高效液相色谱仪(HPLC)校正方法
高效液相色谱仪的四种检测方法及计算
高效液相色谱仪的四种检测方法及计算高效液相色谱仪（HPLC）在化学、生物学、制药、食品等领域都有广泛应用，其检测方法多种多样，以下将详细介绍四种常用的检测方法及其计算方式。
一、紫外-可见光检测法 (UV-Vis)紫外-可见光检测法是最常用的HPLC检测方法。
在此方法中，样品组分在紫外或可见光区域有吸收，因此可以被检测。
计算方法一般采用峰面积或峰高法定量。
峰面积法比峰高法更为准确，因为它同时考虑了峰的高度和宽度。
在计算时，首先需要获得标准品的校正曲线，然后根据未知样品的峰面积或峰高在校正曲线上找到对应的浓度。
二、荧光检测法 (Fluorescence)荧光检测法的灵敏度通常比紫外-可见光检测法更高，但并非所有化合物都能产生荧光。
在这种方法中，样品组分被激发光照射后发出荧光，荧光强度与组分浓度成正比。
计算方式与紫外-可见光检测法类似，也是通过校正曲线进行定量。
三、电化学检测法 (Electrochemical Detection)电化学检测法通常用于检测具有电化学活性的化合物，如许多药物和神经递质。
它可以在没有光学性质的情况下对物质进行检测，提高了HPLC的应用范围。
常见的电化学检测方法包括安培检测法和电导检测法。
定量计算通常基于法拉第定律，即电流与通过电解池的电荷量成正比。
四、质谱检测法 (Mass Spectrometry)质谱检测法是与HPLC连用的一种高级检测方法，可以提供待测物质的分子量信息，从而确定其化学结构。
在此方法中，HPLC分离后的组分直接进入质谱仪进行检测。
定量计算通常使用内标法或外标法，需要对待测物质进行同位素标记或使用已知量的内标物质。
此外，还可以使用多反应监测模式（MRM）进行更准确的定量。
以上四种方法各有优缺点，应根据具体的应用需求和样品性质选择合适的方法进行检测和计算。
同时，为了获得准确可靠的结果，还需要对HPLC系统进行适当的维护和校准。
简述安捷伦高效液相色谱仪的操作流程和注意事项
简述安捷伦高效液相色谱仪的操作流程和注意事项
安捷伦高效液相色谱仪（Agilent HPLC）是一种常用的分析仪器，广泛应用于化学、生物、环境等领域。
其操作流程和注意事项如下：
操作流程：
1. 准备样品溶液：根据分析目的选择适当的溶剂，将样品溶解或稀释至所需浓度。
2. 准备色谱柱：根据分析需求选择合适的色谱柱，并按照柱床规定的要求进行预处理，如洗涤、调pH等。
3. 连接系统：将色谱柱安装在仪器上，连接好进样器、泵、检测器和废液收集器等组件，确保连接紧密无漏。
4. 设置方法参数：根据分析需求，设置泵的流速、进样器的进样量、检测器的波长和灵敏度等方法参数。
5. 系统平衡：启动泵和检测器，运行空白试验，确保色谱柱和系统内部达到平衡状态。
6. 样品进样：将样品进样器插入样品瓶中，抽取足够的样品并注入进样器，按下进样按钮进行进样。
7. 进行分离：启动泵，使流动相通过柱床，样品分离过程中不断采集检测器的信号。
8. 数据处理：分析和处理检测器输出的信号，得出对应的峰面积、峰高度等结果，进行数据分析和解释。
注意事项：
- 严格按照使用手册和方法要求操作仪器，遵循操作规程，避免误操作和事故发生。
- 确保色谱柱、进样器及连接部分的密封性良好，防止泄漏和污染。
- 选择适当的溶剂和流动相，避免与柱材和样品相互作用，影响分析结果。
- 定期检查和维护仪器，如泵的排气、封头的更换、泄漏点的处理等，确保仪器正常运行。
- 样品处理过程中，注意避免光线、温度和湿度的影响，尽量保持稳定的分析环境。
- 使用仪器前，需提前熟悉相关方法和仪器操作，做好实验前的准备工作。
高效液相色谱仪的操作步骤
高效液相色谱仪的操作步骤高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分离和分析技术。
