病毒灭活去除验证指南
广州病毒杀灭试验流程
广州病毒杀灭试验流程一、实验方法1、在实验室中处理对象样品。
根据对象样品分类，按照临床诊断需要，将相应样本放入实验室进行测试。
2、使用广州病毒杀灭法进行检测。
首先，将样品放入实验室，进行病毒检测，使用广州病毒杀死试剂，将检测出的病毒杀死。
然后，采用真菌杀灭法对样品进行处理，以寻找对象样品中存在的病原体，并根据DNA片段结果，进行具体分类。
3、实施为期两周的持续体外实验，研究病毒的感染性和储存性。
病毒样品在环境温度下存放，在细胞培养液中发酵，连续不断地培养，记录各个培养周期的滴度、颜色和沉淀物情况。
4、用标准病毒样品对试剂进行品质检查，确定试剂的效力和灭活率。
首先，使用标准病毒样品，取出所需的病毒样品，然后测定标准病毒样品中含有的病毒，把病毒放入广州病毒杀死试剂中，同时检查样品中携带的病毒情况，以确定杀灭试剂的杀伤力和灭活率。
5、病毒死亡率测试。
采用病毒杀伤试验计算病毒死亡率，先将试剂与样品接触，然后测定接触时间，同时根据细胞培养中活性病毒的分离数量来计算杀伤力。
二、实验结果1、检测结果显示，使用广州病毒杀灭试剂处理的样品，其病毒滴度及沉淀物较好，对对象样品的检测结果显示可靠，与临床诊断的结论一致。
2、根据实验结果，证实了使用广州病毒杀灭试剂可以有效地检测出病毒样品中存在的病原体，可靠地分类病毒样品，满足临床需求。
3、根据病毒杀伤试验计算，计算出病毒杀伤环境中的病毒死亡率在90%以上，为安全治疗病毒提供了坚实的理论基础。
以上为广州病毒杀灭试验的流程，为临床检测提供便利并提高检测效率，扩大病毒杀伤范围，为安全准确的治疗病毒提供可靠依据。
血液制品去除灭活病毒技术方法及验证指导原则
血液制品去除灭活病毒技术方法及验证指导原则LT血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则目前已知经血液制品传染的病毒主要有HBV、HCV、HIV-1、HIV-2、HTLV和细小病毒B19。
尚未发现经血液制品传染CJD。
但有少数研究报告发现有实验性传染现象，因此要密切关注CJD，特殊是vCJD的发展动向。
为了提高血液制品安全性，生产工艺要具有一定的去除/灭活部份病毒能力，生产过程中应有特定的去除/灭活病毒方法。
本技术指导原则是对血液制品（指以人血浆为原料制备的制品）生产过程以及特定的去除/灭活病毒方法验证的指导原则，包括指示病毒和病毒去除/灭活方法的选择、验证方案的设计、结果判定以及附录所列技术验证申报的程序。
一、去除/灭活病毒方法的选择由于不同类血液制品潜在的污染病毒的可能性不同，为此选择病毒去除/灭活方法的侧重点也应有所不同：（一）凝血因子类制品生产过程中应有特定的能去除/灭活脂包膜和非脂包膜病毒的方法，可采用一种或者多种方法联合去除/灭活病毒。
（二）免疫球蛋白类制品对于免疫球蛋白类制品（包括静脉注射用人免疫球蛋白、人免疫球蛋白和特异性人免疫球蛋白）生产过程中应有特定的灭活脂包膜病毒方法。
但从进一步提高这种制品安全性考虑，提倡生产过程中加入特定的针对非脂包膜病毒的去除/灭活方法。
（三）白蛋白采用低温乙醇生产工艺和特定的去除/灭活病毒方法，如巴斯德消毒法等。
二、常用的去除/灭活病毒方法评价（一）巴斯德消毒法（巴氏消毒法）1．人血白蛋白制品几十年临床应用结果表明，白蛋白的巴氏消毒法对HIV和肝炎病毒是安全的。
其病毒灭活条件已很完善，可不要求进行病毒灭活验证。
但是必须对巴氏消毒法所用设施进行验证，使巴氏消毒各参数符合要求（包括制品内温度分布的均一性和灭活时间）。
首先，应该选择经血液传播的相关病毒（如：HIV），不能用相关病毒的，要选择与其理化性质尽可能相似的指示病毒；第二，所选择的病毒理化性质应有代表性（病毒大小、核酸类型以及有无包膜），其中至少应包括一种对物理和/或者化学处理有明显抗性的病毒。
