植物中活性氧的检测方法

·技 术 与 方 法·
生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００７ 年第 ５ 期
植物中活性氧的检测方法
祁艳 王冬梅
（ 河 北 农 业 大 学 生 命 科 学 学 院 ， 保 定 ０７１００１）
摘 要： 主要对超氧阴离子自由基（ Ｏ ２－·） 、过氧化氢（ Ｈ２Ｏ ２） 等活性氧的检测方法， 包括化学发光法、分光光度法、荧 光染色法， ＥＰＲ 波谱学方法、ＤＡＢ 组织染色法和电子显微技术检测法等进行了综述， 并简单介绍了最近发展起来的一些新 技术。
１．３ 荧光染色法 运用荧光染色技术可进行活体和离体亚细胞水
平的 Ｈ２Ｏ２ 检测。常用的荧光染料有 ２＇ ， ７＇ －二氯氢化荧 光 素 二 乙 酯 （ ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ， ＤＣＦＨＤＡ） 、 ４－ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ、７－羟－６ 甲 基 香 豆 素 （ ｓｃｏｐｏｌｅｔｉｎ） 、 Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（ Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－３， ７－ｄｉｈｙｄｒｏｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ） 及 高 香 草 醛 酸 （ ｈｏｍｏｖａｎｉｌｌｉｃ ａｃｉｄ） 等 。在 辣 根 过 氧 化 物 酶 的 催 化 下 ， Ｈ２Ｏ２ 可 氧 化 这 些 物 质 生 成 极 易 检 测 的 发 荧 光 的 物 质 ， 此 法 简 便 有 效 ， 应 用 广 泛 。有 研 究 者 用 荧 光染色法检测了豌豆（ Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ） 叶片衰老过程中 线 粒 体 、过 氧 化 物 酶 体 中 的 Ｈ２Ｏ２［１０］及 萝 卜 （ Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ） 种 子 在 萌 发 过 程 中 经 光 照 、ＧＡ、ＡＢＡ 调 控 下 Ｈ２Ｏ２ 的 释 放 ［１１］。 Ｏｒｏｚｃｏ－Ｃａ′ｒｄｅｎａｓ 等 ［１２］曾 用 Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ 定 量 检 测 了 番 茄 （ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ） 叶 片 提 取 液 中 的 Ｈ２Ｏ２。 本 研 究 室 陈 晓 波 ［１３］以 激 发 子－原 生质体简化实验系统模拟叶锈菌侵染小麦叶片的 互 作 体 系 ， 利 用 荧 光 探 针 ＤＣＨＦＤＡ 标 记 Ｈ２Ｏ２， 并 借 助 激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 （ ＣＬＳＭ） 来 研 究 植 物 抗 病 过 程 中 微 丝 骨 架 与 ＲＯＳ 的 关 系 ， 取 得 了 良 好 效 果 ； 笔者用该法成功检测了受叶锈菌侵染的小麦叶片 中 ＲＯＳ 的 变 化 （ 待 发 表 ） 。
关键词： 活性氧 检测方法 化学发光 分光光度 荧光染色
Ｄｅｔｅｒ ｍｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ
Ｑｉ Ｙａｎ Ｗａｎｇ Ｄｏｎｇｍｅｉ
（ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ， Ｂａｏｄｉｎｇ ０７１００１）
