最新23菌种复壮保藏
微生物菌种保藏及复壮
微生物菌种保藏及复壮5.1. 微生物菌种保藏在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重要。
微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。
具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。
5.1.1. 蒸馏水悬浮法这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。
好气性细菌和酵母等可用此法保存。
5.1.2. 斜面传代保藏斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。
它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。
但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。
因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。
斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。
此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。
如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。
5.1.3. 矿物油中浸没保藏此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。
特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。
是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。
菌种保藏方法及复壮技术
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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。
需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。
目前常用的菌种保藏方法有以下几种。
1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。
由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。
每隔六个月转管一次。
草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。
如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。
这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。
1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。
一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。
液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。
在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。
液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。
如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。
菌种的衰退、复壮和保藏
菌种的衰退、复壮和保藏1. 内容1.菌种的衰退：菌种退化是指由于自发突变的结果，而使某一物种有一系列生物学性状发生量变或质变的现象（群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象）。
具体表现为：⏹原有的形态性状变得不典型了；⏹生长速度变慢，产生的孢子变少，或颜色改变，甚至变形；⏹代谢产物生产能力下降，在生理上常指产量的下降；⏹致病菌对宿主侵染力的下降；⏹对外界不良条件包括低温、高温或噬菌体侵染等抵抗能力的下降；等等。
2.衰退菌种的复壮狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择自发的正变个体。
（1）衰退的防止:⏹控制传代的次数⏹创造良好的培养条件⏹利用不易衰退的细胞传代⏹采用有效的菌种保藏方法（2）菌种的复壮⏹纯种分离法⏹通过宿主体复壮对于因长期在人工培养基上移种传代而衰退的病原菌，可接种到相应的昆虫或动、植物宿主体中，通过这种特殊的活的“选择性培养基”一至多次选择，就可从典型的病灶部位分离到恢复原始毒力的复壮菌株。
⏹淘汰已衰退的个体（3）菌种的保藏⏹原理人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。
这些人工环境主要从低温、干燥、缺氧三方面设计。
⏹常用的方法：冷冻干燥保藏法、液氮保藏法、斜面保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、悬液保藏法、寄主保藏法等。
2. 练习一．填空1.某纯种微生物群体中的个别个体由于发生自发突变的结果，而使该物种原有一系列生物学性状发生衰退性的量变或质变的现象，叫做_____。
答案：衰退2. ______属于第三代的生物武器，包括高致病力的病原体和抗药菌等。
菌种的复壮与保藏(陈)
➢石蜡油封藏法 • 措施：阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而
且又防止了水分挥发。
• 方法：液体石蜡150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸
汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分→倒入菌 种管中（高出1cm） → 4℃保存。
• 适用：霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌(xìjūn)等 • 保藏期：1～2年，或更长
