活性氧纯化定位
dcfh-da活性氧检测原理
dcfh-da活性氧检测原理活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是指一类具有高度活跃的氧原子或氧化剂，主要包括超氧阴离子（O2•-）、氢过氧化物（HO2•）、过氧化氢（H2O2）、单线态氧（1O2）、羟基自由基（•OH）等物质。
在正常生理状态下，适量的活性氧能够参与细胞信号传导、炎症应答、免疫调节等重要生物学过程。
然而，当活性氧的生成和清除失衡时，会导致细胞内的氧化应激，引发细胞内氧化性损伤，从而诱发多种疾病，如心血管疾病、神经系统疾病和肿瘤等。
活性氧的检测技术主要分为直接检测法和间接检测法。
直接检测法主要通过对活性氧的特定物理或化学性质进行测定，如电子顺磁共振（EPR）、荧光探针和化学发光等。
间接检测法则是通过测定活性氧对其他物质的氧化反应来间接评价活性氧的水平，如酶活性测定法和抗氧化剂测定法等。
本文将主要介绍直接检测法中常用的电子顺磁共振法（EPR）和荧光探针法。
一、电子顺磁共振法（EPR）：电子顺磁共振法利用电子磁共振技术来直接检测自由基和活性氧。
其原理是利用带有未成对电子的物质（即自由基）对外加磁场的电子自旋产生磁共振现象。
在EPR仪器中，样品通过微波辐射，引发由磁共振演变而形成的微弱信号。
通过测量这些信号的幅度、形状和宽度等参数，可以判断活性氧的种类和数量。
EPR法的优点在于其高灵敏度和高特异性，可以实现对各种活性氧物质的定量分析。
然而，EPR仪器操作相对复杂，且仪器成本较高，因此在实际应用中受到一定的限制。
二、荧光探针法：荧光探针法是一种通过测定荧光探针与活性氧的反应生成的荧光信号来间接检测活性氧水平的方法。
荧光探针是一类能够与活性氧发生反应的化合物，一般可分为特异性探针和非特异性探针。
特异性探针是指能够选择性地与活性氧发生化学反应，生成具有荧光特性的产物。
例如，二氟苯基三氟甲烷（DCFH-DA）作为一种常用的特异性探针，它通过氧自由基致氧化反应生成2',7'-二羟基荧光素（DCF），DCF会发出绿色荧光，并与活性氧的浓度呈正相关。
活性氧（ROS）测定试剂盒说明书
②、波长设置：最佳激发波长 500(50015nm)，最佳发射波长 525 (53020 nm)。也可按照 FITC 荧光检
测条件检测。 ③、结果以荧光度值表示。
四、细胞样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
二、试剂组成及保存： 1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，20℃保存。 2、1ml 活性氧供氢体，4-8℃保存。
三、组织样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
1、单细胞悬液制备： 方法 1、采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液。 方法 2、酶消化法： 方法 3、机械法（网搓法）：
本试剂盒仅用于科研实验
1、直接将探针加入培养液中： ①、直接将 DCFH-DA 探针加入无血清培养基中：一般按照 1 ：1000 用无血清培养液稀释 CFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜， 通常对于 6 孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。 ②、取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞，同 时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～100µM。 ③、37℃孵育细胞 30min～几小时，通常为 30～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。一般阳性对照在刺激细胞 30 分钟左右，即可观察到明显的绿色荧光。 ④、吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成 片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。 ⑤、将细胞悬液全部收集到 1.5ml 离心管中。用无血清培养液或者 PBS 洗涤 2 次，以充分去除未进入细 胞内的 DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸净上清后加入 PBS 重新悬浮细胞进行测定。
