体外纯化乳鼠许旺细胞的4种方法比较
小鼠乳鼠培养方法 Microsoft Word 文档
小鼠乳鼠心肌细胞培养物品：手术器械（眼科剪2把、眼科镊2把、手术镊1把）、培养皿4个、小烧杯2个、离心管4个、200目筛网、6孔板、垃圾桶、一次性吸管、加液枪（配各型号枪头）、75%酒精试剂：D-Hanks液2瓶（其中一瓶在操作前37℃预热）、2.5％胰酶消化液、加有FBS（浓度为10％）的DMEM培养基、Brdu、1％明胶、0.4％台盼蓝液操作程序：1、将备用物品（手术器械、培养皿、烧杯、离心管、200目筛网）进行高压灭菌2、用酒精擦拭层流台，将高压灭菌后的物品放入层流台，紫外线消毒30分钟3、将1％明胶加入六孔板中（每孔1ml）4、用镊子夹住小鼠颈部将小鼠在酒精中浸泡两次，每次2-3秒5、将消毒后的小鼠放入培养皿中，用剪刀将小鼠头部剪去，并将胸部剪开暴露出心脏，用另一个剪刀将小鼠心脏剪下放入装有预冷的D-Hanks液的培养皿中，将心脏剪开清洗残留的血液。
6、将心肌组织转移至另一个装有预冷的D-Hanks液的培养皿中进一步剪碎心脏后，加入等体积的2.5％胰酶。
7、将心肌组织转移至离心管中，反复吹打10min,静置2min后，弃上清。
8、再次加入D-Hanks液和等体积的2.5％胰酶，常温下反复吹打10min，静置2min后将上层液转移至100ml容器中，加入含10%FBS的M199培养基或DMEM培养基终止消化9、重复上一步骤至组织完全消化，适当控制消化时间10、用200目筛网过滤得到细胞混悬液，转移至10ml离心管。
11、以300g室温离心5min12、弃去上清后加入DMEM+Brdu培养基吹打，转移至50ml培养瓶中后放入37℃ 5% CO2培养箱进行差速贴壁1h13、将六孔板中的明胶吸出14、计数心肌细胞15、按六孔板细胞数（4~5×105个/每孔）加入细胞悬液，并添加M199+Brdu培养基或DMEM+Brdu培养基至3ml16、至置培养箱37℃5% CO2培养箱培养。
17、24h后换液，培养基改用不含5-BdrU的培养基继续观察培养。
可见到部分细胞呈扁平状透光性强形...
ＡＣＢＤ图１．１Ａ：组织块培养法种植４８小时后组织块中可见到有细胞爬出，部分许旺细胞（ＳＣ）为圆形，体积小，胞浆少，多数呈双极型，少数为三极状，细胞折光性较强。
成纤维细胞（ＦＢ）胞体较大，扁平暗淡细胞里多角形或不规则。
（×１６０）Ｂ；７２小时后檀块周固见细胞数量增多，分布均匀。
（Ｘ】６０）Ｃ：５－６天组织块周围细胞汇台成片。
（×１６０）Ｄ：７天后在倒置显微镜下观察ＳＣ细胞密度增高，在植块周围放射状向外生长，多数细胞为取极状．胞体缅长，ＦＢ也大量增殖．细胞甸空隙少。
（ｘ１６０）ＡＣＢＤ圈１－２Ａ：ＳＣ经酶消化后呈圆形相互散开，接种４８小时后细胞贴壁，细胞分布均匀，多数为椭圆形．少数细胞呈长梭形或三角形。
（×６０）Ｂ：７２小时ｓｃ多数呈细长双极状，端对端排列。
（×１００）Ｃ：５天后细胞生长旺盛，大量增殖．细胞聚合现象较为多见，形成大小不等的细胞团块。
（ｘ６０）Ｄ：７天后ｓｃ数量更多，细胞排列更加紧密，并可见到较多的细胞代谢产物。
（×１００）ＡＣＢＤ圜１－３Ａ：乳鼠ＳＣ培养一周后倒置显微镜Ｆ观察，Ｓ－１００染色前（×１６０）Ｂ：Ｓ－１００蛋白酶联免疫化学染色，普通光学显微镜下观察，ｓｃ呈圆形或梭形，分布均匀（Ｘ４０）ｃ：ｓｃ胞体及突起呈棕褐色，ＦＢ核大，胞体１；着色。
（ｘ１６０）Ｄ：倒置显微镜下观察ｓｃ呈长梭形，两端突起纤长，胞体和突起均被染成棕色，ＦＢ扁平来着色，为不规则多角形，呈透明状。
（）（２００）－１３－ＡＢ圈２－１Ａ：ＳＣ与单丝联合培养．ｓｃ沿着材料单丝迁移，井将单丝包裹．多散ＳＣ捧列成链状，并可见到ＳＣ重叠生长（“０）Ｂ：有些Ｓｃ分敞排列于纤维的一侧或两倒（ｘ１００）ＣＤ图２．２Ｃ：ＳＣ沿着纵行的ＰＧＬＡ纤维呈链状向远处延伸（ｘ１６０）Ｄ：ＳＣ在甲壳素涂层的ＰＧＬＡ单丝上贴附紧密．细胞呈双楹形或圆形（）（２００）．１Ｂ．ＡＢ圈３．１Ａ：自梨状肌下缘切除１０ｍｍ长坐骨神经。
乳鼠心肌细胞的培养
乳鼠心肌细胞的培养配液：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。
取鼠：鼠盆用棉铺好，取鼠。
准备：事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。
其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。
新洁尔灭（0.1％）泡纱布（用10ml5％的新洁尔灭加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液）。
用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
物品：白大衣、饭盒小剪子、小镊子（4套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织，一套剪碎心脏）瓶皿（2套）[两个小圆培养皿，培养皿内加DMEM液，先后装取出的心和剔出纤维组织后的心] [一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]250ml烧杯3个[一个用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸] [一个装0.1％新洁尔灭150ml左右，消毒小鼠]500ml烧杯1个，用作废液缸。