它利用液体流动相和固定相之间的相互作用，将样品中的混合物分离出来，并通过检测器进行定量分析。
本文将介绍高效液相色谱仪的具体操作步骤。
1. 准备工作在进行高效液相色谱仪的操作之前，首先需要进行一些准备工作。
检查色谱柱是否安装正确，确保色谱柱是干净的，并检查流动相的配制是否准确。
2. 样品制备根据需要分析的物质，准备好待测样品。
样品制备可以包括溶解样品、过滤样品等步骤，以确保样品的纯净度和稳定性。
3. 仪器开机将高效液相色谱仪接通电源，打开仪器的电源开关。
等待仪器初始化，并确保仪器各个部分正常工作。
4. 设置参数在仪器上设置分析所需的参数。
包括选择适当的检测器类型和检测波长、设置流量、温度等。
5. 启动系统启动高效液相色谱仪系统，等待系统稳定。
通常需要一段时间使得流动相在管路中充分平衡，并确保流量稳定。
6. 校正进行色谱柱的校正。
校正过程包括流量校正、波长校正等。
通过校正可以保证仪器输出结果的准确性和可靠性。
7. 注射样品将样品通过注射器引入色谱柱中，控制样品的注射量，通常在微升至毫升的量级。
确保样品的注射量稳定和准确。
8. 分离分析开始运行高效液相色谱仪系统，进行样品的分离与分析。
在此期间，流动相通过色谱柱，将样品中的化合物根据它们与固定相之间的相互作用进行分离。
9. 监测结果通过检测器对分离后的化合物进行监测。
根据检测器的信号，可以得到每个化合物的峰面积、保留时间等数据。
10. 数据处理将监测到的信号输入到数据处理软件中，进行结果的计算和分析。
通常可以得到各个化合物的峰高、峰面积等数据，从而实现对样品的定量分析。
11. 关机分析结束后，关闭高效液相色谱仪的电源开关，并进行必要的清洗和维护工作。
确保仪器的正常运行，并延长其使用寿命。
总结：高效液相色谱仪的操作步骤涵盖了仪器准备、样品制备、仪器设置、校正、样品注射、分离分析、结果监测和数据处理等多个方面。
安捷伦高效液相色谱仪的规范操作
安捷伦高效液相色谱仪的规范操作安捷伦高效液相色谱仪 (Agilent High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC) 是一种常用的色谱分析仪器，广泛应用于化学、生物、药学等领域中的分析和研究工作。
为了确保正确、可靠地操作 HPLC 仪器，以下是一些规范操作的步骤和注意事项。
1.仪器准备-开启仪器电源，并等待仪器自检完成。
-检查仪器的梯度系统、进样系统、柱温控制系统、检测系统等是否正常。
-检查注射器、柱、检测器等是否清洁干净，并按需更换柱筒。
2.试剂准备-准备所需的溶剂、标准品和样品，并确保其纯度和浓度符合实验要求。
-制备规范的稀释液或内标溶液，以便进行质量控制和校准。
3.方法设置-设置流速、梯度、柱温、检测器波长等实验参数。
-设定样品进样量、进样方式和柱温控制方式。
-根据实验要求选择合适的检测器（如紫外检测器、荧光检测器等）。
4.柱的装置和平衡-根据实验需求选取合适的柱，并将柱安装在柱底座上。
-将导线连接到柱温控制系统，并设置柱温。
-选择适当的流动相溶剂，用它们预平衡柱，以确保柱达到稳定状态。
5.校正与质控-使用标准品进行系统灵敏度和线性范围的校正。
-定期进行质控分析，以检验仪器的准确性和精确性。
-根据需要，进行合适的质量控制和校正操作。
6.样品进样-根据实验要求选择合适的进样方式（如自动进样器、手动进样器等）。
-通过进样器吸取样品，并确保进样量准确无误。
-进行一定的进样准备，如过滤、稀释等。
7.开始分析-确保所有仪器参数正确设置，样品进样准备完毕，并进行柱的平衡。
-点击“开始”按钮，启动分析程序。
-监测分离曲线或结果，确保分析结果的准确性与可靠性。
8.数据分析与存储-持续监测和记录实时分析结果。
-对结果进行后处理和数据分析，如绘制色谱图、峰面积计算等。
-存储数据，以备后续分析和查阅。
9.仪器维护与清洁-使用完毕后，关闭仪器并断开电源。
-清洗注射器和柱等关键部位，以防止残留的样品引起交叉污染。