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一个广泛存在于植物、动物和微生物细胞中的有害物质，在细胞内氧化还原反应中扮演重要角色。
活性氧包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）等，具有强氧化性。
活性氧在正常细胞代谢和维持细胞信号传导途径中发挥重要作用，但在细胞内过量生成会对细胞结构和功能造成损害，引发细胞衰老和死亡，促进炎症反应，以及导致一系列疾病的发生，包括心血管疾病、癌症、神经退行性疾病等。
活性氧检测是研究活性氧与细胞过程和疾病发生关系的重要手段。
常用的活性氧检测方法包括荧光探针染色法、电子自旋共振（electronspin resonance，ESR）法、流式细胞仪法、化学法等。
下面是一种基于荧光探针的活性氧检测实验方案，具体步骤如下：材料：1.细胞培养样本（如细胞系或原代细胞）2.活性氧检测荧光探针（如2',7'-二氯二羟苯基-4'-巯基吡啶，DCFH-DA）3.PBS（磷酸缓冲盐溶液）4.离心管5.无菌1.5mL离心管6.显微镜玻片7.荧光显微镜8.细胞培养基实验步骤：1.把细胞培养在合适的培养基中，保持在37°C的恒温培养箱中，条件合适时使其达到对照组的80%～90%接种度。
2.将细胞分装到离心管中，每支40mL细胞悬液。
3.加入DCFH-DA溶液，终浓度为10mM，使细胞充分吸收荧光探针。
将培养管放入37°C恒温培养箱中孵育30分钟以进行探针进入细胞。
4.将细胞洗涤剂去除，用PBS洗涤细胞3次以除去多余探针。
5.加入1mL的PBS溶液，留出0.5mL的悬液放入1.5mL离心管中，以进行离心。
去除上清液，避免细胞牵涉。
6.加入1.5mLPBS溶液，留出0.5mL的悬液放入1.5mL离心管中离心，去除上清液。
7.将取得的细胞悬液滴在显微镜玻片上，并加盖玻片。
在荧光显微镜下观察细胞活性氧的荧光信号强度。
2活性氧的化学
第二章活性氧的化学氧是需氧生物生存所必需的，有时亦可对机体造成损伤，一般氧的80%在线粒体消耗，用于产生ATP，20%在微粒体参与羟化反应，对非营养物质进行代谢，1-4%（1-2%、0.2%）产生活性氧(ROS)。
氧在体内的主要作用是生成水的同时为机体提供能量，在生成水时，氧需经四步接受4个电子才能还原成水，从而产生3个中间产物超氧阴离子自由基（ O 2- · ） 过氧化氢（ H 2O 2 ）羟自由基（ HO · ）O 2 + e →O 2- · + e →H 2O 2 + e →H 2O + HO · + e →H 2O2H + H +H +活性氧（ROS）：指氧在代谢过程中产生的，含有氧并具有较强活性的产物。
氧自由基：O2- · HO· LO· LOO·氧自由基衍生物：H2O2 1O2 LOOH一、超氧阴离子自由基（ O 2- · ）（超氧自由基）（超氧化物） 是氧分子单电子还原的产物O 2 + e O 2- ·2O 2- · + 2H + O 2 + H 2O 2单电子还原SODNADH →FMN →CoQ →Cytb →Cytc1→Cytc →Cytaa3→1/2O 2（Fe-S ）（Fe-S ）2H 2H +↑→ 2e O 2-↑H 2O FAD(Fe-S)↑琥珀酸2.琥珀酸氧化呼吸链1.NADH 氧化呼吸链⑵非酶促反应①蛋白质的自动氧化Hb-Fe2+ + O2 Hb-Fe3+ + O2- ·②低分子化合物的自动氧化NAD+ FAD FMN③较稳定自由基的自动氧化VitK·④水的辐射分解2.超氧自由基的反应 ⑴氧化反应 O 2- · +Ａ O 2 +Ａ- ⑵还原反应 ⑶歧化反应 2O 2- · + 2H + O 2 + H 2O 2自动歧化反应酶促歧化反应得电子还原得氢还原SOD3.