病毒灭活去除验证指南
HCV markers
HCV RNA
Anti-HCV
0 10
20 30 40
50 60 70 80 90 100
Days
HIV markers
HIV RNA (plasma) HIV antibody
11 16 22
HIV p24 antigen
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
S/D法(Solvent/Deterdent) IgG、凝血因子、血浆
低pH孵放法(pH4
IgG
incubation)
干热(Dry-heat treatment) 凝血因子
纳米膜过滤法 (Nanofiltration)
凝血因子、 IgG
制造过程 病原体（病毒）灭活和去除
• 血浆蛋白纯化 -去除不需要的蛋白质 -去除潜在的病毒污染 -纯化步骤 乙醇沉淀 乙醇/PEG沉淀 层析/免疫亲和层析 纳米膜过滤
1319无犬细小病毒canineparvovirus猪细小病毒porcineparvovirus病毒灭活与去除的方法1化学方法溶剂去污剂有机溶剂磷酸三丁酯tnbp去污剂tween80tritonx100对脂包膜病毒有效对非脂包膜病毒无效b丙内酯法2光化学方法甲基蓝加上甲基蓝然后进行光照导致灭活临床用血浆mb血浆3物理方法去除纳米膜过滤层析法免疫亲和层析沉淀法酒精硫酸鞍加热灭活干热法冻干终产品蒸汽处理热的水蒸汽巴氏消毒法60c10小时病毒灭活工艺灭活工艺产品类型巴氏消毒法60c10hrpasteurization
1%TNBP和1%TritonX-100， 30℃孵育4小时处理血浆灭活病毒情况
病毒种类
VSV
灭活病毒（log 10） 灭活病毒时间（小
广州病毒杀灭试验标准
广州病毒杀灭试验标准
(1)病毒样本的准备：病毒样本的室温准备方法：1.准备病毒样本，
将病毒样本放置在室温下，避免阳光直射；2.将病毒样本保存在4℃以上，但不超过8℃，可以持续保存2周；3.如果病毒样本长时间无法使用，应
该在−20℃以下制冷保存，最长可以持续保存6个月；4.样本宿主细胞一
般以干冰保存，可以在−80℃以下最长可以持续保存2年或者更长时间。
(2)杀灭试验：1.使用定期消毒剂进行消毒，包括各种消毒剂的池液或者
气体的应用；2.试验时，室温应该在20℃以上，对病毒杀灭效率有较好
的效果；3.试验期间，应控制消毒剂的浓度和接触时间，以及病毒样本的
水分含量；4.根据不同的病毒，应调整杀灭时间和消毒剂浓度，以及最终
消毒剂的残存量；5.杀菌效果最终需要进行荧光定量PCR分析，以确定最
终效果。
血液制品去除灭活病毒技术方法及验证指导原则
血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则目前已知经血液制品传染的病毒主要有HBV、HCV、HIV-1、HIV-2、HTLV和细小病毒B19。
尚未发现经血液制品传染CJD。
但有少数研究报告发现有实验性传染现象，因此要密切关注CJD，特别是vCJD的发展动向。
为了提高血液制品安全性，生产工艺要具有一定的去除/灭活部分病毒能力，生产过程中应有特定的去除/灭活病毒方法。
本技术指导原则是对血液制品（指以人血浆为原料制备的制品）生产过程以及特定的去除/灭活病毒方法验证的指导原则，包括指示病毒和病毒去除/灭活方法的选择、验证方案的设计、结果判定以及附录所列技术验证申报的程序。
一、去除/灭活病毒方法的选择由于不同类血液制品潜在的污染病毒的可能性不同，为此选择病毒去除/灭活方法的侧重点也应有所不同：（一）凝血因子类制品生产过程中应有特定的能去除/灭活脂包膜和非脂包膜病毒的方法，可采用一种或多种方法联合去除/灭活病毒。
（二）免疫球蛋白类制品对于免疫球蛋白类制品（包括静脉注射用人免疫球蛋白、人免疫球蛋白和特异性人免疫球蛋白）生产过程中应有特定的灭活脂包膜病毒方法。
