DCFHDA活性氧的检测
DCFHDA活性氧检测方法
DCFHDA活性氧检测方法DCFH-DA（2',7'-二氯荧光二乙酸）是一种常用于检测细胞内活性氧的荧光探针。
DCFH-DA最初作为一种检测脂质过氧化和活性氧产生的荧光探针而被引入。
在细胞内，DCFH-DA可以被酯酶水解成DCFH（2',7'-二氯荧光二酚），而DCFH与活性氧反应生成Dichlorofluorescein（DCF）产生强烈的绿色荧光。
DCFH-DA检测法被广泛应用于反应氧化应激和自由基生成的过程。
DCFH-DA检测法实际上是一种间接测定活性氧的方法。
原理基于DCFH-DA能够通过酯酶水解成DCFH，而DCFH可以直接或通过活性氧来氧化生成DCF。
因此，DCF的荧光强度与细胞内的活性氧水平成正相关。
DCFH-DA检测法常用于检测细胞或组织中的过氧化氢（H2O2）、羟自由基（•OH）、超氧阴离子（O2•-）等活性氧物种。
DCFH-DA检测法的步骤如下：1.细胞准备：将需要检测活性氧的细胞培养在合适的培养基中，保证细胞的活力和完整性。
2.DCFH-DA处理：将培养的细胞离心，去除培养基，并用含有适当浓度的DCFH-DA的PBS缓冲液重新悬浮细胞。
DCFH-DA可在一定浓度下直接添加到细胞培养基中，也可在细胞中预处理一段时间。
3.洗涤：DCFH-DA可渗透细胞膜进入细胞内，在细胞酯酶的作用下，水解成DCFH。
洗涤细胞是必要的，以去除外源DCFH-DA和水解后生成的DCFH。
4.活性氧诱导：将细胞暴露在产生活性氧的刺激剂中，如过氧化氢、辐射、药物等。
较为常用的是使用刺激物H2O2，细胞可暴露在适当浓度的H2O2中一段时间。
5.荧光显微镜观察：在刺激剂作用一定时间后，将细胞离心，取得细胞沉淀。
用PBS洗涤，使得测量时背景荧光最小。
6.荧光检测：将洗涤好的细胞沉淀悬浮于含PBS的离心管中，通过流式细胞术或荧光显微镜测量活性氧生成后的荧光信号。
DCFH-DA检测方法的优势在于具有响应迅速、敏感度高、操作简单等特点。
活性氧（ROS）测定试剂盒说明书
②、波长设置：最佳激发波长 500(50015nm)，最佳发射波长 525 (53020 nm)。也可按照 FITC 荧光检
测条件检测。 ③、结果以荧光度值表示。
四、细胞样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
二、试剂组成及保存： 1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，20℃保存。 2、1ml 活性氧供氢体，4-8℃保存。
三、组织样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
1、单细胞悬液制备： 方法 1、采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液。 方法 2、酶消化法： 方法 3、机械法（网搓法）：
本试剂盒仅用于科研实验
1、直接将探针加入培养液中： ①、直接将 DCFH-DA 探针加入无血清培养基中：一般按照 1 ：1000 用无血清培养液稀释 CFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜， 通常对于 6 孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。 ②、取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞，同 时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～100µM。 ③、37℃孵育细胞 30min～几小时，通常为 30～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。一般阳性对照在刺激细胞 30 分钟左右，即可观察到明显的绿色荧光。 ④、吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成 片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。 ⑤、将细胞悬液全部收集到 1.5ml 离心管中。用无血清培养液或者 PBS 洗涤 2 次，以充分去除未进入细 胞内的 DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸净上清后加入 PBS 重新悬浮细胞进行测定。
