干细胞条件培养液促进小鼠卵母细胞体外成熟

ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＡＮＡＴ０ＭＹ　Ｖｏｌ＿３５　Ｎｏ．３　２０１２　解剖学杂志２ｏ１２年第３５卷第３期　干细胞条件培养液促进小鼠卵母细胞体外成熟　宣恒华　冯定庆　刘　然　赵卫东△　（安徽医科大学，１附属省立医院妇产科，２分子医学实验室，合肥２３０００１）　

摘要　目的：研究骨髓问充质干细胞（ＭＳＣｓ）条件培养液对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟的作用。方法：分离、培养小鼠　ＭＳＣｓ，获得ＭＳＣｓ条件培养液。收集３类生发泡期卵母细胞，分别在对照培养基和条件培养液中培养，观察卵母细胞成熟　率，判断最佳时间点；ＦＤＡ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８和ＰＩ联合染色评价细胞活力；荧光标记检测皮质颗粒分布、迁移及纺锤体复合　物的形成情况。结果：条件培养液组３类生发泡期卵母细胞的成熟率高于对照培养基组；其中，完全／大部分裸露的生发泡　卵母细胞和周围有疏松的颗粒细胞包裹的生发泡卵母细胞的最佳体外成熟时间为１６　ｈ，有完整的数层颗粒细胞紧密包裹　的生发泡卵母细胞的最佳体外成熟时间为２４　ｈ。体外成熟卵母细胞活力良好，皮质颗粒分布及纺锤体复合物形成与体内　成熟卵母细胞一致。结论：ＭＳＣｓ条件培养液有利于小鼠体外成熟卵母细胞核、细胞质同步成熟，提高卵母细胞质量，是一　种较好的体外成熟培养体系。　关键词　卵母细胞；间充质干细胞；体外成熟；皮质颗粒；纺锤体　

Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｂｅｎｅｆｉｔｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｏｏｃｙｔｅｓ　Ｘｕａｎ　Ｈｅｎｇｈｕａ　～，Ｆｅｎｇ　Ｄｉｎｇｑｉｎｇ　，Ｌｉｕ　Ｒａｎ　～，Ｚｈａｏ　Ｗｅｉｄｏｎｇ　△　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ，２．Ａｎｈｕｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　Ａｎｈｕｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　Ａ｛｛ｔｌｉａｔｅｄ　ｔｏ　Ａｎｈｕｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ　２３０００１，Ｃｈｉｎａ、　

Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ（ＣＭ）ｏｆ　ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ（ＭＳＣｓ）ｏｎ　ｔｈｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｉｒｎｍａｔｕｒｅ　ｏｏｃｙｔｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ＭＳＣｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｔＯ　ｈａｒｖｅｓｔ　ＣＭ．Ｔｈｒｅｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｏｏｃｙｔｅｓ　ｆｒｏｍ　ｉｍｍａｔｕｒｅ　ｇｅｒｍｉｎａｌ　ｖｅｓｉｃｌｅ（ＧＶ）ｓｔａｇｅ　ｗｅｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，　Ｓｔｅｍｐｒｏ）ａｎｄ　ＣＭ（Ｉ　Ｍ，ＳＣＭ）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｔｉｍｅ　ａｎｄ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ（ＩＶＭ）ｗｅｒｅ　ｓｕｒ　ｖｅｙｅｄ、Ｏｏｃｙｔｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＦＤＡ），Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８　ａｎｄ　ｐｒｏｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｃｅｌ１　ｖｉ　ａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅ　ｂｅｈａｖｉｏｒｓ　ｏｆ　ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｇｒａｎｕｌｅｓ（ＣＧ）ａｎｄ　ｓｐｉｎｄｌｅ　ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｕｎｄｅｒ　ａ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．Ｒｅ—　ｓｕｌｔｓ：Ｔｈｒｅｅ　ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ　ｏｆ　ＧＶ　ｏｏｃｙｔｅｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ＣＭ　ｗｅｒｅ　ａｌｌ　ａｃｈｉｅｖｅｄ　ａ　ｈｉｇｈｅｒ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｂａｓａｌ　ｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｗｒｅ　１　６　ｈ　ｆｏｒ　ｏｏｃｙｔｅｓ　ｏｎｌｙ　ｏｒ　ｓｕｒｒｏｕｎｄｅｄ　ｂｙ　ｌｏｏｓｅ　ｇｒａｎｕｌｏｓａ，ｗｈｉｌｅ　２４　ｈ　ｆｏｒ　ｏｏｃｙｔｅｓ　ｓｕｒｒｏｕｎｄｅｄ　ｂｙ　ｉｎｔａｃｔ　ｇｒａｎｕｌｏｓａ　ｃｅｌｌｓ　ｌａｙｅｒｓ．Ｏｏｃｙｔｅｓ　ｋｅｐｔ　ａ　ｇｏｏｄ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ＣＭ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ＩＶＭ．Ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＧ　ａｎｄ　ｍｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｐｉｎｄｌｅ　ｗａｓ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｉｎ　ＩＶＭ　ｏｏｃｙｔｅｓ，ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｗｅｌｌ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｍａｔｕｒｅｄ　ｏｏｃｙｔｅｓ　ａｎｄ　ｓｈｏｗｅｄ　ｇｏｏｄ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｏｆ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　ＭＳＣｓ　ｉｓ　ａｎ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ＩＶＭ　ｓｙｓｔｅｍ，　ｗｈｉｃｈ　ｂｅｎｅｆｉｔｓ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｄ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ＩＶＭ　ｏｏｃｙｔｅｓ　ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓｌｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｏｏｃｙｔｅｓ；ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ；ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｇｒａｎｕｌｅ；ｓｐｉｎｄｌｅ　