电子显微技术检测法应用比较广泛， 其原理是 Ｈ２Ｏ２ 与 氯 化 铈 （ ＣｅＣＩ３） 反 应 生 成 电 子 致 密 物 ， 然 后 在透射电镜下观察以 定位、定量 Ｈ２Ｏ２。Ｂｅｓｔｗｉｃｋ 等［１８］ 成 功 运 用 此 法 检 测 了 莴 苣 （ Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ） 受 丁 香 假 单 胞 杆 菌 菜 豆 致 病 变 种 （ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ． Ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ） 侵 染 诱 发 的 过 敏 性 反 应 （ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
鲁米诺作为一种有效的化学发光试剂目前仍 受到广泛应用。碱性条件下， 鲁米诺在催化剂（ 酶、 Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋和 Ｃｕ２＋等 过 渡 金 属 离 子 或 金 属 络 合 物 ） 作 用 下 与 溶 液 中 的 ＲＯＳ 发 生 氧 化 还 原 反 应 而 导 致 光 子 放 出 ， 据 此 可 间 接 检 测 ＲＯＳ。 本 研 究 室 借 助此法检测了小麦受叶锈菌侵染后细胞间隙液中 活 性 氧 的 变 化 （ 未 发 表 ） 。Ｉｍｋｅ Ｏｒｔｍａｎｎ 等 ［３］曾 利 用 鲁米诺化学发光体系考察了小麦悬浮细胞受激发 子 刺 激 过 程 中 Ｈ２Ｏ２ 的 产 生 情 况 。但 是 ， 鲁 米 诺 既 可 以 与 Ｈ２Ｏ２ 反 应 ， 也 可 与 １Ｏ２、Ｏ２－·及 ＯＨ·发 生 化 学 发 光反应从而导致了测定选择性差的问题， 因此许多
１ 植 物 体 内 ＲＯＳ 的 检 测 方 法
１．１ 化学发光法 化学发光法是活性氧检测中常用的实验技术，
其原理是化学发光试剂与活性氧反应生成激发态 的产物， 产物中的电子经非辐射性跃迁回到基态而 放出光子。常用的化学发光试剂有鲁米诺（ ｌｕｍｉｎｏｌ） 、 光 泽 精 （ ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ） 、甲 壳 动 物 荧 光 素 （ 如 海 萤 荧 光 素） 等。
荧 光 染 色 法 较 其 它 方 法 的 优 点 是 可 以 直 观 、简 便 地 进 行 Ｈ２Ｏ２ 的 亚 细 胞 定 位 ， 不 足 之 处 是 这 种 方 法 检 测 的 Ｈ２Ｏ２ 是 半 定 量 的 。此 外 ， 各 种 荧 光 探 针 渗 透能力不同， 可能在细胞的不同部位积累， 得出假 阳 性 结 果 。再 者 ， 荧 光 染 料 及 易 淬 灭 ， 因 此 观 测 必 须 快速以免影响实验结果。 １．４ 二 氨 基 联 苯 胺 （ ＤＡＢ） 组 织 染 色 法
海 萤 荧 光 素 （ Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ Ａｎａｌｏｇ， ＣＬＡ） 可 与 Ｏ２－·和 １Ｏ２ 发 生 特 异 化 学 发 光 反 应 ， 因 而 用 于 生 物 机 体 内 Ｏ２－·及 １Ｏ２ 的 检 测 。Ｔｏｍｏｎｏｒｉ Ｋａｗａｎｏ 等 ［５］在 研 究 水 杨 酸 （ ＳＡ） 诱 导 活 性 氧 （ ＲＯＳ） 产 生 及 胞 质 钙 离 子 浓 度 升 高 过 程 中 过 氧 化 物 酶 （ ＰＯＤ） 的 作 用 机 制 时 ， 成 功 运 用 此 法 检 测 了 烟 草 悬 浮 细 胞 中 Ｏ２－· 的 产 生 。 随 后 ， 有 研 究 者 ［６］开 发 了 一 系 列 选 择 性 较 高 的 化 学 发 光 试 剂 ， 其 中 包 括 Ｃ ＬＡ 的 类 似 物 ＦＣＬＡ （ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｙｌ Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ Ａｎａｌｏｇ） 。 ＦＣＬＡ 发 光 效 率 较 ＣＬＡ 大 有 提 高 ， 因 此 用 其 进 行 生 物 样 品 中 Ｏ２－·和 １Ｏ２ 的 测 定 时 增 强 了 检 测 方 法 的 灵 敏 度 。 １．２ 紫外－ 可见吸收分光光度法