细胞氧化应激检测方法
细胞氧化应激检测方法
细胞氧化应激检测方法主要有以下几类：
测定由活性氧修饰的化合物：利用DCFH-DA荧光标记法、黄嘌呤氧化酶法、二硫代二硝基苯甲酸法、罗丹明123荧光染色法、硫代巴比妥酸法等检测细胞内ROS含量。
Amplex Red 荧光染色法可检测细胞内脂质氢过氧化物，而C11-BODIPY 荧光染色法、GSH试验方法等则用于检测细胞内脂质过氧化。
测定活性氧消除系统酶和抗氧化物质的量：通过免疫印迹法检测SOD的表达，氯化硝基四氮唑兰（NBT）可检测细胞内SOD的活性，DTNB可检测机体抗氧化系统的损伤。
测定含有转录因子的氧化应激指示物：这种方法通过检测氧化应激状态下的特定转录因子或其下游产物的变化来评估氧化应激程度。
此外，还有一些其他方法如蛋白质氧化损伤检测、脂质过氧化检测分析、核酸DNA/RNA损伤分析等，这些方法可以通过检测蛋白质羰基化、硝基化损伤及晚期氧化蛋白产物（AOPP），脂质过氧化的标志物壬烯（HNE）和丙二醛（MDA），
以及8-异前列腺素F2a等指标来评估细胞的氧化应激状态。
请注意，以上方法可能需要根据具体的实验条件和需求进行优化和调整。
同时，不同的方法可能具有不同的灵敏度和特异性，因此在选择方法时需要根据实际情况进行综合考虑。
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案活性氧检测是一种用于评估物质或生物体中产生的活性氧（ROS）水平的方法。
ROS是一类极具活性的氧化物质，可在正常细胞代谢中产生，并参与多种生理过程。
然而，当ROS的产生超过细胞的抗氧化能力时，就会导致氧化应激，对细胞和组织造成损害，并与一系列疾病的发生和发展相关。
为了测量活性氧的水平，可以使用一系列的试剂和方法。
以下是一个可能的活性氧检测实验方案：实验材料：1.活体组织样本（例如细胞培养物、小鼠肝脏组织等）2.PBS缓冲液3.DCFDA（二氟荧光二乙酸盐）染料溶液4.活性氧产生剂（例如H2O2）5.抗氧化剂（例如维生素C）6.血红素（免疫染色用）实验步骤：1.准备工作：a.将DCFDA溶液按照说明书的要求稀释到适当的浓度。
b.用PBS缓冲液洗涤和预处理样本，去除可能影响实验结果的其他物质。
2.观察基础水平：a.取一小部分样本，不加任何试剂，放入显微镜观察台下。
b.使用适当的增强型荧光显微镜观察样本的荧光强度和分布。
3.活性氧产生实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。
b.添加一定浓度的活性氧产生剂（例如H2O2），混匀。
c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。
d.记录荧光信号的强度和分布。
4.抗氧化剂实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。
b.添加一定浓度的抗氧化剂（例如维生素C），混匀。
c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。
d.记录荧光信号的强度和分布。
5.数据分析：a.使用图像分析软件测量荧光信号的平均强度和荧光染色的面积。
b.对每个样本的数据进行统计分析，如平均值、标准误差等。
c.使用统计学方法（如t检验或方差分析）比较不同处理组之间的差异。
总结：通过以上步骤，可以获得活性氧的水平，评估其在不同条件（如活性氧产生剂和抗氧化剂的存在与否）下的变化。
这个实验方案可以用于研究活性氧在细胞和组织中的作用，以及评估抗氧化剂的功效。
活性氧ROS分析试剂盒H2DCFDA
活性氧ROS 分析试剂盒 H 2DCFDA说明书修订日期说明书修订日期：：2015.07.13Cat number ：KGAF018Store at -20℃ for 6months ，避光For Research Use Only （科研专用）一、产品描述我们提供还原型具有细胞膜透性的ROS 荧光探针衍生物。
还原型与乙酰化形式的2'，7'-二氯荧光素（DCF ）是无荧光的乙酸酯基团，在胞内可以被酯酶氧化或水解，从而脱去，生成带电荷形式的探针。