但从进一步提高这类制品安全性考虑，提倡生产过程中加入特定的针对非脂包膜病毒的去除/灭活方法。
（三）白蛋白采用低温乙醇生产工艺和特定的去除/灭活病毒方法，如巴斯德消毒法等。
二、常用的去除/灭活病毒方法评价（一）巴斯德消毒法（巴氏消毒法）1．人血白蛋白制品几十年临床应用结果表明，白蛋白的巴氏消毒法对HIV和肝炎病毒是安全的。
其病毒灭活条件已很完善，可不要求进行病毒灭活验证。
但是必须对巴氏消毒法所用设施进行验证，使巴氏消毒各参数符合要求（包括制品内温度分布的均一性和灭活时间）。
2．其它血液制品（液体制剂）由于制品的组成、稳定剂（如：氨基酸、糖、枸橼酸盐等）及其浓度的不同，均会对灭活病毒效果有一定的影响。
因此在采用巴氏消毒灭活病毒方法时必须进行病毒灭活效果验证。
病毒灭活验证模版
***注射液病毒灭活工艺验证研究1 “***注射液”生物原材料-**（动物）的病毒污染验证文献综述2 用于生产“***注射液”的生物原材料-**（动物）的病毒感染的检测3 模拟生产工艺条件下对指示病毒的灭活实验1 “***注射液”生物原材料-**（动物）的病毒污染验证文献综述根据现有的研究结果，***（动物）的病毒包括***、***、***、……*种，其中***、***……病毒可感染人类。
以下按***（动物）源性病毒的来源、种类及分布；人体的危害（是否人畜共患）；理化特性；检测方法的次序对各病分述如下：1、***症……2、……附表1 ***（动物）源性病毒的特征病毒名称病毒的分类核酸类型囊膜病毒颗粒大小（nm）***病毒***科***属RNA or DNA 有or 无***~***……附表2 ***（动物）源性病毒的理化性质病毒名称温度耐受性pH耐受性化学物质敏感性***病毒可耐***℃可耐pH*** 能抵抗***，对***敏感……附表3 ***（动物）源性病毒的检测方法病毒名称血清抗体检测方法病毒抗原检测组织样品方法***病毒**** 皮肤、肝、口腔分泌物、粪便等*** ……参考文献1、*****2、2 用于生产“***注射液”的生物原材料-**（动物）的病毒感染的检测1、原理及目的所有用于制药生产的生物性原材料等都有受到病毒污染的可能性，为验证“***注射液”的生物原材料-**（动物）种***、***病毒的感染情况，特进行下述实验。
验证以保证生物原材料的安全性。
2、检测方法的选择综前所述，目前已发现的**动物病毒性感染共有*种，其中***、***可感染人。
我们对其中较为重要***、***病毒作为评价***动物病毒感染的指标，进行现场的采样检测，涉及的项目主要是：***抗体检测和病毒抗原检测……3、生物样品的种类及采样方法3.1 血清抗体检测样品在动物饲养场随即抽取生长健康、无疾患，体重在***—***的动物**只，从***采血***ml（无菌操作，置于*ml试管封口4℃保存备用）。
灭活实验操作规程
灭活实验操作规程
《灭活实验操作规程》
一、实验室准备
1. 确保实验室处于干净整洁的状态，消毒工作台和实验用具。
2. 检查灭活试剂的储存情况，确保其有效期和储存条件符合要求。
二、实验操作步骤
1. 戴上实验手套和口罩，确保个人安全。
2. 将待处理的病毒培养物装入离心管中。
3. 在生物安全柜中，将灭活试剂缓慢滴加至病毒培养物中，按比例掺和均匀。
4. 确认灭活试剂与病毒培养物充分混合后，放置在规定的温度和时间条件下进行灭活，同时确保不会造成环境污染。
5. 灭活完成后，取样检测是否彻底灭活，确保病毒已经失去传染性。
三、清洁消毒
1. 将所有使用过的实验用具进行高温高压消毒处理。
2. 按照规定，对工作台和生物安全柜进行彻底清洁消毒。
四、实验记录和报告
1. 记录实验操作步骤和结果，包括灭活试剂的使用量和时间，灭活效果的检测结果等。
2. 完成实验后，及时向上级主管报告实验结果，确保实验过程的透明和规范。
