RD细胞复苏、传代、冻存
细胞的传代冻存复苏
贴壁生长细胞传代方法：
1. 吸光培养瓶中的培养液 2.加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准） 静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 5. 吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 6. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 7. 将后者放入培养箱中培养。
初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。 如细胞系的生存期有限 ，则称之为有限细胞系 （ Finite Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞 系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选 的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。
2.台盼蓝法
活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占 细胞中的百分比表示细胞恬力
已淘汰
3. 四唑盐（MTT）比色法
四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝， 四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干 水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这 种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物， 溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值
向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于 某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使 同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。
无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。
目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清
细胞培养基础知识详解-细胞的复苏、传代和冻存
细胞培养基础知识详解细胞的复苏、传代和冻存实验操作指导整理：江耀伦李美娣1 细胞复苏细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
1.1实验前准备（1）将水浴锅预热至37℃（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的生物安全柜内部台面。
（3）在生物安全柜中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
1.2 细胞复苏培养（1）根据细胞冻存记录取出需要复苏的细胞。
（2）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
（3）约1-2 min后冻存管内液体完全溶解，取出放入离心机中以1000 rpm/min速度离心3~5 min。
（4）用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入生物安全柜内。
吸弃上清液，向离心管内加入1 mL培养液，吹打制成细胞悬液。
（5）将细胞悬液分装入培养瓶或者培养皿内，将培养瓶/培养皿放入37℃，5％ CO2的培养箱内过夜后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。
1.3 初学者易犯错误（1）水浴锅未预热或者未预热到37℃。
（2）水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
（3）离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
（4）一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。
1.4 细胞传代1.4.1 传代前准备（1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
（2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的生物安全柜内台面和双手。
（3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
1.4.2 细胞传代（1）取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入生物安全柜内。
（2）从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
细胞培养传代及冻存操作规程
细胞培养传代及冻存操作规程细胞培养、传代及冻存操作规程⼀、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊⼦、温⽔（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%⾎清、双抗、1.5ml 离⼼管。
2、操作步骤①取相应体积的培养基放⼊到培养板中并加⼊双抗，放⼊CO2培养箱中预热，然后取适量的冷⽔加⼊到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开⽔边⽤温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升⾄39℃为⽌（为防⽌在移动过程中温度降低可把温度调⾼1——2℃。