活 体 中 ＲＯＳ 的 直 接 检 测 对 于 解 释 生 命 机 体 的 各 种 生 理 反 应 有 着 重 要 的 意 义 。目 前 能 够 用 于 解 决 该问题的方法比较有限， 已报道的有电子顺磁共振 技 术 （ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ， ＥＰＲ） ， 又 称 电 子 自 旋 共 振 技 术 （ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｓｐｉｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ， ＥＳＲ） 。 ＥＰＲ 是 一 种 检 测 自 由 基 的 波 谱 学 方 法 ， 可 以 直 接 检 测 Ｏ２－·，·ＯＨ 等 活 性 氧 自 由 基 及 参 与 其 形 成 的 过 渡 金 属 离 子 的 化 学 变 化 ［１， ２］， 因 此 该 法 受 到 植 物 界 工 作 者 的 广 泛 关 注 。下 面 对 目 前 实 验 室 中 所 用 到 的 检 测 植 物 体 内 ＲＯＳ 的 方 法 逐 一 进 行 介 绍 。
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祁艳等： 植物中活性氧的检测方法
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情况下依赖鲁米诺的化学发光法只能作为定量或
者定性分析的辅助手段。 光 泽 精 （ ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ） 是 一 种 使 用 较 早 的 化 学 发 光
试 剂 ， 碱 性 条 件 下 可 与 Ｈ２Ｏ２、Ｏ２－·等 过 氧 化 物 反 应 生 成 激 发 态 的 Ｎ－甲 基 吖 啶 （ Ｎ－ｍｅｔｈｙｌａｃｒｉｄａｎ） 。相 对 鲁米诺而言， 光泽精对于活性氧测定的选择性较 高 ， 有 报 道 ［４］指 出 光 泽 精 只 有 在 Ｏ２－·存 在 下 产 生 发 光 现 象 ， 但 Ｈ２Ｏ２ 也 可 分 解 产 生 Ｏ２－·， 因 此 难 以 定 性 地判断检测结果。
ＮＢＴ 在 Ｏ２－·的 作 用 下 还 原 生 成 不 溶 于 水 的 蓝 色 甲 臢 染 料 ， 此 法 测 定 灵 敏 度 高 ， 常 用 于 Ｏ２－·的 组 织 化 学 定 位 。Ｆｒｙｅｒ 等［７， ８］运 用 这 种 方 法 检 测 了 光 胁 迫 下 拟 南 芥 叶 片 中 Ｏ２－·的 产 生 。 由 于 甲 臢 不 溶 于 水， 长时间放置会生成不均一的沉淀物， 因而难以 用 于 测 定 细 胞 或 者 水 溶 液 体 系 中 Ｏ２－·随 时 间 推 移 而发生的变化。为了克服这个问题， 水溶性四唑盐 的 研 究 应 运 而 生 。Ｈｉｒｏｙｕｋｉ ＵＫＥＤＡ 等［９］发 现 水 溶 性 四 唑 盐 如 ＸＴＴ， ＷＳＴ－１， ＷＳＴ－８ 适 合 于 Ｏ２－·的 检 测 ， 其 中 ＷＳＴ－１ 灵 敏 度 高 、氧 化 态 的 吸 光 度 低 、水 溶 性 好 ， 效 果 较 ＸＴＴ 和 ＷＳＴ－８ 更 胜 一 筹 。
紫 外－可 见 吸 收 分 光 光 度 法 中 最 常 用 的 方 法 有 细 胞 色 素 Ｃ（ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ） 的 Ｏ２－·还 原 法 和 氮 篮 四 唑 （ ｎｉｔｒｏ ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ， ＮＢＴ） 还 原 法 。
具 有 氧 化 活 性 的 细 胞 色 素 Ｃ 被 Ｏ２－·还 原 而 生 成 于 波 长 ５５０ｎｍ 处 有 强 吸 收 的 亚 铁 细 胞 色 素 ， 以 此 来 检 测 Ｏ２－·的 产 生 。由 于 细 胞 色 素 Ｃ 很 容 易 被 其 他 还原剂所还原， 因此一般情况下此法难以准确用于 Ｏ２－·的 定 性 分 析 。
收稿日期： ２００７－０３－３０ 基金项目： 国家自然科学基金资助项目（ Ｎｏ．３０６７１２４４） ； 植物生理学与生物化学国家重点实验 室开放课题资助项目（ Ｎｏ．ＰＰＢ０４００６） ； 河北省自