高效液相色谱仪 液相色谱仪检定规程
高效液相色谱仪(HPLC)是分析实验室常用的测试仪器之一，其应用越来越广泛。
此种仪器在使用过程中，难免会出现各种各样的问题，并将直接影响到所测数据的准确性和仪器的正常工作。
操作者如果能了解故障的成因，即可清楚预防和排除这些故障的方法，就可正确地使用仪器并最大限度地发挥仪器的性能。
今天我们要从以下几个方面和您分享下在使用高效液相色谱仪中需注意的几个问题。
一、使用试管的问题1、试管的洁净问题。
高效液相色谱分析法是一个很灵敏的分析方法，如果因使用不洁净的试管，便会影响试验结果的准确性。
例如，在用甲醇作溶剂来溶解样品时，所用的小试管是用橡胶塞来做盖子的，因此，在每次进样时，都有一个保留时间固定的干扰峰存在，后经证实，此干扰峰是由甲醇浸泡橡胶塞而溶下的组分所产生，换用玻璃试管后，干扰峰消除。
2、塑料试管的溶解问题。
近年来，一次性塑料试管给试验人员带来了极大的方便，但是，在使用过程中一定要注意有机溶剂对试管的溶解现象，在利用此种试管提取样品时，有些有机溶剂(如氯仿等)对管壁有溶解现象，这些被溶解下来的物质有时也能在检测器上产生信号，从而干扰样品的测定。
这时，可用相同的实验条件先行试验一下，看看不含被抽提物时，提取液在检测器上能否产生干扰信号，如确有干扰信号存在，就只能换用耐有机溶剂的玻璃试管了。
3、被测样品在试管壁上的吸附问题。
这个问题也应引起注意，否则也会影响测试结果的准确性，在治疗药物监测(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)中，有些被测药物如阿米替林，丙咪嗪等易吸附在玻璃试管的管壁上，因此，操作中宜采用聚丙烯管，为防止提取中吸附现象的发生，可采用0. 5%的已二胺已烷液做为提取剂，可有效地防止吸附。
二、操作进样阀的问题目前，在分析型高效液相色谱仪中常用的进样阀是7725型进样阀，其内部的六通阀结构使进样操作非常方便，但是，如果使用不当，也会带来问题。
例如，在高效液相色谱法的试验过程中，有时会有异常色谱峰的出现以及重现性不好的问题，这主要是由于操作方法不当所引起，要想解决此类问题，需从以下几个方面入手。
高效液相色谱仪检定规程
高效液相色谱仪检定规程JJG 024--19961前言本规程参照国际法法制计量组织（OIML ）技术工作导则第二部分：OIML国际建议和国际文件起草与表述规则、JJG1002-84国家计量检定规程编写规则和GB3100-93国际单位制及其应用编写的。
2范围适用于新安装、使用中和修理后的具有紫外-可见光、荧光和示差折光率检测器的高效液相色谱仪（以下简称仪器）的检定。
2.1原理本仪器用于分离和测定有机混合物中的化学成分。
样品以溶液状态进入色谱柱后，在流动相的推动下，逐步被分离成单个的组分。
然后依次通过色谱检测器进行检测。
根据各组分的保留时间和响应峰值而进行组分的定性和定量分析。
2. 2构成输液做一进样罪充分离薇一-检器疏器打F卩绘图机——记求仪或色诸埼图1元素分析仪构成方框图3计量单位参见GB3100-93国际单位制及其应用中的有关条文。
4计量要求其计量特性和指标应符合表1中的规定。
5技术要求5. 1外观要求5. 1.1仪器应有下列标志：仪器名称、型号、制造厂名、出厂仪器系列编号、产品合格证书及操作使用说明书，仪器外表完好，面板字迹清晰。
5. 1 . 2仪器整机部件：调节旋纽、按键、开关及指示灯应能正常工作，电缆线插件应接触良好。
5. 2安装条件5. 2 . 1仪器应平稳地安装在牢固的操作台上，电缆接插件紧密配合，接地良好。
5. 2 . 2高压气瓶与仪器连接应使用专用管道和接头。
*带星号的项目为必须鉴定的项目5. 3检定环境5. 3. 1室内环境：应清洁无尘，无易燃、易爆和腐蚀性气体，室内排风良好，且不应放置与测定无关的其他杂物。
5. 3. 2室内温度：10 C ~30C（温度波动应不大于出C /操作期间；使用折射率检测器时应不大于2C）。