五、安全注意事项
1. 在操作过程中，严格遵守实验室安全操作规程，确保自身和他人的安全。
2. 确保灭活试剂的有效性和正确使用，避免因操作失误导致病毒逸出造成安全事故。
六、环境保护
1. 实验结束后，对实验室进行彻底清洁并进行环境消毒，避免病毒传播造成环境污染。
2. 合理处理实验废弃物、废液和废弃的实验用具，做到妥善处理和分类处置。
以上即为《灭活实验操作规程》，希望实验人员在进行灭活实验时，能够严格遵守规程，确保实验安全和实验效果。
灭菌效果验证方案
灭菌效果验证方案1. 引言灭菌是在医疗领域和实验室中至关重要的过程。
确保灭菌的有效性对于保护患者免受感染以及维持实验的准确性至关重要。
本文档提供了一个灭菌效果验证方案，用于评估灭菌过程的有效性和一致性。
2. 目标本方案的目标是验证灭菌过程的有效性，确保有效灭除细菌、病毒和其他微生物，以保障患者安全和实验的准确性。
验证结果将用于确定灭菌过程是否需要调整或改进。
3. 实验步骤以下是验证灭菌效果的步骤：3.1 选择测试菌株在验证灭菌效果之前，需要选择一种具有代表性的菌株进行实验。
可以选择常见的致病菌，如大肠杆菌（Escherichia coli）或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
确保选择的菌株对灭菌过程具有挑战性。
3.2 准备灭菌设备和材料准备用于灭菌的设备和材料，包括灭菌器、培养基、试验样品（如医疗器械或实验室玻璃器皿）等。
3.3 设计实验组和对照组将实验组分为以下两个组：灭菌组和未灭菌组。
将实验组中的样品置于灭菌器中进行灭菌处理，而未灭菌组中的样品保持原样。
3.4 灭菌处理将实验组中的样品置于灭菌器中，设置适当的温度和时间来完成灭菌过程。
确保灭菌过程符合相关的灭菌标准和要求。
3.5 培养菌株并计数从实验组和未灭菌组中取样品，并在培养基上进行培养，以促进菌落的生长。
培养和计数菌落的方法应符合相关的实验室标准。
3.6 数据分析将实验数据进行统计分析，比较实验组和对照组的菌落计数。
根据结果评估灭菌过程的有效性。
4. 结果与讨论根据菌落计数的结果，可以评估灭菌过程的效果。
如果实验组中的菌落计数明显低于未灭菌组，则可以认为灭菌过程是有效的，并且可以继续使用。
如果实验组和未灭菌组的菌落计数相似，则应重新评估灭菌过程，并可能采取改进措施。
5. 结论本文档提供了一个用于验证灭菌效果的方案，通过实验和数据分析来评估灭菌过程的有效性。
这些验证结果对于保障患者安全和实验准确性至关重要。
在实践中，可以根据具体情况进行调整和改进，以确保灭菌过程的一致性和有效性。
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浓缩血小板处理
• 方法： 高浓度的需氧致病菌和革兰氏阳性菌 （10种）、革兰氏阴性菌（7种）、螺旋 菌（2种）加到浓缩血小板中（3.0×1011
- 6.0×1011 ），150umol/L补骨脂和 3J/cm2 UVA的照射
150umol/L补骨脂和 3J/cm2 UVA的照射 （血小板）
细菌 表皮葡萄球菌 金黄色葡萄球菌
最终选定条件
• 10%蛋白浓度 • 16mM辛酸盐 • pH4.5 • 30℃以上放孵10小时
验证结果
• HIV＞5.5 log • BVDV ＞4.7 log • Sindbis＞7.1 log • PRV ＞4.9 log
优点
• 稳定剂，安全可靠 • 与S/D 法比较，对某些病毒灭活速度快
NAT/PCR 缩短“窗口期”
病毒核酸
宿主对病毒的抗体
数量
感染的时间
血清学窗口期 NAT/PCR 窗口期
PCR 可检测 病毒
血清学试验可 检测抗体
PCR 检测可缩短窗口期
时间
HBV markers
HBV DNA (PCR)
