(优选)菌种选育保藏与复壮
菌种保藏方法及复壮技术
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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。
需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。
目前常用的菌种保藏方法有以下几种。
1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。
由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。
每隔六个月转管一次。
草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。
如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。
这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。
1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。
一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。
液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。
在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。
液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。
如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。
食用菌菌种关键技术创新与产业化应用
食用菌菌种关键技术创新与产业化应用
食用菌菌种关键技术创新与产业化应用是当前食用菌产业发展的重要方向。
以下是一些关键技术创新和产业化应用的例子：
1.菌种选育与改良：通过遗传学、分子生物学等现代生物技术手段，对食用菌菌种进
行选育和改良，提高菌种的生长速度、产量和品质。
例如，利用基因编辑技术，对食用菌菌种进行基因改造，使其具有更好的生长性能、抗逆性和营养品质。
2.菌种保藏与复壮：建立科学的菌种保藏和复壮技术体系，保证菌种的遗传稳定性和
生产性能。
例如，采用低温保藏、真空冷冻干燥保藏等方法，对菌种进行长期保存，并在需要时进行复壮，恢复其生产性能。
3.智能化栽培技术：利用物联网、大数据、人工智能等现代信息技术手段，实现食用
菌栽培的智能化管理。
例如，通过智能传感器监测温湿度、光照、CO2浓度等环境参数，自动调节温室环境，提高食用菌的生长速度和产量。
4.病虫害防治技术：研究和发展食用菌病虫害防治技术，减少化学农药的使用，保障
食用菌的安全性和品质。
例如，利用生物防治技术，引入天敌昆虫、微生物等自然控制因子，对食用菌病虫害进行生物防治。
在产业化应用方面，可以通过建立食用菌产业化基地、推广先进的栽培技术和管理模式、加强品牌建设等措施，推动食用菌产业的快速发展。
同时，还可以将食用菌产业与其他农业产业相结合，形成产业链和产业集群，提高整个农业产业的综合效益。
总之，食用菌菌种关键技术创新与产业化应用是推动食用菌产业发展的重要手段，可以提高食用菌的产量和品质，促进农业增效和农民增收，具有重要的现实意义和长远价值。
菌种的保藏与复壮
(二)低温定期移植法
• 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，
定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种 特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植 法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培养是 将含0.6％～0.8％的琼脂培养基装试管灭 菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌 体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当 温度下培养，待菌长好后即可放低温保存， 此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年 以上不发生明显变异。
• (2)保护剂 不同种类的保护剂对不同