50ml烧杯3个（剪碎心肌组织，最后配液）三角烧杯（50ml）+小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压）离心管及帽（12-14个），两个试管吸管（5~8个）大镊子（两把，持物，例夹棉球等）台面：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装0.1％新洁尔灭浸泡）、试管架、泡沫塑料板、五个针头（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、3个250ml烧瓶（一个装一蒸水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用）1个500ml烧瓶（废液缸）、温度计、PH试纸（事先调PH值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10个）[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml 6个（胰酶、DMEM、小牛血清）1ml 2个（双抗液）20ml备用2个、微量加样器1000ml及500ml以上物品均用紫外线照30分钟。
另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机+一把小锁、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。
干细胞-许旺细胞-遗传霉素(G418)纯化许旺细胞过程中成纤维细胞胞浆空泡化的光镜观察
中国组织工程研究第16卷第14期 2012–04–01出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research April 1, 2012 Vol.16, No.14 ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH2593 Department of Orthopedics, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, ChinaChen Bao★, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, Chinayunqingcb@ Corresponding author: WangGuang-lin: Doctor, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, Chinawglfrank@ Supported by: the National Natural Science Foundation of China,No.30772204* Received: 2011-12-12 Accepted: 2012-01-20遗传霉素(G418)纯化许旺细胞过程中成纤维细胞胞浆空泡化的光镜观察*★陈宝，史晓远，向宁，王光林Cytoplasm vacuolization of fibroblasts during purification of Schwann cells by geneticin (G418): An optical microscope observation and analysisChen Bao, Shi Xiao-yuan, Xiang Ning, Wang Guang-linAbstractBACKGROUND: Geneticin (G418) combined with differential adhesion method and differential detachment method are used toeliminate the contaminated fibroblasts in the purification of Schwann cells. Most of the researches prefer to describe purity ofSchwann cells, rather than give a description of cell morphology change and its probable cause during the purification process.OBJECTIVE: To describe the pathological changes of fibroblasts through the morphological photos of purified fibroblasts andSchwann cells at different time points taken by optical microscope.METHODS: Schwann cells were isolated from sciatic nerves of rats by geneticin (G418) combined with differential adhesionmethod and differential detachment method in primary cultivation. The cultivated cells were divided into two groups. In theexperimental group, the cells were transferred to another 6-well plate after once differential adhesion, and the waste productaccumulated medium was changed to fresh basal medium every 2 days, the differential detachment method was used topassage. In the control group, cells were given differential detachment once again and transferred to another 6-well tissue cultureplate, and the waste product accumulated medium was changed