利用合适的激发光源可以很方便地在各种检测平台上观察测量，如流式细胞仪、荧光酶标仪和荧光显微镜。
由于染料很容易受到光氧化，在进行实验时必须必须全程注意避光。
相比较其非羧基衍生物，羧基-H2DCFDA 带有额外的负电荷。
羧基-H2DCFDA SE 是带有一个氨基活性的琥珀酰亚胺酯基团,可与与胞内成分以共价形式更持久的结合。
二、产品包装三、操作说明制备储液工作液必须新鲜配制，实验结束即可丢弃稀释过的多余探针，染料在水溶液中更容易氧化分解，请尽快用完。
在最低探针加载浓度的条件下，本试剂盒提供的探针，可以满足切片或悬浮细胞（设置加载孵育液体积每个反应不超过2mL 的情况下）至少1000 TESTS 。
一般注意事项一般来说，只要能获得足够的荧光信号即可，尽量选择最小浓度的AM 酯，尽量减少AM 酯的水解副产物（甲醛和乙酸）的富集。
加载条件的选择尽可能考虑原有细胞的自然生长条件。
一些研究者给出的建议是：生理温度较之室温对于染料的加载效果更好。
综合考虑，我们推荐您在进行ROS 检测时，优先使用具有细胞膜透性的ROS 探针，如羧基-DCFDA 或者荧光素二醋酸（FDA ）。
加载探针1.1 制备活细胞悬浮液（106细胞/mL ）。
注意：对象是贴壁细胞的话，条件与悬浮细胞类似。
用PBS 稀释AM 加载溶液（参见步骤2）浸没贴壁细胞（或细胞爬片）。
1.2 用PBS 或者HBSS 稀释10mM 的AM 原液，制成AM 加载工作溶液（终浓度为1~10µM ）。
dcfh-da荧光探针分子式
dcfh-da荧光探针分子式全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：DCFH-DA荧光探针是一种常用于细胞活性氧（ROS）检测的荧光探针。
ROS是细胞内的一类活性氧化物质，在细胞内参与了氧化还原反应，同时也是一种细胞内信号分子，与细胞的生理功能和疾病发生密切相关。
DCFH-DA（2',7'-二氯二羟荧光素acethoxymethyl 酯）是一种无色、无味的脂溶性荧光探针，在细胞内可以被酯酶水解释放出荧光素荧光团。
DCFH-DA与ROS的检测原理基于氧自由基可在酶的催化下将非荧光物质氧化为荧光物质，因此该荧光探针能够在细胞内检测活性氧的水平。
DCFH-DA荧光探针的合成方法比较简单，通常是通过将2',7'-二氯荧光素（DCFH）与乙酰氧甲基化试剂（acethoxymethyl）在碳酸氢钠缓冲溶液中反应合成，再通过减压蒸馏或硅胶柱层析纯化得到目标产物。
DCFH-DA的荧光特性主要是在考察细胞内氧气活性时的上，其最大吸收波长在485 nm，最大发射波长为529 nm，发射光比较稳定，可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。
DCFH-DA荧光探针已经广泛应用于心血管疾病、神经退行性疾病等病理生理过程的研究中。
在心血管疾病中，ROS的水平与动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的发生发展相关。
研究人员通过DCFH-DA 荧光探针检测活性氧的水平，探索ROS与心血管疾病的关联，并希望通过抑制ROS的积累来减缓或治疗心血管疾病。
在神经退行性疾病中，如帕金森病和阿尔茨海默病，也发现ROS的水平升高。
科学家通过DCFH-DA荧光探针的应用，研究神经细胞中ROS的释放和清除机制，探索神经退行性疾病的发病机制。
第二篇示例：DCFH-DA是一种常用的荧光探针分子，通常应用于生物学研究领域。
它是一种非极性脂溶性分子，由于其能够在活细胞内被内切酯酶水解成为高度荧光的荧光染料，因此DCFH-DA广泛用于检测活细胞中的ROS（活性氧种）水平。
组织ROS及超氧化物检测
A: DCFH-DA法:测得是总活性氧,但对超氧化物不是非常灵敏.
1,取组织,用PBS或生理盐水冲洗一遍
2,按照1:500用无血清培养液稀释DCFH-DA(配好的探针需要避光放置)，24孔板每孔加入约3ml(以能完全浸没组织为准).37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
3,用无血清细胞培养液(或PBS)洗涤细胞三次，以充分去除未进入组织内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
4,用小动物成像仪在488nm激发波长，525nm发射波长处观察荧光信号.