Infection
anti-HBc HBsAg
ALT
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
HCV
RNA
有
人类免疫缺陷病毒
HIV 1
RNA
有
1 和2
HIV 2
甲型肝炎病毒
HAV
RNA
无
微小病毒 B19 新出现的病毒
B19
DNA
无
缩写
核酸类型
包膜
西尼罗河病毒
WNV
RNA
有
冠状病毒 (SARS)
SARS-CoV
RNA
有
猴痘病毒
MPXV
DNA
有
病毒的选择
病毒 HIV HBV HCV HAV
B19
沙雷氏菌 大肠埃希菌
密螺旋体 包柔氏螺旋体菌
灭活量（Log 10） ＞6.6 ＞6.6 ＞6.7 ＞6.4 ＞6.8 ＞6.9
150umol/L补骨脂和 3J/cm2 UVA的照射 （血浆）
病毒 DHBV HBV HCV BVDV HIV HIV（细胞内）
灭活量（Log 10） 5.4
≥4.5 ≥4.5 ≥6.7 ≥5.9
病毒灭活与去除的方法
1、化学方法 • 溶剂/去污剂
-有机溶剂磷酸三丁酯（TNBP） -去污剂Tween-80,Triton X-100 -对脂包膜病毒有效，对非脂包膜病毒无效 • β-丙内酯法 2、光化学方法 • 甲基蓝 -加上甲基蓝 -然后进行光照，导致灭活 -临床用血浆“MB-血浆”
病毒灭活与去除的方法
1.补骨脂处理新鲜冰冻血浆
• 补骨脂：豆科补骨脂属植物补骨脂的成 熟果实。2000版中国药典收载
• 化学成分：香豆精类补骨脂素，也叫补 骨脂内酯
• 光敏感剂 • 补骨脂S-59：补骨脂素盐酸衍生物
补骨脂S-59作用原理
• 补骨脂S-59在长波紫外线的光化学处理 下，在DNA嘧啶基中形成链中交联，从 而抑制DNA的合成
• 第二种机理 间接作用，生产自由基和其它活性物质， 作用蛋白质和核酸
2.3、2.8、3.0mRad分别处理冻干 产品
品种
保留活性%
人纤维蛋白原
93
FVIII
67
α1-API
80
4.碘
• 是强氧化剂 • 游离碘 • 结合到聚合物（聚乙烯咯烷酮、淀粉、
葡聚糖），结合碘逐渐释放，灭活需几 小时 • 碘/葡聚糖处理IVIG，灭活PPV＞4Log， • IVIG结构和功能未变，蛋白质未发生碘 化
5.巴氏消毒新鲜冰冻血浆
• 稳定剂：1300g/L山梨醇、514g/L蔗糖、 4mM葡萄糖酸钙、15mM枸橼酸钠、 5g/L精氨酸
• 60℃、10小时 • 保存80-90%凝血因子活性 • 透析去除稳定剂
病毒灭活剂-辛酸盐
• 原理：非离子化的辛酸分子能进入病毒 包膜，并破坏包膜脂质层或破坏嵌入在 包膜脂质层的蛋白质，从而影响病毒脂 包膜的完整性。在低pH条件下，辛酸盐 呈最大的非离子化形式，从而能达到最 佳的灭活病毒的效果。
≥ 14.1 ≥ 14.1
Source: Aventis Behring, Virology – Data on file
HAV CPV
4.1 3.5 ≥ 6.8 1.2 ≥ 10.9 4.7– 46 –
IVIG用巴氏消毒法灭活伪狂犬病毒 (PRV)
Virus Titre [CCID50 log10]
包膜 指示病毒
有 HIV
有 鸭乙肝病毒(Duck HBV)、伪狂犬病毒 (Pseudorabies virus)
有 BVDV、Sindbis病毒
无 HAV、脊髓灰质炎病毒(Polio virus)、 脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus)
无 犬细小病毒(Canine parvovirus)、猪细小 病毒(Porcine parvovirus)
1%TNBP和1%TritonX-100， 30℃孵育4小时处理血浆灭活病毒情况
病毒种类
VSV
灭活病毒（log 10） 灭活病毒时间（小
时）
≥7.5
