流式细胞术在临床检测上的应用
流式细胞术的基础和临床应用
流式细胞术的基础和临床应用流式细胞术是一种在单个细胞水平上进行多参数快速测定的技术，它利用流体力学原理和荧光化学技术，对细胞进行快速、准确地分析和分类。
流式细胞术具有高速度、高精度和高分辨率的特点，因此在生物学、医学和生物技术等领域得到了广泛应用。
流式细胞术的基础包括细胞物理特性、荧光化学特性以及现代光学、计算机和电子技术的应用。
细胞物理特性是指细胞的大小、形状、粒度等物理性质，这些性质可以通过流式细胞术进行测量。
荧光化学特性是指利用荧光物质标记抗体或核酸等分子，对细胞进行标记和染色，然后通过流式细胞术进行检测。
现代光学技术、计算机技术和电子技术的应用则使得流式细胞术能够实现多参数、高精度和高分辨率的检测。
在临床应用方面，流式细胞术被广泛应用于淋巴细胞亚群分析、功能性T淋巴细胞亚群分析、肿瘤免疫分析等方面。
淋巴细胞亚群分析是流式细胞术最常用的检测项目之一，通过对淋巴细胞亚群的检测和分析，可以了解机体的免疫状态和疾病发病机制，对于免疫相关性疾病的诊断和治疗具有重要意义。
功能性T淋巴细胞亚群分析则可以进一步了解T淋巴细胞的免疫功能和分化特点，对于肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病等的治疗和预后评估具有指导作用。
肿瘤免疫分析则通过流式细胞术检测肿瘤细胞表面的抗原和抗体，了解肿瘤细胞的免疫逃逸机制和免疫应答情况，为肿瘤的免疫治疗提供依据。
此外，流式细胞术还被应用于干细胞研究、基因表达分析、药物筛选和毒理学研究等领域。
例如，通过对干细胞的表面标志物进行检测和分析，可以了解干细胞的特性和分化能力；通过对基因表达谱的检测和分析，可以了解基因的表达水平和调控机制，为疾病治疗和药物研发提供依据。
总之，流式细胞术作为一种强大的细胞分析工具，其基础包括细胞物理特性、荧光化学特性以及现代光学、计算机和电子技术的应用。
在临床应用方面，流式细胞术已经成为医学研究和诊断中不可或缺的工具之一，其应用范围涵盖了淋巴细胞亚群分析、功能性T淋巴细胞亚群分析、肿瘤免疫分析等多个方面。
流式细胞术在临床与科研中的应用
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淋巴细胞亚群
T淋巴细胞(CD3+) CD3+CD4+
CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29CD3+CD8+ CD3+CD8+CD28CD3+CD4+CD29CD3+CD4+CD8+ CD3+CD4-CD8CD4+/CD8+比值 CD45RA+CD45RO-
CD45RA-CD45RO+
淋巴细胞亚群与疾病
疾病
自身免疫性疾病 系统性红斑狼疮 类风湿性关节炎 自身免疫性溶血性贫血 重症肌无力
免疫缺陷病 爱滋病
病毒感染 传染性单核细胞增多症
慢性活动性肝炎 活动性肝硬化
肿瘤 消化道癌, 肝癌, 肺癌
再生障碍性贫血 粒细胞减少症
CD3
CD4
CD8
CD4/CD8
NK
监测细胞免疫状态
1.CD4+、CD8+T细胞减少：见于r免疫球蛋白缺乏症、胸腺 发育不良、严重联合免疫缺陷病。
传递； （4）细胞分化过程中的调控； （5）细胞亚群的功能。
临床与科研常见应用
1.检测淋巴细胞亚群，监测细胞免疫状态 2.白血病/淋巴瘤免疫分型 3.HLA组织配型及HLA与某些疾病的关系 4.干祖细胞的定量及成分分析. 5.其它:血小板PAIg：粘附分子;TCR多态性检测; 肿瘤癌基因及 抑癌基因蛋白产物的检测;细胞内酶; 耐药蛋 白的分析等等。
流式细胞术在临床医学的应用
流式细胞仪在医学检验中的应用流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一。
近年来，FCM的发展日新月异，技术不断有新的突破，新型仪器不断涌现，同时，FCM 在医学及其他科学的应用更加广泛和深入，涵盖了从基础研究到临床诊断的多个方面，涉及免疫学、血液学、肿瘤学等。
图1. 流式细胞术工作原理图一、流式细胞术的研究进展1. 流式细胞仪的进展近年来，随着将多种不同波长的新型激光器与新型荧光染料的新型染色剂相结合，流式细胞仪性能不断提升，体现在分析速度的提高、灵敏度和精密度的提升，以及激光通道和参数的增多。