体外成熟技术获取成熟的卵母细胞，为多囊卵巢、　卵巢功能早衰，以及因病需要切除卵巢的年轻患者提　供了生殖的机会。自１９９１年Ｃｈａ等首次报道未成熟　卵子体外培养成熟技术获得成功以来，体外成熟技术　日臻成熟，但仍然存在受精率低、胚胎移植后妊娠率低　等现象，究其原因还是由于尚未建立理想的培养体系　致使卵母细胞核质成熟不同步ｌ１］。以往的体外成熟体　国家自然基金（３０９０１６０６）；安徽省科技攻关计划（０８０１０３０２１０１）；安徽　省自然科学基金（１１０４０６０６Ｍ１７６）　第１作者Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｕａｎｈｅｎｇｈｕａ＠１　６３．ｃｏｒｎ　△通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｖｉｃｔｏｒｚｈａｏ＠１６３．ｃｏｍ　收稿日期：２０１１－１０—２６；修回日期：２０１２—０２—１４　２７２一　系是向基础培养基中添加血清、白蛋白、各种细胞因子　和激素等［２］，一定程度上提高了体外成熟效率，但仍然　存在卵母细胞成熟率低和核浆成熟不同步等不足。理　想的体外成熟培养体系应该具有获取便利、富含多种　细胞因子、并接近卵母细胞体内发育的微环境等特性。　骨髓问充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｉｌｓ，ＭＳＣｓ）　可以合成、分泌多种细胞因子，对造血细胞发挥支持、　营养作用，其中很多细胞因子是卵母细胞发育成熟所　必需的。本课题组前期的研究表明，ＭＳＣｓ条件培养液　能够促进小鼠卵巢组织中卵母细胞发育、成熟及胚胎　的发育＿３］。在此基础上，本实验通过观察３类小鼠生发　泡（ｇｅｒｍｉｎａｌ　ｖｅｓｉｃｌｅ，ＧＶ）卵母细胞在条件培养液　（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ，ＣＭ）中的成熟率、细胞活力及　核、质成熟同步情况，进一步评价条件培养液在卵母细　胞体外成熟（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ＩＶＭ）中的作用。　１材料和方法　１．１　实验动物　４～６周龄雌性小鼠，体质量１８￣２５　ｇ，由安徽医科　大学实验动物中心提供。饲养环境室温２０℃～２５℃，　湿度５０　～６０　，维持１２　ｈ的光照循环（８：Ｏ０～　２０：００），动物自由摄食摄水。　１．２主要试剂　ＤＭＥＭ、胎牛血清（ＦＣＳ）均为美国Ｇｉｂｃｏ公司产　品；Ｓｔｅｍ　ｐｒｏ一３４培养基为美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ产品；Ｍ１６　培养基、Ｍ２培养基、透明质酸酶、牛血清白蛋白　（ＢＳＡ）、ＦＩＴＣ标记的小扁豆凝集素（ＬＣＡ）、二乙酸荧　光素（ＦＤＡ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８均为Ｓｉｇｍａ公司产品；Ｐｅｒ—　ｃｏｉｌ为Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司产品；蛋白酶Ｅ和ＰＩ　为ＢｉｏＳｈａｒｐ公司产品；抗荧光淬灭封片液购自碧云天　公司；ＨＣＧ、ＰＭＳＧ为杭州动物药品厂产品。　１．３　ＭＳＣｓ条件培养液的制备　颈椎脱臼法处死雌鼠，无菌条件下取出股骨和胫　骨，ＤＭＥＭ反复冲洗骨髓腔；收集冲洗液缓慢加到　６Ｏ　ｐｅｒｃｏｌｌ液面上，８００ｘｇ离心２０　ｒａｉｎ；收集两个液　面间云雾状的单个核细胞，ＰＢＳ洗涤２次后用含１Ｏ　ＦＣＳ的ＤＭＥＭ重悬，５×１０　／ｍｌ密度接种培养瓶，２～　３　ｄ后换液弃去未贴壁的细胞，获得原代ＭＳＣｓ。当Ｆ１　代ＭＳＣｓ长到９Ｏ　铺满培养瓶底时，用含１０　ＦＣＳ的　ＤＭＥＭ换液，继续培养４８　ｈ后收集上清即为ＤＣＭ。同　样的方法，Ｆ１代ＭＳＣｓ长到９０９，６铺满培养瓶底时，用无　血清干细胞培养基Ｓｔｅｍｐｒｏ－３４换液，４８　ｈ收集的上清即　为ＳＣＭ；ＤＣＭ和ＳＣＭ经０．