to fresh purification medium every 2 days, the differentialdetachment method was used to passage. Cytopathologic changes of fibroblasts in different periods were observed by opticalmicroscope.RESULTS AND CONCLUSION: Cytopathologic changes of fibroblasts could not be observed under optical microscope in earlystage of the purification, the proliferation of the fibroblasts was decreased and the cytoplasm vacuolization of fibroblasts wasobserved obviously after cells were sub-cultured for three times or more (three to four weeks). Fibroblast proliferation wasrestricted in early stage of the Schwann cells purification process by geneticin (G418), but cytoplasm vacuolization of fibroblastsdelayed to the third generation or more.Chen B, Shi XY, Xiang N, Wang GL.Cytoplasm vacuolization of fibroblasts during purification of Schwann cells by geneticin(G418): An optical microscope observation and analysis.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(14): 2593-2596.[ ]摘要背景：以往研究应用遗传霉素(G418)联合差速贴壁及差速分离法除去成纤维细胞用于许旺细胞的纯化，对纯化过程中成纤维细胞形态变化的描述及可能其原理的推测很少。
naoh法提取鼠尾dna的原理
naoh法提取鼠尾dna的原理宝子！今天咱们来唠唠NaOH法提取鼠尾DNA的原理，这可超有趣的呢！咱先说说鼠尾，你看那小小的鼠尾，里面可是藏着好多秘密，就像一个小宝藏盒，而DNA就是其中超级珍贵的宝贝。
那NaOH在这个提取过程里就像是一个超级英雄。
NaOH啊，它是一种强碱。
当我们把鼠尾放到有NaOH的溶液里时，就像是给鼠尾来了一场特别的“洗礼”。
鼠尾的细胞呢，外面都有一层细胞膜，这细胞膜就像一个小卫士，守护着细胞里面的各种东西，包括我们想要的DNA。
但是呢，NaOH可不管这个小卫士有多厉害，它会和细胞膜里的一些成分发生反应。
细胞膜主要是由磷脂双分子层构成的，还有一些蛋白质啥的。
NaOH就像一个调皮的小捣蛋，它会把磷脂双分子层给打乱，就像把一堆整整齐齐的小积木给弄乱了一样。
那些蛋白质呢，也被NaOH搞得晕头转向，结构都被破坏啦。
这么一来，细胞膜就被攻破了，细胞里面的东西就都能跑出来了。
细胞里面有好多东西，像蛋白质啊，RNA啊，还有我们心心念念的DNA。
可是这时候它们都混在一起，就像一锅大杂烩。
但是呢，DNA相对来说比较稳定。
它的结构是双螺旋的，就像一个超级精致的小螺旋楼梯。
在这个碱性的环境里，其他的物质可能会被NaOH进一步影响，比如说一些蛋白质会被水解。
这就好比在一群小伙伴里，有些小伙伴比较脆弱，在这种特殊环境下就被改变了，而DNA就像一个坚强的小战士，还稳稳地保持着自己的状态。
然后呢，我们会进行一些后续的操作。
比如说，我们会调节溶液的酸碱度。
因为NaOH让溶液变得太碱了，DNA虽然稳定但也需要一个合适的环境呀。
我们就会加入一些酸性的物质来中和。
这就像是给这个混乱的小世界重新建立秩序一样。
当酸碱度合适的时候，DNA就更容易被我们分离出来。
而且啊，在这个过程中，我们可能还会用到一些其他的试剂或者操作来进一步纯化DNA。
比如说离心，就像把不同重量的东西分开一样。
那些被破坏的细胞膜碎片啊，被水解的蛋白质啊，就会和DNA分离开来。
体外培养雪旺氏细胞三种方法的比较
体外培养雪旺氏细胞三种方法的比较【摘要】目的找到一种适合修复周围神经缺损要求的雪旺氏细胞培养方法。
方法分别采用三种不同方法进行雪旺氏细胞培养,并比较各种方法培养的雪旺氏细胞的生长情况及纯度。
结果先用酶消化后组织块贴壁培养的的方法,雪旺氏细胞“爬出”速度较直接组织贴壁培养方法快,但较直接酶消化法慢,而纯度均较其他二种方法高。
结论先用酶消化组织块,后再将组织块贴壁培养的方法【关键词】雪旺氏细胞;体外培养;新方法雪旺氏细胞是周围神经的一种胶质细胞,是周围神经的髓鞘细胞,排列成串,一个一个的包裹着周围神经轴突,其外面包有一层基膜。
在有髓神经纤维中,雪旺氏细胞形成神经的髓鞘,是周围神经系统的髓鞘形成细胞,在周围神经再生中起重要的作用,对于周围神经缺损修复有重要的意义。
故体外培养雪旺氏细胞是神经生物学研究的一个重要方面。
本文作者通过对三种不同方法培养出雪旺氏细胞的速度和纯度进行比较,找到一种简易的、稳定的、受外界影响小的、高纯度、大数量的雪旺氏细胞培养法。
1材料与方法1.1设备及试剂普通显微镜、显微手术器械、CO2培养箱(德国产)以及普通细胞培养器材一套,直径50mm一次性培养皿(德国生产)若干个,D-Hank,s液,含10%胎牛血清(杭州四季青产)的F12(Hyclone产)+DMEM(Gibco产)培养液(F12+DMED=1∶1),IV型胶原酶(Gibco产),胰蛋白酶(Sigma公司),EDTA(华美公司)。