②⽤镊⼦将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放⼊提前准备好的温⽔中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后⽤移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液⼀起吸出放到1.5ml离⼼管中，5000rpm/min 离⼼2min，尽量的除掉上清，然后在加⼊500µl培养基反复吹打待混合均匀后放⼊到事先准备好的培养板中并注明名称、⽇期及操作⼈。
⼆、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加⼊相应体积的培养基之后放⼊培养箱中预热，添加培养基的⽅法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，⽤DPBS清洗两遍，在加⼊相应体积的0.25％胰蛋⽩酶，使板底细胞都浸⼊溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。
添加胰蛋⽩酶的体积如下表所⽰③消化时间完成后应⽴即终⽌消化，⼀是直接加⼊培养基，⼆是吸除胰蛋⽩酶之后在加培养基，加⼊培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停⽌吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放⼊培养箱24⼩时后换液。
2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的⽣长状态，以便于下⼀步实验的顺利进⾏。
其中有两点很重要，第⼀消化的时间，消化的时间并不是⼀成不变的，要根据细胞的状态随时终⽌消化，上⾯②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第⼆吹打的⼒度跟全⾯性，吹打的⼒度⼀定要适中，不能太⽤⼒避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边⾓的，那⾥会有很多细胞残留，需要提醒的是⼀定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可⽤枪头将其刮下在吹打。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏细胞培养是指将生物体内分离出的细胞种植在培养基中，供其生长和繁殖的实验过程。
细胞培养已成为生命科学和医学研究中不可或缺的基础工具。
在细胞培养中，常见的术语有原代培养、传代培养、冻存和复苏。
原代培养原代培养是将从组织中分离出的细胞直接进行培养，即首次培养。
通常将组织切割成小段或分散成单细胞悬液，加入培养基中，使其中的细胞粘附在培养基表面上生长。
原代培养中所得细胞经常受到组织来源、细胞类型和培养条件等因素的影响，因此可能表现出较高的细胞异质性。
传代培养传代培养是将进行了原代培养的细胞进行维持和扩增的过程。
在细胞生长到足够数量时，将细胞分散到更大容量的培养器中，以继续扩增细胞数量。
传代培养次数过多时可能导致细胞老化并失去功能。
在细胞传代培养过程中，注意以下几点：•选择合适的培养基和培养条件；•周期性检测细胞的形态、生长状态和细胞数目；•保持细胞复合度和细胞同型性。
冻存为了保存细胞株，通常会将细胞用特殊培养基和添加剂冻存。
冻存过程中，细胞首先保护在保护剂中，然后在液氮的温度下迅速冷冻，以避免细胞深受冰晶形成的伤害。
冻存后的细胞可保存数年，并可进行后续的实验研究。
## 复苏冻存后，需要将细胞复苏。
推荐以下步骤：•用生长培养基预热，将细胞移植到生长培养基中，尽量使样品在细胞数目、时间和温度上保持一致；•在细胞培养箱中培养，控制CO2浓度（通常为5％）和口袋气体混合在空气中的湿度；•更换完整的生长培养基，加入所需的辅助剂，如血清或其它所需的生长因子。
如上所述，细胞培养是生物学和医学研究中不可或缺的基础工具。
正确地进行细胞培养和细胞处理很重要，因为不同的操作条件将影响最终培养出的细胞的数量和质量。
在实验中进行细胞培养和处理时，应该遵守正式的安全和操作规程。
体细胞培养标准
体细胞培养标准
体细胞培养标准操作主要包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存等步骤。
一、细胞复苏
1.从冻存管中取出细胞，放入37℃水浴中迅速解冻。
2.将解冻后的细胞悬液转移至培养瓶中，用PBS清洗两次，以去除残留的冻存液。
3.加入适量新鲜培养基，将细胞悬液浓度调整至适当水平。
4.将培养瓶放入37℃、5% CO₂的恒温培养箱中，进行细胞培养。
二、细胞传代
1.当细胞融合率达到80%时，用胰酶或胶原酶消化细胞，分散成单个细胞。
2.将消化后的细胞悬液转移至新的培养瓶中，加入适量新鲜培养基，将细胞悬液浓度调整至适当水平。
3.将培养瓶放入37℃、5% CO₂的恒温培养箱中，继续进行细胞培养。
三、细胞冻存
1.将细胞沉淀至离心管中，用PBS清洗两次，去除残留的培养基。
2.加入冻存液（10% DMSO +90%胎牛血清），轻轻混匀。
3.将离心管放入-80℃的冰箱中，进行慢速冻存。
4.当细胞悬液完全冻实后，将其转移至液氮中，长期保存。
四、体细胞培养的特点
1.严格的无菌操作：为避免细胞污染，需在无菌环境下进行细胞培养。
2.适宜的培养条件：细胞生长需要适宜的温度（37℃）、湿度（5% CO₂）
和营养环境（培养基）。
3.细胞数量控制：细胞传代前融合率应达到80%，冻存时每管细胞量应达到规定数量。
4.质量控制：监测细胞数量、活率、表面标记、支原体和内毒素等指标，以确保实验结果的准确性和可靠性。
5.应用广泛：体细胞培养技术在生物学、医学、生物工程等领域具有广泛的应用价值，可用于研究细胞生长、分化、信号传导等生物学过程。
