嘌呤霉素用法
嘌呤霉素说明书
说明：蛋白质合成抑制剂。
抑制细菌、藻类原生物和哺乳动物细胞生长。
嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。
某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。
作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。
嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。
嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC），赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。
这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。
嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。
在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。
溶解性：溶于水，参考浓度50mg/ml。
使用方法1.建议使用浓度哺乳动物细胞：1-10μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定；大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125μg/mL。
注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。
2.溶解方法用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50mg/ml的母液，经0.22μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存；也可溶于甲醇，配制成10mg/ml的储存液。
3.嘌呤霉素杀灭曲线的确定（以shRNA转染或者慢病毒转导为例）嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。
为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。
建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线（kill curve）。
嘌呤霉素筛选细胞原理
嘌呤霉素筛选细胞原理
嘌呤霉素是一种广泛用于细胞生物学研究的抗生素，它通过特异性地抑制蛋白
质合成而对细胞产生影响。
嘌呤霉素筛选细胞原理主要是利用其对细胞的影响来筛选出对嘌呤霉素敏感或耐药的细胞株，从而为进一步研究细胞的生物学特性提供重要的工具和方法。
嘌呤霉素的作用机制是通过与细胞内的核糖体结合，阻止蛋白质的合成。
在细
胞中，核糖体是蛋白质合成的重要场所，而嘌呤霉素的结合会引起核糖体的功能受损，从而影响细胞的正常生物学活动。
因此，对嘌呤霉素敏感的细胞在其作用下会出现生长受抑制甚至死亡的现象，而对嘌呤霉素耐药的细胞则能够继续生长并繁殖。
在进行嘌呤霉素筛选细胞的实验中，首先需要将待筛选的细胞种植在含有嘌呤
霉素的培养基中，然后观察细胞的生长情况。
对于对嘌呤霉素敏感的细胞，其生长将受到明显的抑制，甚至会出现细胞死亡的现象；而对于对嘌呤霉素耐药的细胞，则会继续生长并形成细胞克隆。
通过这种方式，可以筛选出对嘌呤霉素敏感或耐药的细胞株，为后续的细胞生物学研究提供了重要的实验材料。
嘌呤霉素筛选细胞的原理不仅在细胞生物学研究中具有重要意义，同时也在药
物筛选和耐药机制研究中发挥着重要作用。
通过对细胞对嘌呤霉素的敏感性进行评估，可以为药物研发提供重要参考，同时也有助于深入了解细胞对抗生素的耐药机制，为临床治疗提供理论基础。
总的来说，嘌呤霉素筛选细胞的原理是基于其对细胞的特异性影响，通过观察
细胞在其作用下的生长情况来筛选出对嘌呤霉素敏感或耐药的细胞株。
这一原理不仅在细胞生物学研究中具有重要意义，同时也在药物研发和耐药机制研究中发挥着重要作用，为进一步的科学研究和临床治疗提供了重要的实验基础和理论支持。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）（1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。
细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。
嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。
（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
嘌呤霉素筛选稳定转染细胞（1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜；（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；（3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
）（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。
）到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。
孵育。
（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。
在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。
嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。
注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。
在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。
调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。
储存方法和稳定性：嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放；嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。
稳定株嘌呤霉素使用
使用过表达抗性慢病毒如何制备稳定细胞系？
步骤1，使用目的过表达gene-3xFLAG-IRES-puromycin慢病毒先在96孔板感染中目的细胞，可以设置3个左右不同的MOI组，待感染2-3天后，加入puromycin抗性药物进行筛选；（我们在293T细胞中puromycin维持药物浓度在5 μg/ml，2天即可杀死目的细胞；目的细胞的药物作用浓度可以参考该数值进行摸索）。
实验过程中必须设置空细胞的加药组，以确保药物的有效性。
步骤2，对具有抗药的混淆细胞感染株进行消化，稀释，然后分散在96孔板中，确保平均每孔细胞数量1个左右。
使用带有puromycin药物的培养基正常维持细胞，然后逐步放大，获得抗性稳定细胞系；
补充说明：对照病毒是GFP-3xFLAG-IRES-puromycin双标慢病毒，是带有荧光和抗性的，筛选对照稳定株的方法同步骤1和步骤2.