1.2雪旺氏细胞的取材注射过量的水合氯醛处死出生3d的SD乳鼠6只,浸于75%医用酒精消毒3min,取出用无菌D-Hank,s液反复冲洗4次,在无菌条件下取出坐骨神和臂层神经,解剖显微镜下仔细剥除神经基膜,再用D-Hank,s液反复冲洗3次,用显微手术剪,将组织块剪成约2mm长的组织碎块,再用D-Hank,s液反复冲洗3次,吸干,置于一次性离心管中。
1.3雪旺氏细胞的培养1.3.1酶消化、组织块贴壁培养往上述离心管中加入等体积0.5%的胰蛋白酶和0.06%IV型胶原,使二者的总体积约为组织块体积的4倍。
体外诊断试剂胶乳比浊法学习
体外诊断试剂胶乳比浊法学习胶乳免疫比浊法相关知识很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目，关注胶乳标记技术的技术人员越来越多。
本人总结了部分胶乳微球标记技术，并加以分类，以便朋友们查阅：胶乳微球物理吸附：反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。
磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka 大约为2，因此在酸性pH保持稳定。
醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。
羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定。
带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。
这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。
疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球）。
醛基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。
虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。
一般，在被吸附蛋白等电点附近pH时，物理吸附效率会很高。
反应步骤：1.用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml；2.用反应缓冲液系数胶乳微球到1%；3.将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中，10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。
室温搅拌孵育2hr；4.离心或超滤，除去未结合蛋白；5.将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解。
注意事项：1.最优蛋白标记量影响因素1）有效比表面积：粒径减小时，比表面积/mg微球值得增加；2）胶体稳定性：蛋白对胶乳有稳定和去稳定作用；3）免疫反应：最近标记量由免疫反应需要决定。
2.胶乳微球中加入蛋白后，快速搅拌混合，利于反应均衡。
反应体积是1ml时，可用移液器吸取蛋白加入微球中，并吹打数次。
如果反应体积较大时，用烧杯，边搅拌边加入蛋白，3.储存缓冲液和反应缓冲液不同时，抗体有脱落的可能；4.表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落，所以应避免加入。
小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法研究进展
小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法研究进展摘要综述了有关于小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法的研究进展,阐述了乳腺细胞培养的意义,介绍了乳腺组织原代培养的过程,并分析了所取得的研究成果。
关键词小鼠;乳腺上皮细胞;原代培养;细胞工程原代培养即直接从有机体摘取细胞、组织或器官,使其在体外维持与生长。
合适的培养条件对体外培养细胞的生存和增殖都十分重要。
一般而言,不同动物、不同组织器官来源的细胞对培养条件的要求存在一定差异,因此,需要使体外环境下的培养条件尽可能地模拟体内环境。
体内乳腺组织的增殖、分化和组织结构重塑受内环境(如类固醇、生长因子、结合蛋白及细胞外基质间复杂的相互作用等)因素的影响和作用,这些因素同样也影响体外培养乳腺上皮细胞的增殖分化和功能表现。
对于某种动物特定组织细胞的体外培养,对培养液、添加因子、附着底物及培养温度、pH值等都需进行仔细的选择,乳腺上皮细胞的体外培养建立在乳腺上皮原代培养细胞的基础上,针对不同的研究目的应采取不同的培养方法,以对细胞进行分化诱导。
张以涛比较了不同pH值、不同血清浓度配比的生长培养液对小鼠乳腺上皮细胞生长的影响,结果表明, pH值7. 4含10%血清的培养基为最佳生长液。
现代研究普遍认为,内分泌激素在乳腺上皮细胞发育各个阶段都发挥影响作用,不同时期乳腺组织的形态、组成及功能均有差异,这对选择乳腺上皮细胞体外培养的取材时间有指导意义。
张以涛比较了取自不同时期乳腺上皮细胞的生物学特性,得出妊娠期细胞生存、增殖能力均强于泌乳期细胞,妊娠期小鼠乳腺为获得细胞的最佳取材时期。
乳腺上皮细胞的原代培养,首先是尽可能地分离出乳腺上皮细胞,同时减少分离过程对细胞的损伤和浪费,以及通过采用一定的方法,使最终得到富集的乳腺上皮细胞及杂质细胞尽可能少甚至被完全清除。
1乳腺细胞培养的意义将动物细胞或组织在体外进行培养,能有效排除神经体液等因素对其造成的影响,可直接进行药物对细胞的活动代谢、毒性和杀伤作用等检测,如秦君等以王不留行为试验材料,对其3类主要成分(皂甙类、黄酮甙类及香豆素类)进行提取,分别以不同浓度添加到细胞培养液中,寻找王不留行促进泌乳的有效成分。