常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高 分子物质。
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复苏方法： —— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部， —— 将安瓿管顶部烧热， —— 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶
部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下， 敲下已开裂的安瓿管的顶端， —— 用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌 吸管移入新鲜培养基上，进行(jìnxíng)适温培养。
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➢ 砂土管干燥保藏法 • 措施(cuòshī)：无营养，缺氧，干燥 • 方法：孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂
土管中→ 干燥→ 封口 → 5℃保藏 • 适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有
芽孢的细菌 • 保藏期：1~10年或更长
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沙土 管制作 (shātǔ)
另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加 并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
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3、不适宜的培养和保藏条件 不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。
不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气(tōng qì)量 等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退 型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过 正常细胞，造成菌种衰退。
第三章 菌种保藏复壮扩大培养
• （5）其他保藏方法
• 冷冻法：分低温冷冻（－20 ℃）与 超低温冷冻（－196 ℃）两种。适 用于细菌、真菌、病毒等的保藏 • 液态真空干燥法：菌体在恒温液态 条件下进行真空干燥。适用于包括 细菌、病毒，特别适用于冷冻干燥 保藏效果不佳的菌种。 • 琼脂穿刺封口保藏法：适用于不产 孢子细菌的保藏
（2）矿物油保藏法
将生长好的斜面在无菌条件下倒入已灭菌的 液体石蜡，油层高于斜面末端1cm，然后放于 冰箱中保存。 适用菌种：适用于除细菌外的其它菌种
（3）砂土管保藏法
利用土壤颗粒对微生物起保护作用，提高微 生物的存活率。其包括砂土制备和真空抽干两 步。 适用菌种：产孢子的微生物，对于一些对干燥敏 感的细菌（奈氏球菌、弧菌、假单胞杆菌）以 及酵母不适用。
• 2、种龄与接种量 • 3、斜面冷藏时间 • 4、温度：温度直接影响生长和酶的合合成酶的最适pH。 培养基pH值在发酵时要受菌体代谢的影响。
• 调节方法（使之保持适当的pH值）有三种 方法： 用酸碱溶液中和法；使用缓冲溶液法； 使用生理缓冲剂；
3、新诱变因子及诱变技术
• （1）低能离子束诱变： 离子注入是20世纪80年代兴起的一种表面处理技术。这种 相互作用过程大致分为能量沉积、动量传递、离子注入和电荷 交换等四个原初反应过程，在10－19－10－13s中间时发生。 荷能离子注入除具有Y射线能量沉积引起机体损伤的特征外， 还具有动能交换产生的级联损伤，表现为遗传物质原子转移、 重排或基因的缺失。还有慢化离子、移位原子和本底元素复合 反应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造 成的损伤。离子注入通常采用N+、H+、Ar＋。离子注入生物 学效应显示出一些不同于辐射生物学的特征，相当于物理和化 学诱变两者相结合的复合诱变效应 • （2）激光辐射诱变和微波电磁辐射诱变
菌种的衰退复壮和保藏
2、菌种保藏方法
1）斜面菌种低温保藏法---利用低温对微生 物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。 把斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液 等,直接放入4～5℃冰箱中。保藏时间一 般不超过3个月,到时必须进行移接传代, 再放回冰箱。
2）砂土管保藏法---将干燥砂粒与细土混合 后灭菌制成砂土管,然后接种保藏 。若把 砂土管放在低温或抽气后密封,效果更佳。 此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。 保藏期1～10年 3）石蜡油封藏法---向培养好的菌种斜面上, 加入灭菌石蜡油,高出斜面1cm,然后蜡封 管口,放入冰箱。该法既可防止培养基水 分蒸发,又能使菌种与空气隔绝。保藏期 1～ 2年
美国的“美国典型菌种收藏所”(ATCC)，保藏 方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结法。
2、衰退的防止
（1）控制传代次数 （2）创造良好的培养条件 （3）利用不易衰退的细胞传代 （4）采用有效的菌种保藏方法
二、菌种的复壮
1、复壮的定义：
狭义复壮：指的是在菌种已在发生衰退的情况下，通 过纯种分离和测定典型性状，生产性能等指标，从 已衰退的群体中筛迁出少数尚未退化的个体，以达 到恢复原菌株固有的性状的相应措施。 广义的复壮：是一项积极的措施，即在菌种的典型特 征或生产性状尚未衰退前，主经常有意识地采服纯 种分离和生产性状的测定工作，以期众中选择到自 发的正变个体。
第五节 菌种的衰退、复壮和保藏
