DHE-ROS活性氧检测方法
活性氧（ROS）测定试剂盒说明书
②、波长设置：最佳激发波长 500(50015nm)，最佳发射波长 525 (53020 nm)。也可按照 FITC 荧光检
测条件检测。 ③、结果以荧光度值表示。
四、细胞样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
二、试剂组成及保存： 1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，20℃保存。 2、1ml 活性氧供氢体，4-8℃保存。
三、组织样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
1、单细胞悬液制备： 方法 1、采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液。 方法 2、酶消化法： 方法 3、机械法（网搓法）：
本试剂盒仅用于科研实验
1、直接将探针加入培养液中： ①、直接将 DCFH-DA 探针加入无血清培养基中：一般按照 1 ：1000 用无血清培养液稀释 CFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜， 通常对于 6 孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。 ②、取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞，同 时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～100µM。 ③、37℃孵育细胞 30min～几小时，通常为 30～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。一般阳性对照在刺激细胞 30 分钟左右，即可观察到明显的绿色荧光。 ④、吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成 片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。 ⑤、将细胞悬液全部收集到 1.5ml 离心管中。用无血清培养液或者 PBS 洗涤 2 次，以充分去除未进入细 胞内的 DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸净上清后加入 PBS 重新悬浮细胞进行测定。
ROS活性氧检测-DCFHDA法
ROS活性氧检测-DCFHDA法
BB-47053
活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧⾃由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞⽣长增殖、发育分化、衰⽼和凋亡以及许多⽣理和病理过程。
贝博活性氧检测试剂盒是⼀种利⽤荧光探针DCFH-DA进⾏活性氧检测的试剂盒。
DCFH-DA本⾝没有荧光，可以⾃由穿过细胞膜，进⼊细胞内后，可以被细胞内的酯酶⽔解⽣成DCFH。
⽽DCFH不能通透细胞膜，从⽽使探针很容易被标记到细胞内。
在活性氧存在的条件下，DCFH被氧化⽣成荧光物质DCF，绿⾊荧光强度与细胞内活性氧⽔平成正⽐，检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的⽔平。
在激发波长502 nm，发射波长530 nm附近，使⽤荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测DCF 荧光，从⽽测定细胞内活性氧⽔平。
本试剂盒可以⽤于各种真核培养细胞的检测。
本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂，以便于活性氧的检测。
细胞中活性氧的荧光探针检测法研究进展_张鑫
文章编号：1003-8507（2010）22-4316-02中图分类号：R122.1文献标识码：A【实验技术及其应用】细胞中活性氧的荧光探针检测法研究进展张鑫综述，王旗审校摘要：荧光探针法是一种灵敏的、可提供细胞内靶分子时空信息的活性氧（ROS）检测法。
目前常用的荧光探针有HE（检测O2·-）、DCFH和DHR（检测H2O2）等。
ROS的检测结果易受以下因素影响：基于氧化还原反应的荧光探针选择性差，且反应需要催化剂（过氧化物酶、细胞色素C）；细胞内pH值、抗氧化剂影响检测结果；荧光探针在光照条件下可发生自氧化。
近期研究主要集中在如何改进荧光探针的上述局限性。
本文对荧光探针法检测细胞内ROS的研究进展进行简要介绍。