注A::
1,托盘需要没有荧光背景或背景很低.
2,由于胎鼠组织不易拿到,如果用母鼠的脑的话建议考虑血脑屏障会不会引起探针进不去? 没有胎鼠组织的话建议选择母鼠的脑及肝作为预试组织。
DHE法: 测的是超氧化物.
1,取组织,用PBS或生理盐水冲洗一遍
2,按照1:200用无血清培养液稀释DHE(配好的探针需要避光放置)，24孔板每孔加入约3ml(以能完全浸没组织为准).37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
3,用无血清细胞培养液(或PBS)洗涤细胞三次，以充分去除未进入组织内的DCFH-DA。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
4,用小动物成像仪在535nm激发波长，610nm发射波长处观察荧光信号.(或者300nm激发波长，610nm发射波长)
注B:
1,托盘需要没有荧光背景或背景很低.
2,由于胎鼠组织不易拿到,如果用母鼠的脑的话建议考虑血脑屏障会不会引起探针进不去?
3.DHE与超氧化物反应后的产物有毒,操作过程中需要防护(戴手套,防止污染台面),用过的皿及枪头等垃圾建议分类处理.。
DCFHDA活性氧检测方法
DCFHDA活性氧检测方法DCFH-DA是2,7-二氯二氟荧光酮酰丙二酸对苯二酰肼的简称。
它是一种常用的活性氧检测分子，可用于检测细胞内和细胞外生成的活性氧物种，如超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基等。
下面介绍DCFH-DA活性氧检测的原理、操作步骤和应用。
原理：DCFH-DA分子是无色的，能够穿过细胞膜进入细胞内。
一旦进入细胞内，DCFH-DA会被内源酯酶迅速水解成无色的2',7'-二氯荧光酮酮基（DCFH），该分子对氧自由基不敏感。
当细胞内有活性氧物种存在时，这些活性氧物种（如超氧阴离子、过氧化氢等）会氧化DCFH为高度荧光的2',7'-二氯荧光酮基（DCF）。
DCF的荧光强度与活性氧物种的浓度成正比，因此可以通过测量DCF的荧光强度来间接测量活性氧物种的生成。
操作步骤：1.将DCFH-DA溶解在适当的有机溶剂（如二甲基亚砜、乙酸乙酯等）中制备为一定浓度的工作溶液。
2.将细胞或组织样品均匀洒在培养皿或载玻片上。
3.向细胞或组织样品中加入适量的DCFH-DA工作溶液，使其浓度达到合适范围（通常在1-10μM之间）。
4.将细胞或组织样品置于37°C的孵化箱中培养一定时间，通常为30分钟。
5.随后，用PBS或其他缓冲液洗涤样品，以去除细胞外的游离DCFH-DA。
6.在荧光显微镜下观察细胞的荧光图像，并使用适当的激发波长和发射波长测量荧光强度。
应用：DCFH-DA活性氧检测方法可以广泛应用于生物医学研究中，如研究细胞氧化损伤、炎症反应、抗氧化剂活性等。
此外，DCFH-DA还可用于评估药物的抗氧化性能、测量环境中的活性氧物种水平等。
这种方法具有快速、灵敏和简便的优点，广泛应用于细胞和分子生物学研究领域。
总之，DCFH-DA活性氧检测方法通过测量DCF的荧光强度来间接测量细胞内和细胞外活性氧物种的生成水平。
它是一种简单而有效的方法，可以广泛用于活性氧相关的研究和分析。
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产品号 BB-4101 BB-4102 BB-4201 BB-4202 BB-4203 BB-4204 BB-4131 BB-4133 BB-4122
产品 细胞周期检测试剂盒 JC-1 线粒体膜电位试剂盒 Caspase 3 活性检测试剂盒 Caspase 8 活性检测试剂盒 Caspase 9 活性检测试剂盒 Caspase 10 活性检测试剂盒 细胞凋亡形态学检测试剂盒 Rhodamine 123 染色试剂盒 AO/EB 双染试剂盒
产品简介： 活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧
化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 贝博活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针 DCFH-DA 进行活性氧检测的试剂盒。
DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解 生成 DCFH。而 DCFH 不能通透细胞膜，从而使探针很容易被标记到细胞内。在活性氧存 在的条件下，DCFH 被氧化生成荧光物质 DCF，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比， 检测 DCF 的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
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咨询邮箱：bestbio@
电话：021-33921235
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
产品说明书
检测： 对于原位标记探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光 光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光 度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。 使用 488nm 激发波长，525nm 发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF 的荧光光谱和 FITC 非常相似，可以用 FITC 的参数设置检测 DCF。
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产品 Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒 Annexin V-EGFP/PI 凋亡试剂盒 MTT 细胞增殖及毒性检测试剂盒 CCK-8 细胞增殖毒性检测试剂盒 WST-1 细胞增殖毒性检测试剂盒 MTS 细胞增殖与毒性检测试剂盒 Hoechst33342/PI 双染试剂盒 DAPI 染色试剂盒 细胞存活率检测试剂盒