细胞培养基本方法复苏、换液、传代、冻存课件 (一)
细胞培养基本方法复苏、换液、传代、冻存课件 (一)近年来，细胞培养技术在生物研究中得到了广泛的应用，但在应用的过程中，经常遇到细胞复苏、换液、传代、冻存等问题。
本文将对这些问题进行讲解。
一、细胞复苏细胞冻存是广泛应用的细胞存储方法。
由于在冻存过程中会损伤细胞，因此冻存后的细胞需要进行复苏才能够继续进行培养。
复苏的方法如下：1、取出细胞管，将管子快速放入37℃的预热水中，快速震动5秒钟，过度加热有危险，只需使水恒温为37℃即可。
2、马上将管子离水中，管口向外，用无菌的吸管粗略地抽取培养液，然后再将吸管插入细胞培养管管口，尽量避免空气进入细胞培养管。
3、使细胞含量达到有效水平（此种方法需配合不同种类细胞需要的培养基和生长条件）二、换液为了保证细胞的健康和正常生长，需要周期性地进行培养液的更换。
换液的方法如下：1、用无菌吸管将旧培养液吸出。
2、向细胞培养管中加入新的培养液。
3、培养之前搅拌均匀。
4、用生物安全柜消毒吸管和细胞培养箱户口。
三、传代传代的目的是使细胞继续生长和培养，同时避免暴增和变异。
传代的方法如下：1、用1:2、1:3、1:4等系数调节种子层数。
每次移植液可以不变，也可以加1倍因子。
2、对于一些细胞，如病毒感染易变异和新生成的细胞支原体感染易暴增、细胞周期等，直接移植的效果更佳。
3、传代前，检查培养基是否清晰，底物和细胞是否良好。
4、传代时需要更换新的培养基。
四、冻存为了保存优质的细胞株和把样本留在未来的使用中，冻存是非常重要的。
冻存的方法如下：1、将细胞悬液和10%含有环甲基丙环戊酮（DMSO）的培养基混合（1:1）。
2、转移冷冻管至冰缸中，迅速将前端放入-80°C的冰柜中小心，冷却30-60分钟后，将其转移到液氮罐中。
3、在恒温下用不同培养基和DMSO的比例来冻存不同种类的细胞，确保细胞存活和培养后表型的一致性。
总之，对于细胞培养技术中的基本方法，我们需要认真学习和实践。
只有熟练掌握这些基本技能，才能够更好地发挥细胞培养技术的应用价值。
细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项细胞传代：细胞传代是指将已经培养得到的细胞进行继代，以维持细胞的健康生长和增殖。
具体步骤如下：1.预备培养基和消化液：准备需要的培养基和细胞消化液，将培养基预暖在37摄氏度保温箱中。
2.消化细胞：将已经生长到80-90%的细胞培养皿放到细胞消化液中消化，消化时间根据细胞的种类和生长状态而定。
消化完成后，在显微镜下观察，确保细胞基本脱落。
3.细胞计数与离心：将细胞消化液转移到离心管，进行细胞计数。
根据所需细胞数量计算所需消化液的体积，并用预暖的培养基配置所需的细胞悬液。
离心细胞消化液以去除细胞消化的消化液。
4.铺板：将计算好的细胞悬液转移到铺板中，轻轻摇晃铺板使细胞均匀分布。
放置在培养箱中，培养条件根据细胞类型而定。
注意事项：-消化时间不宜过长，否则细胞会受到过度损伤。
-细胞计数时要使用显微镜和相关计数仪器，确保准确性。
-铺板时要轻轻摇晃铺板以均匀分布细胞，避免气泡产生。
冻存：冻存是将细胞保存在低温条件下，以备日后使用。
具体步骤如下：1.细胞准备：选择处于对称生长期的细胞进行冻存。
对细胞进行消化并离心，将细胞沉淀取出至干燥的离心管。
2.冻存液准备：根据细胞的特性和保存要求选择合适的冻存液，如含有二甲基亚砜（DMSO）和甘油的培养基。
将冻存液预暖。
3.冻存管装填：将已洗净的冻存管放入液氮中预冷，稍微干燥后将细胞沉淀均匀加入冻存管中。
用塑料冻存盖或冷却后的金属冻存夹紧。
4.冷冻：将装有细胞的冻存管放入-80摄氏度的深冷冰箱中，预冻24小时到48小时。
等冷冻固化后将管子迁移到液氮冷冻罐中。
注意事项：-使用合适的冻存液，避免对细胞造成过度伤害。
-在严格消毒和无菌条件下进行冻存操作。
-细胞冷冻时，必须迅速并且均匀降温，以避免冷冻诱导的细胞损伤。
复苏：复苏是指冻存的细胞被解冻、恢复生长和增殖的过程。
具体步骤如下：1.细胞解冻：将冻存的细胞管迅速取出，直接放入37摄氏度的水浴中，轻轻摇动直至融化。
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RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞培养操作
1）复苏细胞：将含有1mL 细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL 培养基混合均匀。
在1000RPM 条件下离心4 分钟，弃去上清液，加1-2mL 培养基后吹匀。
然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm 皿中，加入约8ml 培养基，培养过夜）。
第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS 润洗细胞1-2 次。
2. 加1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM 条件下离心4 min，弃去上清液，补加1-2mL 培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按1：2 比例分到新的含8ml 培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25 瓶为类；
1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入1ml 胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。
加1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml 细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，2h以后转入液氮灌储存。
记录冻存管位置以便下次拿取。