２　ｍ滤膜过滤备用。　１．４　卵母细胞采集、分类及体外成熟　雌鼠腹腔注射ＰＭＳＧ　７．５　ＩＵ，４４￣４６　ｈ颈椎脱臼　法处死，取出双侧卵巢，在体视显微镜下用２７　Ｇ针头　刺破卵泡，收集生发泡期卵母细胞。按照颗粒细胞的　包裹层数将未成熟卵分为３类（图１）；（１）卵母细胞完　全／大部分裸露；（２）卯母细胞周围有疏松的颗粒细胞　包裹；（３）卵母细胞周围有完整的数层颗粒细胞紧密包　裹。３类卵母细胞分别放入经３７℃、ＣＯ。孵箱中平衡　２～６　ｈ的ＭＳＣ　条件培养液ＤＣＭ和ＳＣＭ中培养，其　对应的对照组培养液分别为ＤＭＥＭ和Ｓｔｅｍｐｒｏ－３４，分　别在不同时间点观察卵母细胞成熟率及核、质成熟情　况。每一组中每类卵母细胞每次实验的观察数为３Ｏ～　４０个。ＰＭＳＧ／ＨＣＧ联合促排获取，收集ＭⅡ卵母细　胞作为体内成熟对照。本实验所有操作均在恒温载物　台（３７℃）上进行。　１．５二乙酸荧光素（ＦＩ）Ａ）染色检测细胞活力　ＦＤＡ染色检测细胞活力方法参照Ｔｓａｉ的方法Ｅ　，　并做部分修改。ＦＤＡ用丙酮溶解配成５　ｍｇ／ｍｌ的贮　存液，用时新鲜配制成１　ｇ／ｍｌ的工作浓度。Ｍ１６　培养基（Ｍ１６中含有的Ｃａ抖、Ｍｇ　＋有助于ＦＤＡ染色）　中力Ⅱ人１　ｇ／ｍｌ　ＦＤＡ、５０　ｇ／ｍｌ的ＰＩ、５　ｇ／ｍｌ的　Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８，将卵母细胞加入上述Ｍ１６中３７℃避光　染色１０　ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤３次，抗荧光淬灭封片液封片，　荧光显微镜下观察、拍照，评价卵母细胞的活力。　１．６检测皮质颗粒的分布变化　卵母细胞用０．５　的蛋白酶Ｅ消化３～５　ｍｉｎ去除　透明带，４　０Ａ的多聚甲醛固定３０　ｒａｉｎ，在封闭液（含　０．３　ＢＳＡ和１００　ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｍ２培养基）中洗涤３　次，０．１　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ一１００穿膜５　ｍｉｎ后再用封闭液洗涤　２次，１００　ｇ／ｍｌ　ＦＩＴＣ标记的ＬＣＡ染色３０　ｍｉｎ，洗　涤液（含０．３　ＢＳＡ和０．０１　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ～１００的Ｍ２培　养基）洗３遍；１０／＊ｇ／ｍｌ　ＰＩ染色１０　ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤后　用抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察、拍照，　评价ＩＶＭ的卵母细胞的胞质成熟情况。　１．７检测纺锤体复合物的形成　卵母细胞用４　的多聚甲醛（含０．１　的Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ一１００）３７℃，固定３０　ｍｉｎ，封闭液（ＰＢＳ中含ｌ　ＢＳＡ、　０．２　脱脂奶粉、２　正常山羊血清、０．１　ｍｏｌ／Ｌ甘氨　酸、０．２　叠氮钠、０．０１　９／６　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）中处理　３０　ｍｉｎ，ｔｕｂｌｉｎ　ｓ／ｌ？抗体１：５Ｏ封闭液稀释后与卵母细胞　室温或３７℃孵育２　ｈ，洗涤液（含０．０１　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ一１００　的ＰＢＳ）洗涤３次，山羊抗小鼠荧光二抗作用ｌ　ｈ，洗涤　３次后１Ｏ　ｇ／ｍｌ的ＰＩ避光染色１０　ｍｉｎ，抗荧光淬灭　封片液封片，荧光显微镜下观察、拍照，观察纺锤体复　合物的形成情况。　１．８统计学处理　用ＳＰＳＳ１３．０软件进行统计学分析。采用　检　验，尸＜Ｏ．０５为差异有统计学意义。