微生物的作用是不同的，如个别菌种在 脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达 99.99%，而采用葡聚糖等混和保护剂时 死亡率大大减少。一般情况下，那些容 易保存的菌种对保护剂的要求不很严格， 而不易保存的菌种对保护剂的要求却很 苛刻。因此，选择好的保护剂是冷冻干 燥保存菌种的关键因素。
(六)真空冷冻干燥法
• (3)菌种准备及分装 菌种要求为生长良好
的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是 新鲜的。每支长好的斜面加2～3ml保护剂， 用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养 基)，制成菌悬液。如用液体培养的菌种， 则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细 胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。 悬液中菌数要求达到10 8～10 10cfu/ml 为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分 装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部， 装量可依据冷冻干燥机效能而定。
(六)真空冷冻干燥法
• (4)预冻 分装好的安瓿管需要进行预冻，即放在-
30～40℃下冻结20～60min，也可以用干冰和无水 乙醇冻5～10min。
• (5)冷冻干燥 经预冻的安瓿放入干燥箱中开始
抽真空干燥。此时干燥箱温度控制在-30℃以下， 并尽快使真度达到66Pa以下。此后可还渐升温以加 速水分升华，但升温不宜过快，以免引起样品融化。 干燥时间视冻干机效率、样品装量及性质等而寂， 以样品最终水分含量达到1%～3%为准。具体操作时 是根据冻干样品呈酥块工松散片状；真空度接近空 载时最高真空；样品温度与管外温度接近。 完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封，并用高频 真空检测真空度。
微生物工程 - 03微生物育种及工业菌种退化复壮和保藏
微生物育种及工业菌种退化复壮和保藏方法一、代谢调控育种Metabolic Control Breeding１.营养缺陷型突变株（auxotroph mutant）•酶缺陷，结果造成中间产物积累；•解除协同反馈，使另一分支末端产物积累；•渗漏型突变（酶未完全丧失活性，下降），末端产物少，中间产物积累。
2.抗反馈调节突变株（regulation defective mutant）突变株筛选•调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏蛋白与不能结合或结合；•结合，但不发生作用；•结构基因突变，使结构酶无结合能力但有催化活性；方法：末端产物结构类似物筛选；营养缺陷型回复突变株筛选．3.组成型突变株（constitutive mutant）筛选•突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。
•筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。
①加诱导酶合成抑制物②交替培养法③显色反应法４.抗（敏感）性突变株（resistant mutant）筛选•包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体①抗生素抗性突变：提高产量②抗噬菌体突变：消除噬菌体污染③条件抗性突变：如温度，可提高产量④物敏突变：如氟乙酸敏感突变型，顺乌头酸酶活性极低，异柠檬酸产量少，柠檬酸积累。
二、基因重组育种（gene recombination breeding）基因重组育种的定义：是指采用接合、转化、转导、原生质体融合、有性杂交及准性生殖等遗传学方法和技术，使微生物细胞内发生基因重组，以增加优良性状的组合或者导致多倍体的出现，从而获得优良菌株的一种育种方法。
（P24第2段）1.原核生物的基因重组育种（1）接合（conjugation）定义；大肠杆菌的4种不同接合型菌株：F+、F-、Hfr菌株和F’菌株（2）转导（transduction）转导、转导子（transductant）、转导噬菌体（3）转化（transformation）转化、转化子（transformant）、感受态（competence）2.真核微生物的基因重组育种主要有有性杂交、准性杂交、原生质体融合和转化等形式。
食用菌菌种的提纯与复壮
食用菌菌种的提纯与复壮
一、提纯。
用各种方法分离得到的菌种，在培养基上萌发的新菌丝，有的活力强，有的弱，有的往往带有杂菌，为避免在生产中失败，应提纯后再使用。