超氧自由基的检测⑴电子自旋共振法⑵SOD法二、过氧化氢（H2O2）是氧分子进行二电子还原产生O2 + 2e + 2H+ H2O2 H2O2 2HO·2H2O2 2H2O+O2CAT2.H2O2的反应⑴过氧化物酶催化⑵过氧化氢酶催化⑶碱性溶液中分解⑷自动分解3. H2O2的检测⑴过氧化氢酶法⑵荧光法:莨菪亭 + H2O2 荧光物质三、羟自由基（ HO·）是氧分子进行三电子还原的产物O2 + 3e + 3H+ H2O + HO·1. HO·的生成⑴H2O2被过渡金属元素或O2- ·还原H2O2 + Fe2+ + H+ HO· + H2O + Fe3+ 此反应称为Fenton反应H2O2 + O2- ·+ H+ HO· + H2O + 1O2此反应称为Haber-Weiss反应⑵水的辐射分解⑶H2O2受紫外线的照射2. HO·的反应⑴电子转移（夺取电子）HO·+O2- ·1O+OH-2⑵夺取氢原子诱发脂质过氧化反应⑶羟基化可以使苯、芳香族化合物羟基化⑷加成反应破坏核酸3. HO·的检测⑴自旋捕捉法：加入自旋捕捉剂（自由基捕捉剂）将不稳定自由基转变为稳定自由基进行检测常用自旋捕捉剂：5.5-二甲基吡咯啶-N-氧化物⑵加羟自由基清除剂：苯甲酸、甘露醇、果糖、肌醇等四、单线态氧（1O 2）空气中比较稳定的氧分子称为三线态氧（3O 2） 1O 2含能量高，比3O 2活泼 3O 2 1O 21O 23O 2 吸能放能1. 1O 2 的生成⑴化学反应生成1O 2① H 2O 2 被氧化② O 2- ·被氧化H 2O 2 + NaCIO NaCI + 1O 2 + H 2O碱性条件髓过氧化物酶2H 2O 2 2H 2O + 1O 2 碱性溶液 O 2- · + A A - + 1O 2O 2- · + O 2- ·H 2O 2 + 1O 2自动歧化2.1O2 的反应⑴与二烯烃、芳香烃反应生成内过氧化物 2,5-二甲基呋喃⑵与稀类反应生成氢过氧化物或二氧烷四甲基乙烯⑶1O2可把激发能转移给其他物质1O2 + A A*+ 3O23. 1O2 的检测化学发光法1O2 3O2 + hv（光子）（不可见光）21O2 2 3O2 + hv（光子）（可见光）①光子计数器测产生光子的数量②加入1O2 清除剂测定化学发光受抑制程度常用1O2 清除剂：水、类胡罗卜素（生物体内）四甲基乙烯（TME）（实验常用）2.5-二甲基呋喃（DMF）③测发光物质1O2 + 荧光素（蒽、鲁米诺）3O2+ 发光物质五、脂质过氧化物（Lpo）不饱和脂肪酸发生过氧化反应的产物氢过氧化物 (LOOH)内过氧化物（LOOL）（分子内过氧键很不稳定，易分解产生自由基）1.脂质过氧化物的生成⑴酶促反应5-氢过氧基花生四烯酸5-脂氧合酶花生四烯酸12-脂氧合酶12-氢过氧基花生四烯酸⑵非酶促反应①1O2 的氧化单线态氧可将不饱和脂肪酸氧化为脂质过氧化物花生四烯酸 + 1O2 5-氢过氧化物（6-、8-、 9-、 11-、12-、14-、15-等8氢过氧化物）②电离辐射、光、自由基引发脂质过氧化反应不饱和脂肪酸 L· LOO· + LHLH + R· RH + L·LH + HO· H 2O + L·光、射线自由基O 2LOOH +L·③过渡金属离子作用于脂质过氧化物产生自由基引发不饱和脂肪酸的自动氧化LOOH + Fe2+ LO· + OH- + Fe3+LOOH + Fe3+ LOO· + H+ + Fe2+LO·、 LOO· + LH 引起脂肪酸自动氧化在Fe2+ 存在下，形成连锁反应，产生L·、 LO·、LOO·、LOOH2.脂质过氧化物的反应⑴脂质过氧化物可分解生成醛、酮、醚、烷烃丙二醛⑵是强氧化剂谷光甘肽过氧化物酶2GSH + LOOH GS-SG + LOH+H2O3.脂质过氧化物的检测⑴测丙二醛硫代巴比妥酸法⑵检测共轭二烯紫外光谱⑶测挥发性烷烃气相色谱法O 2 O 2- · H 2O 2 HO · L · LOO · LOOH 1O 2LH LH习题：1.何谓活性氧？包括哪几种？2.简述超氧阴离子自由基的生成方式。
鹌鹑活性氧(ROS)说明书
控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值
1.25 IU/ml
1 号标准品
150µl 的 2 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50µl，待测样品孔中先加样品稀释液 40µl，
然后再加待测样品 10µl（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽 量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。 4. 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此 重复 5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50µl，空白孔除外。 7. 温育：操作同 3。 8. 洗涤：操作同 5。 9. 显色：每孔先加入显色剂 A50µl，再加入显色剂 B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 10 分钟. 10. 终止：每孔加终止液 50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止 液后 15 分钟以内进行。 操作程序总结：