一、菌种的衰退及其防治 1、衰退：是指由于自发突变的结果，而使某种 原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。 如原有形态性状变得不典型了，生长速度变慢， 代谢产物生产能力下降，致病菌对宿主侵染力 的下降，对外界不良条件包括低温、高温或噬 菌体侵染等抵抗能力的下降等。
3、菌种保藏中心
我国由于1979年7月成立了中国微生物菌种 保藏管理委员会(CCCCM),
简要说明菌种保藏原理及复壮
1.简述菌种菌种保藏原理及复壮？
答：大肠杆菌和其它微生物一样,都具有稳定遗传性和变异性。
遗传性可以保证微生物本身特征的相对稳定,即无性繁殖过程中能够保持原有的性状,为菌种保藏提供了有利因此,而变异性,使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变,给菌种保藏带来了困难。
由于存在变异,菌种常出现所谓的退化,主要指理想性状的丧失,从而导致发育缓慢,存活率和产量降低等现象。
菌种保藏工作就是通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段,最大限度地降低菌种的代谢强度,抑制细菌的生长和繁殖。
由于菌种的代谢相对静止,生命活动将处休眠状态,从而可以保藏较长时间。
保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外,还不允许污染任何杂菌,能够长期在研究上应用。
此外,在保存前应确保菌种的单纯性,先分离单菌落后进行鉴定,然后再繁殖保存。
菌种的复壮与保藏
基本程序
• 1安瓿管的处理
• 2 保护剂
直径8~10mm，长度不小于 100mm，洗净高压备用。 低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖类、 蛋白质等。常用的是脱脂奶和血清。 最适培养条件、生长后期。产孢子的 微生物须适当延长培养时间以获得成熟的孢子。一般细菌 24~48h，酵母72h，放线菌和丝状真菌7~10d。
半固体穿刺保藏法 • 穿刺接种适宜半固体→培养→4℃保藏 • 适用：好气性细菌，酵母等 • 保藏期：6~12个月
用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状 培养基中心自上而下刺入，至培养基的1/2处，待 微生物生长良好后覆盖2~3mm无菌液体石蜡.石蜡 可防止培养基失水又隔绝氧气,降低代谢.但不适用 于可以石蜡为碳源的微生物.如固氮菌、分枝杆菌 等。
常用的有蒸馏水、0.25MPBS或生理盐水，关 键是试管应密封好，以防水分蒸发。
低温保藏法 •方法：-20℃ •适用：无芽孢厌气菌，放线菌等 •保藏期：1年或更长
注意：融化后的菌种不能再用低温保存，要 重新移种后在冷藏。
三、菌种保藏的注意事项
• 菌种在保藏前所处的状态：孢子或芽孢 • 菌种保藏所用的基质：碳源 • 操作过程对细胞结构的损害
创造良好的培养条件
1)结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加 相应药物，及时淘汰回复突变细胞。 2)基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒 的丢失
采用有效的菌种保藏方法
从菌种管理的措施上考虑
菌种复壮
二、菌种的复壮
侠义的复壮 ：菌种已经发生衰退后，再通过纯
种分离和性能的测定等方法，从衰退的群体中 找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种 原有典型性状的一种措施。
•低温保藏法
斜面保藏法 • 接种适宜斜面培养基 →培养→4℃保藏 • 适用：各大类 • 保藏期：3~6个月 • 缺点：保存期短，传代多，易退化
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一、菌种变异及退化机理
1、菌种退化 • 生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良菌株，由
于进行接种传代或保藏之后，群体中某些生理特征 和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象。 • 表现——
– 形态上：分生孢子减少或菌落颜色改变， – 生理上：生长速度变慢，目的代谢物合成能力降低，产
量下降，糖化力降低，抗噬菌体能力下降，突变株回复 突变等
结束语
谢谢大家聆听！！！
13
方法 冰箱保藏法 （斜面） 冰箱保藏法 （半固体） 石蜡油封藏法* 甘油悬液保藏法
砂土保藏法 冷冻干燥保藏法
液氮保藏法
7种常用菌种保藏方法的比较
主ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ措施
适宜菌种
保藏期
低温（4℃）
各大类
约1～6月
评价 简便
低温（4℃），避氧 细菌，酵母菌
约6～12月 简便
低温（4℃），阻氧 各大类**
低温（－70℃），保护 细菌，酵母菌 剂（15～50％甘油）
4、方法
为了有效的保藏微生物菌种，首先需要有良好的培养基。
常用的细菌培养基 牛肉膏琼脂、酵母膏葡萄糖琼脂、甘露醇琼脂 常用的放线菌保藏培养基 高氏合成一号 常用的酵母菌保藏培养基 麦芽汁琼脂 常用的霉菌保藏培养基
Czapek agar、马铃薯琼脂
《菌种保藏手册》介绍了406种培养基的成分、配方和用途。
3、技术
• 有针对性的创造干燥、低温、缺氧的外界条件，是 微生物菌种保藏的基本技术。
• 保藏时，一般利用菌种的休眠体（孢子、芽胞等）， 创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、 隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，使菌体的代谢 活性处于最低状态，同时也应考虑到经济、简便方 法。
• 由于微生物种类繁多，代谢特点各异，对各种外界 环境因素的适应能力不一致，一个菌种选用何种方 法保藏较好，要根据具体情况而定。
干燥，无营养
产孢子的微生物
干燥、低温、无氧，有 各大类 保护剂
超低温（－196℃）， 各大类 有保护剂
约1～2年 约10年
约1～10年 >5~15年
>15年
简便 较简便
简便有效 繁而高效
繁而高效
*用斜面或半固体穿刺培养物均可，一般置于4℃下。 **对石油发酵微生物不适宜。
菌种保藏的注意事项
• 菌种在保藏前所处的状态 • 菌种保藏所用的基质 • 操作过程对细胞结构的损害