0.25
Sindbis virus
≥6.9
0.25
Duck hepatitis B
≥7.3
2.5
virus
BVDV
≥6.1
0.25
HIV
≥7.2
0.25
免疫球蛋白
白蛋白:
20%人白蛋白
生产步骤
血浆
冷沉淀
1. 乙醇沉淀法 2. 乙醇沉淀法
(38% and 40% 乙醇) 透析 / 填充 巴氏消毒法 20%人白蛋白 总减少因数
病毒平均减少因数 (log10)
HIV 1 BVDV
PRV
≥ 5.1 ≥ 6.7 ≥ 11.8
≥ 5.3
≥ 6.6
≥ 8.8
≥ 7.5
S/D法(Solvent/Deterdent) IgG、凝血因子、血浆
低pH孵放法(pH4
IgG
incubation)
干热(Dry-heat treatment) 凝血因子
纳米膜过滤法 (Nanofiltration)
凝血因子、 IgG
制造过程 病原体（病毒）灭活和去除
• 血浆蛋白纯化 -去除不需要的蛋白质 -去除潜在的病毒污染 -纯化步骤 乙醇沉淀 乙醇/PEG沉淀 层析/免疫亲和层析 纳米膜过滤
关键
离心
EEE
吸附 沉淀 巴氏消毒法 层析法 过滤
制造过程
孔氏法
混合血浆
生产步骤
E EE
冷沉淀
E EE
E EE
8% 沉淀 组分 I)
25% 沉淀 组分 II + III)
40% 沉淀 组分 V)
最终蛋白质
VIII因子:
纤维蛋白原
IX因子: PCC: C1-抑制物:
XIII因子: 抗凝血酶 III:
20-60倍 • 不影响蛋白质的生物学活性 • 得率提高
二.我国对血液制品病毒去除/灭 活验证的管理
病毒灭活/去除(Viral inactivation
and removel)-1
• 为了做好血液制品病毒去除/灭活工作，卫生部 下发了〔卫药政发（1994）第264号〕文。此 文对去除/灭活病毒方法及检测效果作了相应规 定。
指导原则内容包括
• 去除/灭活病毒方法的选择 • 常用的去除/灭活病毒方法的评价 • 特定的去除/灭活病毒方法的选择 • 特定的去除/灭活病毒方法的验证 • 生产工艺去除/灭活病毒能力的验证 • 附录：技术验证申报程序
血浆制品相关病毒传播
名称
缩写核酸类型包膜源自乙型肝炎病毒HBV
DNA
有
丙型肝炎病毒
8
7
6
5
4 3
PRV
2
1
0
-1
检测极限
0
2
4
6
8
10
Treatment time [h]
FVIII用S/D法灭活伪狂犬病毒 (PRV)
Virus Titre [CCID50 log10]
6
5
4
3 PRV
2
1
0
-1
检测极限
3、物理方法 • 去除
-纳米膜过滤 -层析法（免疫亲和层析） -沉淀法（酒精、硫酸铵） • 加热灭活 -干热法（冻干终产品） -蒸汽处理（热的水蒸汽） -巴氏消毒法（60℃、10小时）
病毒灭活工艺
灭活工艺
产品类型
巴氏消毒法(60 ℃、10hr) 白蛋白、IgG、凝血因子 （Pasteurization）
1uM 亚甲基兰和1小时白光照射处理血浆灭活病毒情况
病毒种类 VSV SIV
Semliki forest virus HSV
West Nile virus Sindbis virus
BVDV HIV (细胞外) HIV(细胞内)
Dock HBV HAV
灭活（log 10） 5.0 ≥6.3 ≥7.0 ≥5.5 ≥6.5 ≥9.7 ≥5.0 ≥6.3 0 3.9 0
6.4
2.UVC光照射
• UVC光照射直接作用核酸 • 含单股核酸的病毒更敏感 • HAV和细小病毒更敏感 • 有效灭活非脂包膜病毒和耐热、耐酸病
毒（脊髓灰质炎病毒II型、 T4噬菌体和 牛痘）
0.1 或 0.2J/cm2 UVC的照射-白蛋白 （0.8 或1.6mM芸香苷）
0.05 或 0.1J/cm2 UVC的照射-IVIG （0.5 或1.0mM芸香苷）