鹌鹑活性氧（ROS）酶联免疫分析
试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用。
检测范围： 0.6 IU/ml -20 IU/ml
活性氧简介及其产生
活性氧简介及其产生集团标准化工作小组 [Q8QX9QT-X8QQB8Q8-NQ8QJ8-M8QMN]活性氧(reactive oxygen species, ROS)是一类化学性质活泼，具有较高氧化活性的分子或离子的总称。
主要包括超氧阴离子、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(HO.)、一氧化氮(NO.)等。
线粒体是ROS的主要产生部位，在线粒体呼吸过程中会有少量的电子从线粒体电子传递链复合体Ⅰ和Ⅲ中漏出，与O2结合生成ROS。
此外NADPH氧化酶和过氧化物酶等也能产生ROS。
过量的ROS会对蛋白质、核酸和脂质等生物大分子造成损伤，从而影响其正常生理生化功能。
生物体本身存在清除ROS的体系，包括SOD酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、抗坏血酸等，这一体系使生物体内ROS保持在对机体无害的水平。
活性氧(ROS)的产生由镉和硒等离子的释放所引发的毒性，在某种程度上可以通过壳对核的保护来得以控制，但是活性氧产生的毒性却难以控制。
当细胞暴露于病原体或者热等不良环境压力时，会产生具有化学活性的含氧分子。
这些活性氧物质(ROS)可被分为两种类型：自由基ROS（一氧化氮或者羟基自由基）和非自由基ROS（过氧化氢）。
大多数细胞都可以通过谷胱甘肽氧化还原系统的防御机制来缓冲一定量的ROS，但是高水平长时间的ROS会导致细胞的损伤。
当把培养细胞暴露于纳米粒子时，活性氧的产生是一个普遍现象，ROS的产生主要源于纳米粒子的反应能力[123, 124]。
纳米粒子巨大的比表面积和表面分子较高的反应活性使得其具有较高的氧化能力。
一般说来，纳米粒子可以通过以下几种不同的机制产生ROS[125]：(1)当被暴露于酸性环境（例如溶酶体）中，纳米材料表面修饰物的反应活性、表面修饰物的降解、量子点降解而导致的离子释放，均会引起ROS水平的升高(图[126-128]。
(2)纳米粒子与线粒体等具有氧化能力的细胞器发生相互作用，破坏线粒体外膜，导致线粒体膜电势的坍塌，因此干扰氧化磷酸化的电子传递链(3)纳米粒子和NADPH氧化酶等氧化还原性蛋白的相互作用，引起细胞免疫系统中活性氧水平的增加(图。
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案活性氧检测是一种用于评估物质或生物体中产生的活性氧（ROS）水平的方法。
ROS是一类极具活性的氧化物质，可在正常细胞代谢中产生，并参与多种生理过程。
然而，当ROS的产生超过细胞的抗氧化能力时，就会导致氧化应激，对细胞和组织造成损害，并与一系列疾病的发生和发展相关。
为了测量活性氧的水平，可以使用一系列的试剂和方法。
以下是一个可能的活性氧检测实验方案：实验材料：1.活体组织样本（例如细胞培养物、小鼠肝脏组织等）2.PBS缓冲液3.DCFDA（二氟荧光二乙酸盐）染料溶液4.活性氧产生剂（例如H2O2）5.抗氧化剂（例如维生素C）6.血红素（免疫染色用）实验步骤：1.准备工作：a.将DCFDA溶液按照说明书的要求稀释到适当的浓度。
b.用PBS缓冲液洗涤和预处理样本，去除可能影响实验结果的其他物质。
2.观察基础水平：a.取一小部分样本，不加任何试剂，放入显微镜观察台下。
b.使用适当的增强型荧光显微镜观察样本的荧光强度和分布。
3.活性氧产生实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。
b.添加一定浓度的活性氧产生剂（例如H2O2），混匀。
c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。
d.记录荧光信号的强度和分布。
4.抗氧化剂实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。
b.添加一定浓度的抗氧化剂（例如维生素C），混匀。