5. 3. 3室内相对湿度： < 85%5. 3. 4 电源：电压（220 ±2）V;频率：（50 ±）.5）Hz。
5. 4检定设备和试剂5. 4. 1分析天平：最大称量100g，最小分刻度O.lmg,或其它微量自动电子天平。
高效液相色谱仪的操作与维护指南
高效液相色谱仪的操作与维护指南高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）作为一种常用的分析仪器，广泛应用于化学、药学、环境科学等领域。
为了保证仪器的正常运行和获得可靠的分析结果，正确的操作和科学的维护是非常重要的。
本指南将详细介绍高效液相色谱仪的操作和维护方法，以帮助用户正确使用该仪器。
一、高效液相色谱仪的操作方法1. 准备工作在操作前，需要先进行一些准备工作。
首先，检查仪器是否处于稳定的工作环境中，以确保仪器不受外界干扰。
其次，检查所有的连接与密封件是否完好，确保流体不会泄漏。
最后，检查溶剂和样品的储存条件，保证其符合要求。
2. 开机与关闭正确的开机和关闭步骤可以延长仪器的寿命。
开机前，需要检查电源和其他外部连接。
按照仪器的说明书，按顺序打开电源和其他必要的开关。
关闭仪器时，应按照相反的顺序关闭开关，并断开电源。
3. 样品准备与进样在进行进样操作前，需要准备好样品和溶剂。
样品准备时，应遵循相应的样品制备方法，确保样品的准确性和稳定性。
进样时，应根据实验需求设置适当的进样方式，并注意定量准确。
4. 仪器参数设置在进行分析之前，需要设置仪器的参数，以调整流速、温度、检测波长等参数。
仪器的参数设置应根据实验目的和样品特性进行优化调整，确保获得准确的分析结果。
5. 分析运行与数据处理设置好仪器参数后，可以开始进行分析运行。
根据实验要求和样品特性，选择合适的分析方法和梯度程序。
在分析过程中，应定期检查仪器运行状态，注意观察流速、峰面积、保留时间等数据，并记录相关结果。
6. 仪器清洗与维护分析结束后，必须对仪器进行清洗和维护。
首先，关闭流体通道，清除流体残留物和样品残留物。
然后，根据仪器说明书的要求，进行仪器的常规清洗和维护工作。
定期检查和更换液相柱、检测器等易损件，以保证仪器的正常运行。
二、高效液相色谱仪的维护方法1. 液相柱维护液相柱作为HPLC分离的重要组件，需要定期维护和保养。
高效液相色谱仪的操作步骤 液相色谱解决方案
高效液相色谱仪的操作步骤液相色谱解决方案高效液相色谱仪操作步骤：1）．过滤流动相，依据需要选择不同的滤膜.2）．对抽滤后的流动相进行超声脱气10—20分钟。
3）．打开hplc工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
4）．进入hplc掌控界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
5）．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。
冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。
冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。
6）．调整流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000、点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，察看基线的情况。
7）．设计走样方法。
点击file，选取se—lect users and methods，可以选取现有的各种走样方法。
若需建立一个新的方法，点击new method。
选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，依据需要而不同。