关键词：活性氧；荧光探针；DCFHPROGRESS IN MEASUREMENT OF REACTIVE OXYGEN SPECIES IN CELLS by USING FLU-ORESCENT PROBES ZHANG Xin，WANG Qi.（Department of Toxicology，School of Public Health，Peking University，Beijing100191，China）Abstract：Fluorescent probes are sensitive tools in the measurement of Reactive Oxygen Species in cells，and it can pro-vide temporal and spatial information on target biomolecules in cellular system.Currently，the most frequently used probes in-cludes HE（for O2·-），DCFH and DHR（for H2O2）.However，the following aspects tend to make the detection results more complex：fluorescent probes based on redox reaction lack selectivity and require a catalyst（Peroxidase or Cytochrome C）for reaction；Intracellular PH and antioxidants can potentially influence the detection process；also，probe auto-oxidation Could occur under photo-irritation.Some improvements in detection of ROS have been achieved in recent years.This paper focused on the progress in the ROS detection using fluorescent probes.Key words：Reactive Oxidative Species；Fluorescence probe；DCFH活性氧（Reactive Oxidative Species，ROS）是指生物体内与氧代谢有关的含氧自由基和不以自由基形式存在的具有高活性的中间产物，主要由氧化呼吸链中的酶复合体Ⅰ和Ⅲ漏出的电子产生，包括超氧阴离子（O2·-），羟自由基（HO·），过氧化氢（H2O2），单线态氧（1O2），次氯酸（HOCl）等。
DHE-ROS活性氧的检测
产品号 BB-4101 BB-4102 BB-4201 BB-4202 BB-4203 BB-4204 BB-4131 BB-4133 BB-4122
产品 细胞周期检测试剂盒 JC-1 线粒体膜电位试剂盒 Caspase 3 活性检测试剂盒 Caspase 8 活性检测试剂盒 Caspase 9 活性检测试剂盒 Caspase 10 活性检测试剂盒 细胞凋亡形态学检测试剂盒 Rhodamine 123 染色试剂盒 AO/EB 双染试剂盒
荧光显微镜检测： 1、 对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取 25-50 μl 细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。 2、 荧光显微镜下，用蓝光或绿光激发，观察和拍摄细胞红色发射图像，ROS 阳性细
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咨询邮箱：bestbio@
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咨询邮箱：bestbio@
电话：021-33921235
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
产品说明书
产品特点： ● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式
细胞仪检测； ● 背景低，灵敏度高； ● 线性范围宽，使用方便。
电话：021-33921235
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
产品说明书
胞在整个核区被染成红色；用紫外光激发时，胞浆中未氧化的二氢乙啶可发出 蓝色荧光。
流式细胞仪分析： 1、 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。 用 0.5~1 ml 冰冷 PBS 重悬细胞（5~10 万）。 2、 采用 480~535 nm 波长激发，测定 590 nm~610 nm 以上的发射，细胞应可分成两个 亚群：ROS 阴性细胞仅有很低的荧光强度，ROS 阳性细胞有较强的红色荧光。
活性氧的检测方法
展。直到 1969 年 McCord 和 Fridovich[ 1] 发现 了清 除 超氧 化物 自由 基的 超氧 物 岐化 酶 ( SOD) 并研究其生物学作用, 提出了氧毒性 的超氧化物自由基学说后 , 人们才开始逐步 认识到自由 基在生物 体内存在 的危害 , 同 时 , 由于分子生物学的迅猛发展, 研究短寿 命的自由基的方法有所突破, 带动自由基生 物学的发展 , 使自由基生物学这门学科渗透 到医学、 植物生理学、 病理学等许多学科中, 显示出其极大的发展前景。 生物学、 医学最先研究活性氧的方法, 有脉冲射解 、 快速停流 、 顺磁共振和自旋 搜集技术 [
[ 3] .