其方法是：1、多孢杂交的，于无菌区内将健壮、生长快的菌丝体挑起移接到经灭菌过的母种培养基上。
2、各种方法分离的，于无菌区内将生长快而健壮的菌丝的尖端部位挑取黄豆大小的菌丝体移接到经灭菌过和母种培养基上。
经过提纯的菌丝长满以后，即可供作生产使用。
二、复壮。
食用菌种长期在同一培养基上培养和保藏时间过长，均会导致菌丝生活力降低，为夺取食用菌高产，必须经过复壮才能用于生产，其方法是：1、菌种在低温保藏期间应每隔2到3个月移接一次。
2、菌丝在各种营养成分有限的同一培养基上长期培养，因欠缺某种成分而丧失活力，以导致菌种老化，应适时变换培养基成分和比例，既可增强菌种活力，促进良种复壮，又可提高菌种成活率。
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生产菌种的选育培养—菌种的扩大培养及保藏
（三） 菌种的保藏
不同菌种保藏方法比较
方法名称
主要措施
适宜菌种 保藏期 评 价
冰箱保藏法（斜面）
低温
各大类
3~6月 简便
冰箱保藏法（半固体）
低温
细菌、酵母菌 6~12月 简便
石蜡油封藏法*
低温、缺氧
各大类**
1~2年 简便
沙土保藏法
干燥、无营养 产孢子微生物 1~10年 简便 有效
恢复和建立具有原来生产性状的群体。
菌种的复壮： 狭义：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离等技术，从已衰
退的群体中帅选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的 相应措施。
广义：在菌种尚未衰退前就有意识地采取纯种分离和生产性状的测 定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
菌种复壮的措施：
1. 菌种的提纯（稀释涂平板法等、单细胞分离 法）
第四节 菌种的扩大培养及保藏
菌种的扩大培养：将保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠 状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐 级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培 养物称为种子。
一、 菌种的扩大培养
广义：从斜面菌种开始到发酵罐接种之前的所有生产过程。 狭义：仅指生产车间种子罐的培养过程。
菌种衰退的后果： 1. 菌种的发酵能力降低 2. 繁殖能力降低 3. 发酵产品的得率降低
菌种衰退的原因：
1. 基因突变（基因负突变） 2. 变异菌株性状分离 （多次划线分离纯化） 3. 连续传代 （减少传代次数） 4. 其他因素 （温度、湿度、培养基成分）
（二） 菌种的提纯与复壮
菌种的提纯： 从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以
《发酵食品工艺学》复习提纲2020
第二章菌种选育、保藏与复壮（一）复习思考题1、什么是菌种选育？优良菌种选育的方法主要有哪些？3、微生物菌种保藏的目的（3个）、原理（2点）及常用的保藏方法（7种）。
4、造成菌种退化的原因是什么？生产中如何防止菌种的退化？（二）生产工艺流程第三章微生物的代谢调控理论及其在食品发酵中的应用（一）复习思考题1、什么是微生物代谢？微生物代谢过程的自我调节主要表现在哪些环节上？3、微生物代谢的反馈调节作用主要有哪些类型？在发酵生产中如何克服微生物代谢的反馈调节作用？（1）类型：反馈抑制和反馈阻遏（2）措施：1.改变微生物的遗传特性；2. 控制发酵的工艺条件；3.改变细胞膜的渗透性4、什么是代谢控制发酵？在发酵生产中改变微生物遗传特性来调控代谢的方法有哪些？5、通过控制细胞膜渗透性来提高发酵产物产量的原理是什么？（二）生产工艺流程第四章发酵工程学基础（一）复习思考题6、根据你所学的发酵工艺学知识，简述补料分批发酵的主要应用领域有哪些？7、发酵过程中引起发酵液温度变化的因素有哪些？对发酵过程有何影响？生产上发酵温度选择的依据是什么？（1）因素：生物热、搅拌热、辐射热、蒸发热（2）影响：温度影响细胞酶的活性、发酵液的性质、代谢产物的合成方向。
（3）依据：综合考虑微生物最适生长温度、发酵产物生成、通气条件等因素。
8、发酵液中溶解氧浓度对发酵过程有何影响？生产上如何控制发酵液溶解氧浓度？（1）影响：溶氧过高会引起能量过度消耗并对细胞产生危害、抑制代谢产物的合成、影响培养基的电位；溶氧过低影响微生物的呼吸，造成代谢异常。
（2）措施：配置搅拌叶和挡板，分散气体；改变通气量和搅拌速度，控制溶氧速率；控制发酵液黏度，改变传质阻力。
9、发酵过程中引起发酵液pH变化的因素有哪些？对发酵过程有何影响？生产上如何控制发酵液pH？（1）因素：①引起发酵液pH下降的因素—碳源过多、消泡油加多、生理酸性物质过多；②引起发酵液pH上升的因素—氮源过多、生理碱性物质过多、中间补料时，碱性物质添加过多。