选完后，点击protocol。
一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2—5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading—inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。
8）．进样和进样后操作。
选定走样方法，点击start。
进样，全部的样品均需过滤。
方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。
全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。
9）．关机时，先关计算机，再关液相色谱。
10）．填写登记本，由负责人签字。
注意事项：11）．流动相均需色谱纯度，水用20m的去离子水。
脱气后的流动相要当心振动尽量不引起气泡。
12）．柱子是特别脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。
13）．全部过柱子的液体均需严格的过滤。
14）．压力不能太大，可以不要超过2000 psi。
液相色谱流动相说明流动相相当于液相的血液，可以想象对液相的紧要程度。
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高效液相色谱仪（HPLC）校正方法
0.1输液系统：
0.1.1梯度误差G C不超过±3%
0.1.2泵流量设定值误差 S s＜±2%
0.1.3流量稳定性误差 S R＜±2%
0.2紫外检测器性能
0.2.1基线噪声不超过5×10-4AU，基线漂移不超过5×10-3AU
0.2.2定量测量重复性误差（6次进样）RSD≤1.5%
0.2.3最小检测浓度不超过1×10-7g/ml萘/甲醇溶液
0.2.4可调波长紫外可见光检测器波长示值不超过±2nm(HP1100高效液相色谱仪可由仪器自身完成) 1校正条件
1.1环境温度10-30℃，相对湿度低于65%
1.2校正设备
1.2.1秒表分度值小于0.1 s
1.2.2分析天平最大称量200g,最小分度值0.1mg
1.2.3容量瓶
1.2.4微量注射器
1.3标准物质和试剂
1.3.1HPLC用甲醇、纯水，分析纯的丙酮
1.3.21×10-4g/ml，1×10-7g/ml的萘甲醇溶液
1.3.3紫外波长标准溶液
2校正方法
2.1梯度误差G C的校正
2.1.1进行梯度洗脱程序，A溶剂为水，B溶剂为0.1%丙酮的水溶液，B经5个阶段从0变到100%，
20%—40%—60%—80%—100%，重复测量两次，取平均值，求各段梯度误差Gci，取最大作为仪器梯度误差，公式：Gci=（Li—Lm）/Lm×100%
Li：第i段信号值的平均值； Lm ：各段输出信号平均值的平均值
可接受标准： -3%≤Gci≤3%
2.2泵流量设定值误差Ss、流量稳定性误差S R的校正
2.2.1将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为流动相，按表一设定流量，待
流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确的收集10-25
分钟，称重，按下式计算流动相流量设定值误差Ss和流动相流量稳定性误差S R。
公式：Ss=（Fm-F S）/Fs 100%
可接受标准：-2%≤Ss≤2%
S R=（Fmax-Fmin）/F×100%
可接受标准：-2%≤S R≤2%
Ss：流量设定值误差（%）； Fm=（W2- W1）/ρt.t：流量实测值（ml/min）
W2 ：容量瓶+流动相的重量（g）； W1：容量瓶的重量（g）； Fs：流量设定值（ml/min）；