第2期
陈惠萍等:
活性氧的检测方法
15
SOD 作用的底物 , 故原则上许多检 测 SOD 的方 法, 如化 学 发光、 NBT ( 氮 蓝四 唑 ) 还 原、 细胞色素、 连苯三酚、 肾上腺素都可以用 来检测生物系统的 O2. , 但干扰因素很多, 实 际应 用时困难不 少[ 4~ 6] 。 1976 年 Elest ner 等 提出用羟胺氧化反应来检测生物材料 的 O 2. 。此法灵敏 度高, 专一性好 , 药 剂价 廉。能同时检测大量样品。但叶绿素等色 素含量严重影响比色测定。王爱国等 为 了消除这些干扰 , 对实验步骤进行了改进, 并在分离时以乙醚取代正丁醇 , 检测了四季 豆幼苗叶片 叶绿体在光 暗下衰老 过程 O2 产生速率, 其结果与 McRac 等
1
、 水稻
[ 17]
、 眉豆
[ 18]
等植物上观察到
的现象类似。 4
1
O2 的检测 早在 1930 年 , M ulliken 通过 分子轨道
的计算就已 预言单 线态氧的 存在, 但 直至 1963 年 Khan 和 Kasa 发现 可以 用 NaOCl 和 H 2 O2 反应来产 生单线态氧才 使该领域 研究 得以迅速发展。用于1 O 2 检测的 方法 有化学发光法、 猝灭剂抑制法、 在2 H 2 O 中延 长寿命法、 产物分析法等几种方法 。其 1 中最直接的检 测方法是观察 O2 的化学发 光, 这种方法需要聚集较大量的1 O2 才能检 测出来。使用1 O 2 猝灭剂抑制 1 O2 参与的反 应, 最常使用的是类胡萝卜素, 它以物理方 式或猝灭 1O 2 而自 身并不发生任 何化学反 应。此外还有叔胺、 维生素 E 、 氮化合物、 四 甲基 乙烯、 2, 5
活性氧的检测方法
活性氧检测试剂盒（Reactive oxygen species assay kit）是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。
而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。
细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。
检测DCF 的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup以便于活性氧的检测。
Rosup是一种混合物（compound mixture），浓度为50mg/ml。
一、注意事项1、探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
2、探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。
3、尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
二、使用说明1、装载探针对于刺激时间较短（通常为2小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞。
对于细胞刺激时间较长（通常为6小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照及自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。
按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH- DA，使终浓度为10微摩尔/升。
去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。
加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA的体积为1毫升。
37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针：按照1：1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。
动物细胞氧化应激活性氧（ROS）光泽精化学发光法定量检测试剂盒说明书
动物细胞氧化应激活性氧(ROS)光泽精化学发光法定量检测试剂盒说明书一、检测原理动物细胞氧化应激活性氧(ROS)光泽精化学发光法定量检测试剂盒是血液卵磷脂胆固醇乙酰转移酶(LCAT)活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过非界面性的水溶性单体底物，在磷脂酶或乙酰转移酶的水解下，其释放的产物发生吸收峰值的变化，即采用比色法来测定血液样品中酶活性的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种血液样品(动物、人体等)卵磷脂胆固醇乙酰转移酶的活性检测。
产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
二、样品收集、处理及保存方法血液样品分为耳静脉采血、颈静脉采血、前腔静脉采血、心脏采血、翅静脉采血，应根据工作实际选择合适的采血方式。
全血样品是在样品中加抗凝剂，可用0.1%肝素、阿氏液、3.8%枸橼酸钠。
我们通常做免疫效果抗体检测需要血清，血液在采集后室温静置2小时以上，冬季需要加温，高速离心，或者4度过夜，抽取血清。