菌种的衰退复壮和保藏
2、菌种保藏方法
1）斜面菌种低温保藏法---利用低温对微生 物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。 把斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液 等,直接放入4～5℃冰箱中。保藏时间一 般不超过3个月,到时必须进行移接传代, 再放回冰箱。
2）砂土管保藏法---将干燥砂粒与细土混合 后灭菌制成砂土管,然后接种保藏 。若把 砂土管放在低温或抽气后密封,效果更佳。 此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。 保藏期1～10年 3）石蜡油封藏法---向培养好的菌种斜面上, 加入灭菌石蜡油,高出斜面1cm,然后蜡封 管口,放入冰箱。该法既可防止培养基水 分蒸发,又能使菌种与空气隔绝。保藏期 1～ 2年
美国的“美国典型菌种收藏所”(ATCC)，保藏 方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结法。
2、衰退的防止
（1）控制传代次数 （2）创造良好的培养条件 （3）利用不易衰退的细胞传代 （4）采用有效的菌种保藏方法
二、菌种的复壮
1、复壮的定义：
狭义复壮：指的是在菌种已在发生衰退的情况下，通 过纯种分离和测定典型性状，生产性能等指标，从 已衰退的群体中筛迁出少数尚未退化的个体，以达 到恢复原菌株固有的性状的相应措施。 广义的复壮：是一项积极的措施，即在菌种的典型特 征或生产性状尚未衰退前，主经常有意识地采服纯 种分离和生产性状的测定工作，以期众中选择到自 发的正变个体。
第五节 菌种的衰退、复壮和保藏
一、菌种的衰退及其防治 1、衰退：是指由于自发突变的结果，而使某种 原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。 如原有形态性状变得不典型了，生长速度变慢， 代谢产物生产能力下降，致病菌对宿主侵染力 的下降，对外界不良条件包括低温、高温或噬 菌体侵染等抵抗能力的下降等。
3、菌种保藏中心
我国由于1979年7月成立了中国微生物菌种 保藏管理委员会(CCCCM),
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分解单宁、酶精制、酒精发酵工业 同枯草杆菌蛋白酶 葡萄糖制造、酒精厂糖化、医药 腐乳生产 蛋白除葡萄糖、脱氧、食品罐头贮存 淀粉和食品加工、饲料 食用、化工 葡萄糖制造、酒精厂糖化、调色剂
枯草芽孢杆菌
戊糖片球菌
植物乳杆菌
多粘类芽孢杆菌
酿酒酵母
粉状毕赤酵母
红葡萄浓缩汁中的酵母菌形态
② 土壤采样方法
土壤的细有菌机、质放线含菌量：和耕通地风、状菜园况和（近5～郊土25壤cm；深度） 土壤的酵p母H和菌植：果被园状树况根的土壤中；
•pH＜7.0 ：霉菌、酵母菌居多 地理条霉件 菌：动植物残体及霉腐土层中； 季•p节H7.条0黑件～曲7.霉5：：细稻菌场、、谷放物线堆菌积丰处富。
（二）富集培养
❖ 生物诱变因子 噬菌体、转座子等
（二）诱变基本方法及影响因素
❖ 诱变剂的选择：作用机理；突变谱 ❖ 诱变剂量选择：最适剂量（致死率70-80%时） ❖ 增效（变）剂：氯化锂（0.5%） ❖ 外部环境条件：如温度、氧气、pH、水分 ❖ 出发菌株的选择：生产菌株、野生菌株 ❖ 出发菌株的生理状态：细菌--对数生长期；幼年孢子；营养体；湿态敏
（优选）菌种选育保藏与复壮
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第一节 食品发酵与酿造工业菌种
一、现代发酵工业对菌种的要求
（1）非病源菌，不产生有害活性物或毒素；
（2）发酵周期短，发酵产物的产生能力强；
（3）高转化，易分离纯化，低成本，高质量；
（4）生长繁殖力强，速度快，较强产孢能力；
（5）原料广，价廉，易被微生物利用、转化；
① 富集培养的目的 利用人工环境，使样品中目标微生物成为优势菌。
② 富集培养的方法 控制培养基的营养成分 控制培养条件
③ 富集培养的方式 分批培养（Batch culture ） 连续培养（Continuous culture ） 分批补料培养（Fed-batch culture ）
（三）纯种分离
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溶磷细菌的平板筛选(5d)
高效溶磷的真菌菌株
青霉菌溶磷实验
（四）性能鉴定
❖ 生产性能测定
通常使用初筛和复筛的方法确定。直接从自然界分离
得到的菌株为野生型菌株。我们常将这些自然界中直