1。
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结
嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结(总3页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考）（1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。
细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；（3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞；（4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基；（5）每日监测细胞观察存活细胞比例。
嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。
（6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。
嘌呤霉素筛选稳定转染细胞（1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜；（2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基；（3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。
）（4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。
）到细胞内，然后孵育过夜；（5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。
孵育。
（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基；（7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。
在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。
嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。
注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。
在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。
调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。
细胞筛选 一 嘌呤霉素
细胞筛选一嘌呤霉素(一) 确定最优筛选浓度当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时,需进行滴定,或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。
一般而言,嘌呤霉素浓度范围在2－10微克/毫升时就是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。
１. 培养待转染(而不就是转染后)的细胞。
(筛选的目的就是杀灭未转染的细胞) 2、取对数生长期的细胞(一般在铺满培养器皿底部的70％~80%时),用新鲜无抗无血清的培养基制成1、５×１05 个／ml 的细胞悬液。
3、向96孔培养板中加细胞悬液,每孔１0０微升(使每孔细胞数在1、5×104个),然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量,培养箱中静置培养过夜。
(这样做就是为了保证在固定细胞密度下确定最佳Ｇ418药物筛选浓度。
) ４.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0, ２, 4, 6, 8, 10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。
(每个浓度可用两个复孔,相当于每个浓度测定三次)。
(注意:对于多数细胞种类而言,过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。
) 5、每日检查细胞活力,根据细胞活力,每三天( 即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。
如细胞生长过快,可以缩短换液时间(每隔一天)。
６.在正常的实验操作规程时,一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率与一般生存时间而定,大概需3到１４天。
在所需时间之后,嘌呤霉素的导致所有细胞死亡的最小浓度就就是应该用于该细胞与该实验的浓度。
最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。
(二) 转染细胞１. 第一天:在6０ｍm培养皿内种植细胞,细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%－80%的密度,CO2孵箱过夜培养。
2、第二天:准备3ml无抗生素无血清培养基,加入Pｏlybrene使其终浓度为8μg/ｍl。
将已经制备的病毒颗粒0、５ml加至上述培养基,轻吹混匀。
去除60mm培养皿内的旧的培养基,加入含病毒培养基。
嘌呤霉素溶液(Puromycin,1mgml)
北京雷根生物技术有限公司
嘌呤霉素溶液(Puromycin,1mg/ml)
简介：
嘌呤霉素(Puromycin，PM )是一种蛋白质合成抑制剂，它具有与tRNA 分子末端类似的结构，能够同氨基酸结合，代替氨酰化的tRNA 同核糖体的A 位点结合，并掺入到生长的肽链中。
虽然嘌呤霉素能够同A 位点结合，但是不能参与随后的任何反应，因而导致蛋白质合成的终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟的多肽。
嘌呤霉素分子量为544.43，CAS 号为53-79-2。
Leagene Puromycin solution 经过滤除菌，可用于科研领域，不用于临床诊断或治疗。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、根据实验具体要求操作。
2、Puromycin solution(1mg/ml)其摩尔数为1.84mmol/L，而Puromycin 工作浓度一般为10～100μmol/L。
3、以工作浓度为100μmol/L 为例，即1mg/ml 稀释18.4倍，即每10ml 培养基中加入Puromycin solution(1mg/ml)544μl。
注意事项：
1、注意无菌操作，避免污染。
2、避免反复冻融，以免失效。
3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：6个月有效。
相关：编号
名称CA0069Storage
Puromycin solution(1mg/ml)
1ml -20℃避光使用说明书1份编号
名称CA0075
青霉素-链霉素混合溶液(100×双抗)TE0002碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(PNP 微板法)。
嘌呤霉素说明书
精选文档说明：蛋白质合成抑制剂。
抑制细菌、藻类原生物和哺乳动物细胞生长。
嘌呤霉素( Puromycin )是由白黑链霉菌( Streptomyces alboniger )发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。
某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。
作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3'末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。
嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。
嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger 内发现的pac 基因编码嘌呤霉素N- 乙酰转移酶(PAC，赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。
这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac 基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。
嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac 基因。
在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac 基因质粒的大肠杆菌菌株。
溶解性：溶于水，参考浓度50mg/ml。
使用方法1.建议使用浓度哺乳动物细胞：1-10卩g/mL最佳浓度需要杀灭曲线来确定；大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125卩g/mL。
注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。
2.溶解方法用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液，经0.22 叩滤膜过滤除菌后分装于-20C冻存；也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的储存液。
3.嘌呤霉素杀灭曲线的确定(以shRNA转染或者慢病毒转导为例)嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。
为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。
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嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。
某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。
作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。
嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。
嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC），赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。
这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。
嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。
在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。
溶解性：溶于水，参考浓度50mg/ml。
使用方法
1.建议使用浓度
哺乳动物细胞：1-10 μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定；
大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125μg/mL。
注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。
2.溶解方法
用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液，经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存；也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的储存液。
3. 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（以shRNA转染或者慢病毒转导为例）
嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。
为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。
建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线（kill curve）。
1） Day 1：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。
37℃细胞孵育过夜；
2） Day 2：a）准备筛选培养基：含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）；b）往孵育过夜后的细胞内更换新鲜配制的筛选培
养基；之后37℃孵育细胞；
3） Day 4：更换新鲜的筛选培养基，并观察细胞存活率。
4）根据细胞的生长状态，约2-3天更换新鲜的筛选培养基；
5）每日监测细胞，观察存活细胞率，从而确定抗生素筛选开始4-6天内有效
杀死非转染或者所有非转导细胞的药物最低浓度。
4. 哺乳动物稳定转染细胞株的筛选
等转染含有pac基因的质粒后，细胞在含有嘌呤霉素的培养基中增殖，以筛选出稳定转染子。
1）细胞转染48h后，将细胞（原样或稀释）置于含有适当浓度嘌呤霉素的新
鲜培养基中培养。
注意：当细胞处于分裂活跃期时，抗生素作用最明显。
细胞过于密集，抗生素
产生的效力会明显下降。
最好进行细胞分盘使其密度不超过25%。
2）每隔2-3天，移除和更换含有嘌呤霉素的培养基。
3）筛选7天后评估细胞形成的病灶。
病灶可能需要额外的一周或者更多时间，这依赖于宿主细胞系和转染筛选效率。
注意：每日进行细胞生长状态的观察。
嘌呤霉素的筛选至少需要48h，有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在3-10天。
4）转移和放置5-10个抗性克隆到一个35mm的培养皿中，用选择培养基继
续培养7天。
此次富集培养是为日后的细胞毒性实验做准备。
注意事项
1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2）嘌呤霉素为有毒化合物，操作时请小心拿放。