注意事项：1每份样品一定按要求采够量，比如禽血清一般要求不少于0.5毫升，猪血清一般要求不少于1毫升。
2血清样品要清亮、无溶血、无变质。
3样品容器上贴详细标签4尽量防止或避免反复冻融。
组织样品：采集的每个组织块要单独放一个已消毒的容器内，贴详细标签，防止组织间相互污染，注意消毒，以防散毒。
做好个人防护。
分泌物和排泄物：常用的就是禽流感咽喉拭子和泄殖腔拭子的采集。
容器中首先放入含有抗菌素的PH值为7.0-7.4的PBS液，原则上咽喉、泄殖腔拭子分别放置。
抗生素的浓度为青霉素2000IU/ml,链霉素2mg/ml,庆大霉素(卡那霉素)50ug/ml,制霉菌素10000IU/ml,粪便和泄殖腔拭子所用的抗生提高5倍。
加入抗生素后应调整PH值至7.0-7.4。
粪便样品：常用的是禽流感野鸟粪便的采集，注意样品一定为新鲜粪便。
皮肤样品三、储存条件14℃或-20℃四、试剂盒内容标准品样本稀释液检测抗体-HRP20×洗涤缓冲液底物A底物B终止液说明书自封袋五、操作方法1. 从室温平衡20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
植物体超氧阴离子自由基不同检测方法的比较
理条件下水溶液中寿命极其短暂的 O2 的定性和定量问题
·－
［9 ］
． EPR 自旋捕捉技术要求的实验条件比较
［10 ］
严格， 而且需要 EPR 这样昂贵的实验仪器， 一般研究者很难具备， 限制了其推广和普及． 王爱国等 研 ·－ － － O2 与羟胺反应生成 NO2 ， NO2 在对究报道， 氨基苯磺酸和 α萘胺作用下生成粉红色的偶氮染料， 该
活性氧自由基（ ROS ） ，顺磁共振波谱仪 （ EPR ） ，羟胺氧化法，二氢乙锭 （ DHE ） 荧光探针，原位
ROS 主要产 协同作用， 形成一个复杂的反应网络． 在叶片等含有叶绿素的组织和细胞中 ， 在光照条件下， ROS 生于叶绿体和过氧化物酶体， 而在根部等不含叶绿素的组织和细胞中以及黑暗条件下的绿色组织 ， 主要来源于线粒体
响应水平． 关键词 显色．
·－ 植物体内的活性氧 （ reactive oxygen species，ROS ） 通常存在超氧阴离子自由基 （ O2 ） 、 过氧化氢 1 （ H2 O2 ） 、 羟基自由基 （ OH· ） 、 单线态氧 （ O2 ） 、 氢过氧基 （ HOO· ） 、 脂质自由基 （ R· ） 、 脂氧自由基 ·－ （ RO·） 和脂质过氧自由基（ ROO·） 等类型． 其中， O2 、 H2 O2 、 OH· 和1 O2 等活性氧可以相互转化， 通过
·－ 1 ［ NO2－ ］ ， · min －· mg － 1 Pr 表示． 再计算出 O2 的含量， 结果以 nmol
1． 5
应用特异 水稻根尖组织 O2 的荧光检测参照 Yamamoto 等方法 进行， 略加改进． 剪取染毒后的水稻根尖
（ 1 cm） ， · L － 1 DHE （ 10 mmol·L － 1 TrisHCl，pH 7． 5 配制 ） ， 37 ℃ 避光染色 30 min． 用 立即浸入 5 μmol －1 10 mmol · L TrisHCl（ pH 7． 5） 避光洗涤 15 min × 2 次， 切取 0． 5 cm 根尖， 排列于载玻片上， 在荧光显微镜 · L － 1 CdCl2 处理组的 下（490 nm 激发光和 520 nm 发射光） 拍摄图片． 为检测该探针的特异性， 取 100 μmol · L － 1 SOD 酶溶液中于室温下孵育 30 min， 根尖， 置于 35 mg 清洗后转移至 DHE 染液， 后续步骤同上． ·－ 1． 6 应用 NBT 原位显色法捕获叶片组织 O2 Puertas 等方法 叶片组织 O2 的原位显色分析参照 Romero即浸入 O
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产品号 BB-4104 BB-4105 BB-4106 BB-4107 BB-4108 BB-4112 BB-4123 BB-4137 BB-4132
细胞仪检测； ● 背景低，灵敏度高； ● 线性范围宽，使用方便。
试剂盒以外自备试剂和仪器 ● 培养基 ● 移液器及吸头 ● 离心机 ● 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪， 激发波长535nm，发射波长610 nm。
使用方法：
使用注意事项： ● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液 体洒落。 ● 荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。 ● 探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标 记情况是否正常。 ● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。 ● 对于药物作用时间较短(2 小时以内)的细胞，先标记探针，后用药物刺激细胞。对于药物作用时 间较长(6 小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照诱导剂或相应的药物刺激细胞，后标记探针。 ● 阳性对照诱导剂可以按照 1:1000 的比例使用。例如标记好探针的细胞共 1 毫升，可以加入 1 微升 的阳性对照诱导剂刺激。通常刺激后 20-30 分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于 不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后 30 分钟内观察不到活性氧 的升高，可以适当提高活性氧阳性对照诱导剂的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活 性氧阳性对照诱导剂的浓度。 ● DHE 在光照和空气中易被氧化，注意避光密封保存。 ● 对不同的细胞和组织，应选择合适的孵育时间和浓度，以观察 ROS 的变化。