产品说明书
ROS 活性氧检测试剂盒-DCFHDA 法
产品组成：
产品编号 规格 DCFHDA
活性氧阳性对照诱导剂
BB-47053 200-1000T
100ul 1000ul
储存条件： -20℃保存。
有效期： 一年。
注意事项： ● 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。 ● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管 底，避免开盖时试剂损失。 ● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。 ● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。 ● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清 洗并彻底清除残留清洁剂。 ● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。
产品号 BB-4104 BB-4105 BB-4106 BB-4107 BB-4108 BB-4112 BB-4123 BB-4137 BB-4132
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本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
在激发波长 502 nm，发射波长 530 nm 附近，使பைடு நூலகம்荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、 荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测 DCF 荧光，从而测定细胞内活性氧水平。
本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的检测。本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂，以 便于活性氧的检测。
产品特点： ● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式
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细胞仪检测； ● 背景低，灵敏度高； ● 线性范围宽，使用方便。
产品说明书
试剂盒以外自备试剂和仪器 ● 培养基 ● 移液器及吸头 ● 离心机 ● 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪， 激发波长500 ± 15 nm，发射波长530 ± 20 nm，或者按照FITC荧光检测条件检测。
探针标记： 原位标记：仅适用于贴壁培养细胞。按照 1:1000-2000 用无血清培养液稀释 DCFH-DA。 去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的 DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜， 通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1 毫升。37℃细胞培养箱内孵育 20 分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的 DCFH-DA。通常 活性氧阳性对照在刺激细胞 20-30 分钟后可以显著提高活性氧水平。 收集后标记：按照 1:1000 用无血清培养液稀释 DCFH-DA。细胞收集后悬浮于稀释好的 DCFH-DA 中，细胞浓度为 1*106-2*107/毫升，37℃细胞培养箱内孵育 20 分钟。每隔 3-5 分 钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除 未进入细胞内的 DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己研究的药物刺激细胞，或把细胞 等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照诱导剂在刺激细胞 20-30 分钟后可以显著提 高活性氧水平。仅在阳性对照孔中加入阳性对照诱导剂，其余孔不必加入。
使用方法：
使用注意事项： ● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液 体洒落。 ● 荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。 ● 探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标 记情况是否正常。 ● 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。 ● 对于药物作用时间较短(2 小时以内)的细胞，先标记探针，后用药物刺激细胞。对于药物作用时 间较长(6 小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照诱导剂或相应的药物刺激细胞，后标记探针。 ● 阳性对照诱导剂可以按照 1:1000 的比例使用。例如标记好探针的细胞共 1 毫升，可以加入 1 微升 的阳性对照诱导剂刺激。通常刺激后 20-30 分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于 不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后 30 分钟内观察不到活性氧 的升高，可以适当提高活性氧阳性对照诱导剂的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活 性氧阳性对照诱导剂的浓度。 ● 对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照 1:2000-1:10000 稀释 DCFH-DA。探针标记的时间也可以根据情况在 15-60 分钟内适当进行调整。