c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。
d.记录荧光信号的强度和分布。
5.数据分析：a.使用图像分析软件测量荧光信号的平均强度和荧光染色的面积。
b.对每个样本的数据进行统计分析，如平均值、标准误差等。
c.使用统计学方法（如t检验或方差分析）比较不同处理组之间的差异。
总结：通过以上步骤，可以获得活性氧的水平，评估其在不同条件（如活性氧产生剂和抗氧化剂的存在与否）下的变化。
这个实验方案可以用于研究活性氧在细胞和组织中的作用，以及评估抗氧化剂的功效。
活性氧种类的检测和应用研究
活性氧种类的检测和应用研究随着人们对健康、环境和生物学等领域的研究逐渐加深，活性氧种类的检测和应用研究也越来越受到关注。
活性氧种类是一类强氧化剂，是生物学和医学中的重要指标。
本文将介绍活性氧种类的检测方法及其应用研究。
一、活性氧种类的检测方法1、荧光分析法荧光分析法是一种常用的活性氧种类检测方法。
此方法可用于检测各种活性氧种类，包括超氧自由基、羟自由基、过氧化氢和单线态氧等。
该方法的原理是利用荧光探针，在活性氧种类的作用下发生化学反应，导致荧光强度发生变化，从而可以间接测量样品中活性氧种类的含量。
2、化学法化学法是一种基于氧化还原反应的活性氧种类检测方法。
常用的方法包括铁离子还原法、硝酸盐还原法和硫代巴比妥酸法等。
这些方法原理相似，是通过反应与活性氧种类发生还原反应，并产生可测量的化合物来间接测量活性氧的含量。
3、电化学法电化学法是利用电化学技术来检测活性氧种类的含量。
该方法可以分为两种：一种是利用氧电极来测量活性氧种类的含量，另一种是利用循环伏安法和线性扫描伏安法等技术对活性氧种类进行检测。
电化学法具有灵敏度高、可重复性好的特点，成为了活性氧种类检测的重要手段之一。
二、活性氧种类的应用研究1、生物学研究活性氧种类常常被用于生物学研究中。
在生物体内，活性氧种类的产生和去除平衡对细胞功能和健康至关重要。
例如，自由基在细胞内参与许多生理和病理过程，红细胞及其它体细胞在某些疾病中会大量产生活性氧种类，导致细胞损伤和组织器官崩溃。
因此，研究活性氧种类的生物学效应与作用机制，为探索生物体的生理与病理机制提供了有力的工具。
2、医学应用活性氧种类的产生与病理过程和某些疾病密切相关，如心血管疾病、肿瘤等。
现在，活性氧种类的检测已经成为一种常见的生物学检测手段，是诊断和治疗许多疾病的重要方法。
3、环境监测活性氧种类在环境污染和环境保护中也发挥着重要作用。
例如，活性氧种类可以导致大气污染、水源污染以及土壤的腐蚀和酸化等，因此对于环境中活性氧种类的监测和控制也变得尤为重要。
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一，实验原理
大量研究结果表明，当生物体遭受污染物胁迫时，体内活性氧的产生将大大增加，当超出生物体的抗氧化防御能力时，能够氧化不饱和脂肪酸、蛋白质和核酸分子，导致膜脂质过氧化、酶蛋白失活、DNA损伤，甚至细胞坏死等. 因此，活性氧的大量产生和积累可作为生物体氧化胁迫的信号。
NBT显色法的原理是NBT与细胞内O2.-反应生成蓝色甲腙的斑点，可原位显示O2.-的存在，而且其斑点密度与O2.-含量相关，是研究植物叶片组织O2.-的常规方法。
二，实验步骤
1、取对小白菜叶片，放入250ml烧杯中，立即浸入显色液(0．1% NBT ，10 mmol·L 叠氮化钠的PBS缓冲液，pH 6.5,50m M)，
2、真空抽滤20min，重复两次。
3、取出叶片，放入固定液中，100℃水浴若干分钟。
4、放入95%乙醇中，固定，照相。
三，实验结果
从照片中可以看出，小白菜叶柄处的超氧阴离子含量较多。
四，与超氧阴离子组织定位有关的文献
Romero-Puertas M C，Rodríguez-Serrano M，Corpas FJ etal． Cadmium-induced subcellular accumulation of O2·－and H2O2 in pea leaves［J］．Plant Cell Environ，2004，27: 1122-1134
五，为什么超氧阴离子多分布在维管束部位？
植物体内活性氧的清除主要由某些酶系统和抗氧化物质来完成, 其中SOD、CAT和POD 是一个最重要的活性氧清除酶系统: SOD将超氧阴离子歧化成H2O2, 抑制Haber-Weiss反应,再由CAT和POD将H2O2分解成H2O。
本实验中小白菜的超氧阴离子多分布在维管束部位，这一可能与超氧阴离子极活泼的性质有关, 另一方面可能与植物体内超氧阴离子的清除系统有关。