此外，流式细胞仪不断打破传统的界限，实现了多学科的交叉发展，诞生了一些新理念、新技术融合的仪器。
例如，微流控芯片流式细胞仪，是基于微机电技术的一种小型流式细胞仪，具有结构简单、操作方便、体积小、价格低廉等特点；声波聚焦流式细胞仪是采用超声波原理将细胞聚焦于流动室的中轴上，代替传统的流体动力，实现高通量、高精确度分析；质谱流式细胞仪将传统流式细胞仪与质谱分析技术相结合，采用同位素标记特异性抗体，利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术，可以克服荧光素发光光谱相互干扰导致的波谱重叠、影响分辨的问题；将传统的流式细胞仪的荧光信号与荧光显微镜的形态学结合，形成了成像流式细胞仪，检测者可以目睹到每个细胞或颗粒的形态。
质谱流式细胞仪和成像流式细胞仪可以被称为二代流式细胞仪。
2. 流式细胞术的进展FCM主要用于分析荧光标记的细胞和颗粒，也是目前广泛的应用领域。
但是，新近研究打破了这一界限，实现了流式细胞仪由检测荧光标记的细胞，到可以检测无需荧光标记细胞的飞跃，这种技术对细胞无损坏、避免了荧光染料的干扰，将进一步提升FCM的应用范围和价值。
有学者研究出一种新的FCM，称为实时变形性流式细胞术(real-time deformability cytometry，RT-DC)，利用肿瘤细胞等细胞的内在特性——变形能力，对无标记的目标细胞分析，这种无标记的分析方法为流式细胞分析增加了新的可能。
流式细胞术在临床检验中的应用
统 ； 激光光源及 成形系统 ； ② ③光 学系统 ； 信号 检测 、 ④ 存
贮、 显示 、 析 系 统 ； 细 胞 分 选 系 统ｌ Ｃ 的 特点 ： 快 分 ⑤ 引 。Ｆ Ｍ ① 速 ， 高 每 秒 可 测 数 十 万 个 细胞 ： 进 行 多 参 数 相 关 测 量 ， 最 ②
可 根 据 测 量 信 息 对 细 胞进 行 分 选 。 原 理 是 把 经 荧 光 染 料 其 标 记 过 的 细 胞样 品 制 成 单 细 胞 悬 液 ． 由气 压装 置 送 入 流 动 室 ， 动 室 由供 试 品 管 和 鞘 液 管 组 成 ， 液 管 充 满 流 的 鞘 流 鞘
好 ． 析 速 度 快 ， 合 在 临 床 实 验 中应 用 。 某种 特 征 的细 分 适 对
分子生物学 、 子 免疫学 、 体力 学 、 光技术 、 分 流 激 电子 计 算
机 技 术 等 高 度结 合 和 发 展 的 结 晶 ， 一种 在 功 能 水 平 上 对 是 单 细 胞 或 其 他 细 胞 粒 子 、 原物 质进 行 快 速 检 测 分 析 和 分 抗 选 的 技 术ｆ Ｆ Ｍ 结 合 现 代 单 克 隆 抗 体 技 术 ， 同时 鉴 别 单 ｌ Ｃ ＿ 。 可 个细胞上的多种参数定量定性分析 ， 有 速度快 、 度高 、 具 精 准 确 性 好 等 特 点 。使 用 Ｆ Ｍ 能 够 快 速 分 析 单 个 细 胞 或 粒 Ｃ 子 的多 种 特性 ， 可 以定 性 也 可 以定 量 ， 其 适 用 于 大 量 既 尤 样品检测 ， 已在 临 床 检 验 工 作 中 得 到广 泛 应 用 。Ｆ Ｍ 的 检 Ｃ 测 分 析 已 涉 及 到 肿 瘤 学 、 疫 学 、 液 学 、 生 物 学 、 胞 免 血 微 细
FCM(流式细胞术检测)原理及临床应用
流式细胞术(flow cytometry FCM)是利用流式细 胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细 胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和 生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞 群体加以分选的分析技术。
FCM的工作原理
流式细胞仪组成：
1.液流系统 2.光学系统 3.数据处理系统
双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪 能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信 号。检测时需注意荧光补偿。
常用免疫荧光染料组合
荧光染料 FITC+PE
激发波长 （nm）
488
发射波长（nm） 525、575
颜色 绿色、橙色
FITC+PeCy5
488
525、675
