知。
能够识别各类培养基特点，熟悉MS培养基成分；具有制作培养基能⼒，具有选择外植体、表⾯灭菌、⽆菌接种等基本能⼒；具有植物组织培养条件控制基本能⼒；有进⾏组培苗驯化练苗的基本能⼒。
教学时间：10学时教学重点：各类培养基特点，固体培养基制作，外植体的选择及表⾯灭菌，外植体培养条件，组培苗驯化原则及常规移栽⽅法。
教学难点：各类培养基特点，培养基制作及⾼压灭菌操作，外植体的表⾯灭菌，外植体培养中易出现的问题及其解决办法，试管苗的特点。
教学内容：第⼀节培养基成分、种类及特点植物⽣长必需16种基本元素：N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl、C、H、O。
离体培养条件下，各种元素主要从培养基中获得：H 和O来源于⽔，C来源于添加的糖类，其它矿质元素来源于组成培养基的⽆机盐。
培养基是根据植物⽣长所需营养成分，配制成的供植物⽣长的⼈⼯制作的营养物质。
⼀、培养基的成分不同植物组织器官所需要的营养条件不完全⼀样，培养基营养成分也有差异，但总的来说，培养基⼀般包括⽆机盐、有机化合物和⽣长调节剂三⼤基本组成成分。
1、⽆机盐类离体组织⽣长发育的基本成分，根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两类：⼤量元素—植物所需元素的使⽤量⼀般在每升⼏⼗-⼏千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
微量元素—植物所需元素的浓度⼩于10-5～10-7mol/L，Fe、Cu、Zn、Mn、Mo、B、Cl。
除C、H、O外，其它矿质元素通常以⼀定浓度的⽆机化合物形式，按⼀定⽐例配制⽽成，溶于⽔中以离⼦态被吸收，N有硝态氮KNO3和铵态氮（NH4）2SO4两类提供。
2、有机化合物培养基中只有⽆机盐叫做基本培养基，为使培养物更好的⽣长，还需添加有机成分，常⽤有糖类、维⽣素、醇类、嘌呤、氨基酸等。
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4%～10%的次氯酸钠溶液浸泡8～10min，经无菌水冲洗后，即可
取出接种。
第二章植物组织培养基本技术与设 施
3、花药的消毒
➢70 ％ 酒 精 擦 洗 花 蕾 ， 或 浸 泡 数秒钟 ➢饱 和 漂 白 粉 上 清 液 ： 浸 泡 10 分钟；或次氯酸钠液2％～5％： 8～10分钟 ➢无 菌 水 冲 洗 几 次 后 ， 吸 去 水 分，剥取花药或胚珠接种。
➢ 光照强度：1000—3000lx，白色荧光灯，光的作用是满足
形态建成的需要（诱导）
➢ 相对湿度：培养室的相对湿度一般不控制。根据需要适当调
整培养间湿度
第二章植物组织培养基本技术与设 施
2、定期检查和细胞学观察
➢接种后3～胞学观察：一般每隔3～5天观察一次。及时 记录。 ➢观察方法根据培养方式灵活掌握：
三、外植体的接种和培养
（一）无菌操作 （二）外植体的培养
第二章植物组织培养基本技术与设 施
（一）无菌操作
➢植物组织培养的接种：把经过表面消毒后的植物材料切碎或分 离出器官、组织细胞，并把它们转放到无菌培养基上的全部操作 过程，是一种无菌技术。
➢在操作过程中引起的污染来源：主要是由材料本身带菌和工作 人员本身引起的。
第二章植物组织培养基本技术与设 施
（三）几种外植体的灭菌方法
1、茎尖、茎段及叶片等的消毒
➢消毒前要经自来水较长时间的冲洗。
➢消毒时要用70%的酒精浸泡数秒，无菌水冲洗2～3次，然后用2%～
10%的次氯酸钠溶液浸泡10～25min，若材料有茸毛最好在消毒液中
加入几滴吐温-80，或者用0.1％～0.2％升汞浸泡消毒5～10分钟消毒
➢入无菌室前，要洗手。l%新洁尔灭溶液内5分钟
➢入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。
➢操作前要用70%酒精擦洗手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准
讲话，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把
工具在火焰上消毒。
➢必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖
前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖
第二章植物组织培养基本技术与设 施
1、接种室的消毒
➢污 染 的 主 要 来 源 是 空 气 中的细菌和真菌孢子
➢每次接种前半小时 ➢地面：用70％酒精喷 雾使空气的灰尘沉降。 ➢紫外线灯照射20分钟。
➢工 作 台 面 要 用 新 洁 尔 灭 或酒精擦洗。
第二章植物组织培养基本技术与设 施
2、工作人员要求
2．将植物组织块置于一个有丝盖的玻璃瓶中，注入75%的酒 精溶液埋没材料，浸泡10S左右。倒出酒精，用无菌水冲洗一次。
3. 将适当浓度的消毒液(0.1%升汞或2%次氯酸钠)(含有几滴活 化剂Tween20或Tween 80)，使材料完全浸没在消毒液中，盖 上盖，把玻璃瓶置入超净工作台灭菌一定时间。在灭菌期间须 把玻璃瓶摇动2～3次。 4．消毒处理后，将瓶盖打开，将消毒液倒出，注入适量的无 菌蒸馏水，再盖上盖，摇动数次，将水倒掉，重复3～4次。
5~30 5~30 5~30 2~10 5~15 2~10 0.2~2 30~60 5~30
自:曹孜义
很好 很好 很好 很好 好 最好 好 较好 好
（二） 外植体灭菌的一般步骤
1．预处理，先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，将 准备使用的植物材料在流水中冲洗干净。经过预处理的植物材 料，其表面仍有很多细菌和真菌。
第二章植物组织培养基本技术与设 施
4、根及地下部器官的消毒
➢预先用自来水洗涤，再用软毛刷刷洗，且用刀切去损伤及污 染严重部位，吸水纸吸干后，再用酒精漂洗。 ➢可采用0.1%～0.2%升汞浸5～10min或2%次氯酸钠溶液浸 10～15min，然后以无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干后可接 种。
第二章植物组织培养基本技术与设 施
上。
第二章植物组织培养基本技术与设 施
3、材料的切取
➢ 切取和接种较大的材料肉眼观 察即可操作分离，较小的材料需 在双筒解剖镜下操作。
➢分 离 工 具 一 定 要 放 好 ， 切 割 动 作要快，防止挤压使材料损伤而 失败。
➢ 接种时要防止交叉污染的发生
第二章植物组织培养基本技术与设 施
4、 接种的具体操作
第一节 植物组织培养的操作方法概述
一、外植体的选择 二、外植体的灭菌 三、外植体的接种和培养 四、外植体的成苗途径 五、污染的原因及其预防措施 六、外植体的褐变及其防止措施 七、培养物的玻璃化现象及其防止措施 八、试管苗的驯化与移栽
第二章植物组织培养基本技术与设 施
一、 外植体的选择
☺ 外植体（Explants）：指植物离体培养的各种接种材
酒精擦拭手
浸泡5min
外植体消毒
酒精灯灼烧
器 械 消 毒
第二章植物组织培养基本技术与设 施
旋转灼烧
取外植体
接第种二章植物组织培养基本技术与设
施
盖好瓶塞
（二）外植体培养
1、培养条件：
➢ 温度：常保持在23±2℃，夜温低1—2℃
➢ 光照时数：大多数情况下为16h（暗培养不需要光照，例如 起始培养的前几天不需要光照）
料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体。
☺ 外植体的选择依据
☺ 优良的种质 ☺ 健壮的植株 ☺ 大小适宜的外植体 ☺ 适宜的发育时期 ☺ 适宜的部位 ☺ 适宜生理状态和发育年龄的器官 ☺ 细胞培养材料的选择
第二章植物组织培养基本技术与设 施
二、外植体的灭菌
（一）常用灭菌剂的使用及其效果 （二） 外植体灭菌的一般步骤 （三）各种外植体的灭菌方法
第二章植物组织培养基本技术与设 施
（一）常用消毒剂
消毒剂 使用浓度（％） 去除的难易 消毒时间（分） 效果
次氯酸钙 次氯酸钠 漂白粉
溴水 过氧化氢
升汞 酒精 抗菌素 硝酸银
9～10
2 饱和溶液
1～2 10～12 0.1～1 70～75 4～5（mg/L）
1
易 易 易 易 最易 较难 易 中 较难
第二章植物组织培养基本技术与设 施
后，用无菌水冲洗3次后方可接种。
2、果实及种子的消毒
➢用自来水冲洗10～20分钟或更长，用纯酒精迅速漂洗一下。
➢果实用2%次氯酸钠溶液浸 10min后，用无菌水冲洗2～3次。
➢种子要先用10%次氯酸钠浸泡 20～30min甚至几小时。对难以
消毒的还可用0.l%升汞或1%～2%溴水消毒5min。
➢胚或胚乳培养时，对种皮太硬的种子 ，可先去掉种皮 ，再用