接获得的新菌株称为进一步育种工作的原始菌株或出
发菌株。 ❖ 毒性试验
若毒性大而且无法排除者应予以淘汰。
感（真菌：106 cfu/mL孢子悬浮液；细菌：108 cfu/mL的菌液） ❖ 诱变效应的测定：直接法和浓缩法，培养后测定目的产物量 ❖ 诱变方法：单因子、复合诱变 ❖ 优良突变株的筛选方法：随机筛选或半理性化筛选
利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性 状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株， 达到纯化与复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。其主要原理是微生物 群体分离。
❖ 自然选育的方法
（1）通过表现形态淘汰不良菌株； （2）考察目的代谢产物产量； （3）进行遗传基因型纯度试验，考察菌种纯度； （4）传代稳定性试验：斜面传3-5代。
自 然 选 育
05年江南大学微生物(发酵)考研试题
资料显示，某些芽孢杆菌具有分解和利 用葡聚糖的能力，请设计方案从自然界中筛选 一产葡聚糖酶的菌株，并简要分析各主要步骤 的依据。
三、诱变育种
❖ 诱变育种：指人为地、有意识地将对象生物置于诱变因子中， 使该生物体发生突变，从这些突变体中筛选具有优良性状的 突变株的过程。 提高了菌种发生突变的频率和变异幅度，提高获优机率。
❖ 突变：在自然状况下发生的突变—自然突变（10-6~10-9） ❖ 诱变：人为地利用物理或化学因素诱发的突变（10-4~10-5） ❖ 诱变剂：能够显著提高突变频率的物理或化学因素。
（一）常见诱变剂及作用基本原理
❖ 物理诱变因子 紫外线、X射线、快中子等
❖ 化学诱变因子 硫酸二乙酯（DES）、亚硝酸、 吖啶橙
菌种种属的鉴定
• 鉴定工作的内容
（1）测定一系列必要的鉴定指标； （2）查找权威鉴定手册，确定菌种类型。
• 鉴定方法
（1）经典的分类鉴定方法：形态学特征；生理生化特征； 血清学试验与噬菌体分型；氨基酸顺序和蛋白质分析
（2）现代分类鉴定方法：微生物遗传型；细胞化学成分； 数值分类法
二、自然选育
❖ 自然选育的定义
（1）平板划线分离法 （2）稀释分离法 （3）涂布分离法 （4）毛细管分离法 （5）小滴分离法
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初筛和复筛
（1）初筛（定性——粗放！） ① 平板筛选 （变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈 ） ② 摇瓶发酵筛选
（2）复筛（定量——精确！） 1个菌株重复3～5瓶，精确分析 如酶活力单位、耐酒精程度等。
产朊假丝酵母
黑曲霉
黑曲霉
青霉
米曲霉
蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等
根霉
绿色木霉
产生微晶纤维素酶，羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶，可完全水解纤维素。
拟康氏木霉
产生纤维素酶，羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶，可完全水解纤维素。
第二节 菌种选育
一、新菌种的分离与筛选
样品 采集
富集 培养
产物 谷氨酸 肌苷酸 淀粉酶 蛋白酶
葡萄糖异构酶
酒精 单细胞蛋白 乳糖酶 柠檬酸 柚苷酶、酸性蛋白
酶 单宁酶、糖化酶 蛋白酶 糖化酶、甾体激素 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 纤维素酶 淀粉酶 糖化酶、红曲色素
用途 食用、医药 食用、医药 葡萄糖、糊精、酒精发酵、啤酒酿造 酱油速酿、饲料
由葡萄糖制造果糖
医药、食用 酵母菌体蛋白 食品工业 食用、医药
（6）对添加的前体物质有耐受能力；
（7）菌种纯，遗传特性稳定，抗噬菌体能力强。
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二、现代发酵工业常见菌种
类别
细菌 酵母菌
霉菌
微生物名称 短杆菌 短杆菌 枯草杆菌 枯草杆菌 巨大芽孢杆
菌 酒精酵母 假丝酵母 脆壁酵母 黑曲霉
黑曲霉
黑曲霉 栖土曲霉 根霉 毛霉 青霉菌 木霉菌
样品来源越 广泛，获得 新菌种的可 能性越大。
利用人工环 境，使样品 中目标微生 物成为优势 菌。
纯种分离的 常用方法有 平板划线分 离法、稀释 分离法和涂 布分离法。
一般生产性 能的测定通 过初筛和复 筛的方法来 确定。
（一）样品采集
① 原则
样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。