绿色、红色
FITC+ECD
488
实体瘤以多倍体居多；
G0 期：DNA 合成静止期 G1 期：DNA 合成前期 S 期： DNA 合成期 G2 期：DNA 合成后期 M 期： 细胞分裂期
DNA 倍体 2N 2N
2N-4N 4N 4N
DNA非2倍体出现是鉴别良性与恶性肿瘤的特异性指 标:
良性肿瘤和正常组织良性增生不出现DNA非2倍体细 胞而恶性肿瘤常可出现异倍体细胞；
过去认为 FCM测定残存白血病细胞不可靠， 因为现用的 McAb不能鉴别正常血细胞与白血 病细胞。虽然至今尚未发现白血病细胞特异抗 原，但近来有人提出根据白血病细胞的以下特 征， FCM检测的敏感度可明显提高
白血病细胞的某些抗原表达量明显高于相应 的正常血细胞
如小儿ALL，其CDl0+细胞的荧光强度可 高达3-4个对数值，而其 CD45则为弱阳性或 阴性。
525、625
流式细胞分析在临床血液学中的应用
流式细胞分析在临床血液学中的应用
1.白血病诊断和监测：
白血病是由于骨髓内的恶性细胞大量增殖导致的一种血液系统疾病。
流式细胞术可以根据细胞大小、颜色和表面标记物的表达水平快速分析并鉴别异常细胞。
这对于白血病的早期诊断、分类和监测来说非常重要。
2.免疫功能评估：
流式细胞术可以评估患者的免疫功能。
通过将标记有特定抗体的细胞与患者的血液混合，可以测量细胞表面抗原的表达水平。
这有助于确定患者是否有免疫缺陷，以及免疫功能是否正在正常运行。
3.血液病的异常细胞鉴定：
流式细胞术可以鉴别和计数血液中的异常细胞。
例如，对于淋巴瘤等恶性疾病，流式细胞术可以检测和分类恶性细胞，以便进行早期诊断和个体化治疗。
4.红细胞和血小板计数：
流式细胞术可以用于快速准确地计数红细胞和血小板。
在患者需要进行输血或者有出血倾向的情况下，流式细胞术可以提供非常重要的信息。
5.免疫治疗监测：
流式细胞术可以用于监测免疫治疗的效果。
例如，在进行造血干细胞移植后，流式细胞术可以帮助监测移植后的免疫细胞比例和功能。
这对于治疗干细胞移植相关并发症和个体化治疗来说非常重要。
总之，流式细胞分析是一种在临床血液学中非常有用的技术，可以用于白血病诊断和监测、免疫功能评估、血液病的异常细胞鉴定、红细胞和血小板计数以及免疫治疗监测。
随着技术的发展，流式细胞分析的应用将进一步扩大，为临床血液学的诊断和治疗提供更多的帮助。
流式细胞术的医学应用现状与前景
流式细胞术的医学应用现状与前景流式细胞术是一种用于细胞分析和鉴定的高度精密的技术，通过激光和光学系统对细胞进行高速、高通量的检测和分类。
近年来，随着技术的不断进步和应用范围的扩大，流式细胞术在医学领域的应用越来越广泛，成为了临床医学和基础医学研究的重要工具之一。
本文将就流式细胞术的医学应用现状和未来发展进行详细探讨。
1. 癌症诊断和治疗监测流式细胞术在癌症领域的应用已经成为了常规的操作。
它可以对肿瘤细胞、肿瘤标志物和免疫细胞进行快速鉴定和分析，为临床医学提供了重要的依据。
流式细胞术还可以用于监测肿瘤治疗的疗效，例如监测化疗对肿瘤细胞的杀灭效果或肿瘤标志物的变化情况，为临床医生制定治疗方案提供了重要的参考。
2. 免疫学研究流式细胞术在免疫学研究中有着广泛的应用。
它可以用于检测免疫细胞的表面标志物、细胞因子的表达、细胞亚群的分离和鉴定等。
通过流式细胞术，研究人员可以更加深入地了解免疫细胞的分布和功能，为免疫相关疾病的诊断和治疗提供了重要的科学依据。
3. 感染性疾病诊断在感染性疾病的诊断中，流式细胞术可以用于对血液、体液中的细菌、病毒、真菌等病原体进行快速鉴定和分类。
通过检测免疫细胞的活化状态、细胞因子的表达等指标，可以帮助临床医生更加准确地诊断感染性疾病，制定相应的治疗方案。
4. 干细胞治疗随着干细胞治疗的不断发展，流式细胞术在干细胞的分离、鉴定和纯化中发挥着重要的作用。
通过流式细胞术，可以高效地分离和纯化出具有特定功能的干细胞亚群，为干细胞治疗提供了重要的细胞材料。
二、流式细胞术的医学应用前景1. 单细胞分析技术的发展随着单细胞分析技术的不断进步，流式细胞术在医学领域的应用前景也将更加广阔。
在癌症诊断、干细胞治疗等领域，单细胞分析技术将为研究人员提供更加详细和准确的细胞信息，为个性化治疗提供更加科学的依据。
2. 多参数检测技术的提升随着技术的发展，流式细胞术可以同时检测数十种甚至上百种细胞表面标志物、细胞因子的表达等指标，这为医学诊断和药物研发提供了更加广阔的可能性。