ρt：实验室温度下流动相的密度（g/cm3）； t：收集流动相的时间（min）；
S R：流量稳定性误差（%）； Fmax 为同一组测量中流量最大值（ml/min）；
Fmin：同一组测量中流量最小值（ml/min）； F 为同一组测量值的算术平均值（ml/min）
表一：Ss和S R的校正
2.3基线噪声和漂移
2.3.1选用C18的色谱柱，以波长254nm,流动相为100%甲醇，流速1.0ml/min，仪器稳定后记录基线
30min，求基线噪声N d。
可接受标准：N d≤5×10-4AU
2.3.2基线漂移用1h内基线偏离原点的值（AU/h）表示。
可接受标准：D≤5×10-3AU/h
2.4最小检测浓度
2.4.1以上述色谱条件下，进样20ul的1×10-7g/ml的萘甲醇溶液，计算最小检测浓度C L。
公式：
C L=
2 N d C×20
HV
N d：基线噪声，mm； C：标准溶液浓度，g/ml；
H：标准溶液色谱峰的峰高，mm； V——进样体积，ul。
2.4.2可接受标准：C L≤1×10-7g/ml
2.5定量测定重复性的校正
将仪器联接好，使之处于正常工作状态，波长254nm,流动相为100%甲醇，流速1.0ml/min,用萘的甲醇溶液连续进样6次记录下峰面积，按下式计算相对标准偏差：
n
RSD = [∑（Xi- X ）2]/（n-1）×(1/ X )×100%
I=1
RSD：相对标准偏差（%）； n：测量次数； Xi：第I次测量的峰面积
X – n次进样的峰面积算术平均值
可接受标准：RSD≤1.5%
2.6波长示值误差
2.6.1用注射器将紫外波长标准溶液（标准波长为235nm，257nm，313nm和350nm）从检测器入
口注入样品池冲洗，并将池充满，将波长调到低于标准波长5nm处，到标准波长+4nm处，测得的最大吸收值处对应的波长与标准波长之差为波长示值误差；目前仪器可以在1ml/min的流量下，直接用空管连接检测器，每隔2min改变1nm，连续进标准样10ul，同样可得波长示值误差。
2.6.2可调波长紫外可见光检测器波长示值误差 (此项只适用于HP1100高效液相色谱仪且带有HP工
作站)。
2.6.3打开HP1100液相色谱仪和HP工作站，打开输液泵和检测器，用纯水冲洗系统直至稳定，进入
Diagnosis窗口，点击氘灯图标，进入 show module tests状态，点击VWD VL calibration test 点击start ，系统自动进入校正状态，待校正完毕，将校正结果打印归档。
2.6.4可接受标准：λ≤2nm
3性能确认
3.1使用标准品或供试品，确认仪器性能符合使用要求；
3.2先进行色谱柱的性能确认，内容包括：分离度，对称因子，理论塔板数和峰面积标准偏差。
3.3液相色谱柱的确认
3.3.1测试标准样配制：称量1000mg苯酚，100mg联苯加入到100ml容量瓶中，移入邻苯二甲酸二甲
酯、邻苯二甲酸二乙酯各1ml，然后用甲醇定容到100ml，混匀，从中移取1ml该溶液，用乙腈：水=70：30定容至100ml。
3.3.2方法：流动相为乙腈：水=70：30，流速为1.0ml/min,波长为254nm,温度为30℃，进样量为：
10ul,运行10min。
3.3.3色谱柱：Extend-C18 Analytical, 5um,
4.6*250mm。
3.3.4连续进行5次分析，分离度均R＞1.5；邻苯二甲酸二乙酯对称因子S在0.80～1.50范围
内；邻苯二甲酸二乙酯柱效＞3000m-1；邻苯二甲酸二乙酯峰面积的标准偏差应≤1.5%。
3.4按照性能确认方法逐步进行，并记录谱图；根据性能测试的结果，评价仪器是否符合性能要求。
4校正结果处理和校正周期
4.1校正结果全部项目均符合技术要求者，判为合格，方可使用。
若某些指标达不到要求，关于仪器
情况，仪器负责人以维修报告的形式报于QC经理，由QC经理批准维修方案。
液相色谱仪的校正周期为一年。