测的试剂盒。DHE 可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的 ROS 氧化，形成氧化乙 啶；氧化乙啶可掺入染色体 DNA 中，产生红色荧光。根据活细胞中红色荧光的产生，可以 判断细胞 ROS 含量的多少和变化。二氢乙啶在细胞内主要被超氧阴离子型 ROS 氧化，用流 式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织或培养活细胞中 ROS 经典检测 方法。
产品简介： 活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧
化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 贝博 DHE 活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针 DHE(Dihydroethidium)进行活性氧检
流式细胞仪分析： 1、 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。 用 0.5~1 ml 冰冷 PBS 重悬细胞（5~10 万）。 2、 采用 480~535 nm 波长激发，测定 590 nm~610 nm 以上的发射，细胞应可分成两个 亚群：ROS 阴性细胞仅有很低的荧光强度，ROS 阳性细胞有较强的红色荧光。
产品号 BB-4101 BB-4102 BB-4201 BB-4202 BB-4203 BB-4204 BB-4131 BB-4133 BB-4122
产品 细胞周期检测试剂盒 JC-1 线粒体膜电位试剂盒 Caspase 3 活性检测试剂盒 Caspase 8 活性检测试剂盒 Caspase 9 活性检测试剂盒 Caspase 10 活性检测试剂盒 细胞凋亡形态学检测试剂盒 Rhodamine 123 染色试剂盒 AO/EB 双染试剂盒
DHE-ROS 活性氧检测试剂盒
产品组成：
产品编号 规格
DHE 荧光探针 活性氧阳性对照诱导剂
BB-47051 200-1000T
1ml 1ml
储存条件： -20℃避光保存。
有效期： 六个月。
注意事项： ● 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。 ● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管 底，避免开盖时试剂损失。 ● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。 ● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。 ● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清 洗并彻底清除残留清洁剂。 ● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。
DHE 探针标记： 1、 DHE 溶液可在新鲜培养液、缓冲盐溶液或组织灌流液中稀释到所需浓度，100-1000 倍稀释，以此染色液更换细胞培养液或灌流液；也可直接向细胞孵育液体或灌 流液中加入 DHE 探针溶液至所需浓度。 2、 依据细胞 ROS 含量的不同，DHE 终浓度可选择在 100-1000 倍稀释的范围，孵育 时间可选择 10-90 分钟，在 37℃或室温进行避光孵育。 3、 孵育结束后，用新鲜溶液清洗细胞或组织。
在激发波长 535nm，发射波长 610 nm 附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、 荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测荧光，从而测定细胞内活性氧水平。
本试剂盒可以用于各种真核培养细胞、培养或灌流组织及组织冰冻切片的检测。本试剂 盒提供了活性氧阳性对照试剂，以便于活性氧的检测。
产品特点： ● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分nnexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒 Annexin V-EGFP/PI 凋亡试剂盒 MTT 细胞增殖及毒性检测试剂盒 CCK-8 细胞增殖毒性检测试剂盒 WST-1 细胞增殖毒性检测试剂盒 MTS 细胞增殖与毒性检测试剂盒 Hoechst33342/PI 双染试剂盒 DAPI 染色试剂盒 细胞存活率检测试剂盒