流式细胞术的临床应用
流式细胞术的临床应用闫 虹(天津市人民医院检验学部,天津300121) 流式细胞术(flow cytometry,FC M)是20世纪70年代发展起来的对单细胞定量分析的一种新技术。
它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术,具有极高的检测速度与统计精确性,而且从单一细胞可以测得多个参数,为生物医学与临床检验提供了全新视角和强有力手段。
目前,随着单克隆抗体技术的发展,流式细胞仪检测技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各个方面,在肿瘤学、血液学,免疫学、微生物学、细胞生物学-遗传学及临床检验学等诸多领域内发挥着重要作用[1]。
本文就其在临床上的应用综述如下。
1 流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪主要由细胞流动室、激光聚焦区、检测系统、数据处理系统等4部分组成,其工作原理是将待测标本制成单细胞悬液,经染色后进入流动室,流动室充满流动的鞘液,鞘液压力与样品压力是不同的,当两者的压力差异达到一定程度时,鞘液裹挟着的样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区。
若将细胞中感兴趣的部分特异性地标上荧光染料,那么这些染料将在细胞通过激光检测区时受激光产生特定波长的荧光,通过一系列信号转换、放大、数字化处理,就可以在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。
选择不同的单克隆抗体及荧光染料,可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同的特征,如果对具有某种特征的细胞有兴趣,还可以利用流式的分选功能将其分选出来,以便进一步培养、研究。
2 流式细胞术在临床上的应用2.1 流式细胞术在免疫学中的应用 FC M与单克隆抗体结合,对细胞表面和细跑内抗原、癌基因蛋白及膜内受体的定量检测取得很大进展,并广泛应用于临床医学,克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足。
在临床医学研究中,应用最为广泛的是流式细胞免疫表型分析,F M可以进行淋巴细胞亚群分析,可同时检测出一种或几种淋巴细胞表面亚群分析,将不同的淋巴细胞亚群区分开来,并计算出它们相互间的比例。
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流式细胞术在临床检测上的应用
（一）淋巴细胞亚群分析
目前主要开展的项目：
1．T/B/NK/CD4/CD8/CD4:CD8
2．绝对计数
3．活化淋巴细胞的检测（CD69/HLA-DR/CD71）
4．CD4+Th/i 和CD8+ Ts/c进一步区分
5．Naïve/Memory T细胞亚群检测
6．Th1/Th2亚群的检测
临床意义：
•了解在不同情况下体内免疫功能状态
•辅助临床疾病的诊断
•探索疾病的发病机理、病程、预后
•监测、指导临床治疗方案
•免疫系统疾病，如SLE等
•免疫缺陷病，AIDS
•移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测
•肿瘤病人化疗后免疫力检测
推荐试剂：
T/B/NK/CD4/CD8/CD4:CD8:
绝对计数
活化淋巴细胞检测
Th1/Th2检测
（二） HLA-B27的检测
HLA-B27与强直性脊椎炎（ankylosin spondylitis，AS）具有高度的疾病相关性，B27的个体的该病的相对危险率达300以上，AS病人中约95%以上的个体是B27。
同时，与B27高度相关的疾病还有：莱特儿病（包括腹泻、多发性关节炎、尿道炎、结膜炎等的综合症，Reiter’disease）和急性前葡萄膜炎（acute anterior uveitis）等，最新近研究认为还和心肌炎等心脏病有关联。
BD HLA-B27 Kit检测HLA-B27，报告检测的平均荧光强度，根据界值判定，得到阴性/阳性结果。
实验的灵敏度为100%，特异性为97.5%
推荐试剂：
（三）血液学上的应用
1．白血病和淋巴瘤免疫分型
用流式来检测对下列情况有重要意义：
•用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。
•形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。
•混合性白血病。
•部分髓系白血病。
目前，免疫分型对粒细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。
•慢性淋巴细胞白血病。
•微小残留白血病。
2．造血干细胞计数
主要应用于
•PBSC采集前CD34阳性细胞动员有效性的检测
•各种造血干细胞移植物的CD34+细胞计量控制
•化疗强弱的掌握
•贫血的鉴别（如再障，缺铁性贫血等）
•基因治疗
推荐试剂：
3．PNH诊断
阵发性血红蛋白尿是由于红细胞膜的获得性缺陷，对激活补体异常敏感的一种慢性血管内溶血。
利用流式细胞术和CD55和CD59单克隆抗体，对PNH患者红细胞、粒细胞和血小板进行分析，证实存在膜蛋白表达缺陷的血细胞，并计算缺陷细胞在全血中所占比例
双色：CD55 FITC 555693 CD59 PE 555764
单色：CD55 FITC 555693 CD59 FITC 555763
推荐试剂：
4．血小板分析
•血小板活化的相关检查
血小板颗粒膜糖蛋白，如CD62，CD63
血小板膜糖蛋白活化表位，如PAC-1
临床意义：监测血小板活化相关疾病过程，抗血小板药物疗效或治疗药物的影响，预测血栓形成
✓心肌缺血（心绞痛、心肌梗塞）与血小板活化有关
✓预测冠状动脉成形术后发生急性缺血事件的危险性
✓缺血性脑血管病与血小板活化有关
✓子痫前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加
✓抗血小板治疗疗效监测
•血小板减少性疾病
网织血小板的检测
✓特发性血小板减少症的诊断和治疗指标
✓鉴别因血小板消耗引起的血小板减少症（如ITP）和因骨髓增生不良引起的血小板减少症（如再障）；
✓肿瘤化疗疗效的监测；
✓自体骨髓移植和外周血干细胞移植疗效监测
推荐试剂：
血小板活化
网织血小板
（五）肿瘤早期诊断
根据DNA在整个细胞周期中有规律的变化这一特点，利用核酸染料来检测。
•DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要指标。
•淋巴瘤、白血病在病理形态学还不能做出早期诊断之前，FCM可以提供确切的诊断信息。
•DNA非整倍体的交界瘤应按恶性肿瘤对待。
•形态学表现为良性的肿瘤出现非整倍体提示有恶性转变的可能。
•DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标。
推荐试剂
DNA倍体检测
（六）细胞因子检测
细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞免疫功能调节方面发挥重要作用。
细胞因子可以调节多种细胞的生长、分化和功能，调节正常与病理状态下的免疫应答，研究生理或病理免疫调节因素所致细胞因子合成的应答与改变是研究疾病病因与免疫状态的重要工具。
T细胞的细胞因子分型分为I型和II型
Ⅰ型细胞介导免疫反应
引起迟发过敏反应、巨噬细胞活化、2型反应下调
刺激来源：病毒、某些细菌
Ⅱ型体液介导免疫反应
引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、1型反应下调
刺激来源：多细胞寄生虫、过敏源
细胞因子相关的主要研究领域
•肿瘤
•肾炎
•感染
•自身免疫病
•超敏反应
•移植排斥反应
•免疫缺陷病
•血液疾病
1．胞内细胞因子检测
推荐试剂
2．血清血浆中可溶性细胞因子定量检测
BD专利的CBA系统则是将液体中的可溶性成分结合在一种类似于细胞大小的颗粒上，根据夹心法的原理使用流式细胞仪对其进行定量的检测技术。
与传统的ELISA方法相比：
●CBA所需样本体积仅为ELISA分析所必需样本量的1/6
●CBA的灵敏度与ELISA相当，但稳定性更好，符合细胞因子检测的国际标准
（经美国NIBSC的gold标准测试）
●对标准品混合物做一次流式检测，就可得到样本中各种被分析物相应的标准曲
线
●能避免由于酶联放大技术使信号失真导致的假象
CBA实验时间比单次ELISA大大缩短，而且能提供需要做6次ELISA才能得到结果。
推荐试剂：。