玻片凝集试验slideagglutinationtest
实验五 凝集反应—医学免疫学实验指导
医学免疫学实验指导实验五凝集反应由长沙达尔锋生物科技有限公司整理【文章介绍】实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。
BioRike博瑞克根据《医学免疫学实验指导》一书系统整理了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。
BioRike简介：BioRike（中文简称“博瑞克”）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌,由旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。
BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专门从事以Elisa试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒、血清等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。
【实验目的】1.了解凝集反应的原理、基本类型及其用途。
2.熟悉玻片凝集试验、试管凝集试验、间接凝集试验的实验方法和结果分析。
【实验用品】1. 材料试剂：伤寒杆菌、大肠杆菌18～24小时琼脂斜面培养物、伤寒杆菌H血清、伤寒杆菌H菌液、待测孕妇尿液、HCG阳性孕妇尿液、1:10稀释伤寒杆菌诊断血清、ABO血型标准血清、类风湿免疫诊断试验（用变性IgG致敏的乳胶颗粒）、HCG致敏乳胶试剂、兔抗HCG诊断血清、待测血清、生理盐水。
2.器材：洁净载玻片、巴氏吸管、乳胶皮头、接种环、酒精灯、特种铅笔（或记号笔）、小试管、牙签、采血针、75%酒精棉球、无菌干棉球、试管架；1ml、5ml刻度吸管、37℃恒温箱（或37℃/56℃水浴箱）、显微镜。
【内容和方法】一、玻片凝集试验(slide agglutination)1.原理玻片凝集试验(slide agglutination)是将已知的抗体直接与未知的颗粒性抗原物质(如细菌、立克次体、钩端螺旋体等)混合，在有适当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。
此法属定性试验，主要用于检测抗原，如ABO血型鉴定、细菌鉴定和分型等。
玻片凝集试验的原理
玻片凝集试验的原理玻片凝集试验（glass slide agglutination test）是一种用于检测抗原-抗体反应的常见实验方法之一、该实验基于抗体与抗原结合后的凝集现象，通过观察凝集程度，可以判断抗原-抗体的反应强度。
以下是玻片凝集试验的原理和操作步骤。
原理：操作步骤：1.准备工作台和所需试剂：-清洁工作台表面，并用75%的酒精进行消毒。
-准备玻片，将其放在工作台上。
-准备所需试剂，包括抗原和抗体。
2.准备抗原和抗体悬液：-取少量抗原，将其悬浮于生理盐水中，制备一定浓度的抗原悬液。
-取少量抗体，将其悬浮于生理盐水中，制备一定浓度的抗体悬液。
3.将抗原悬液滴在玻片上：-取一滴抗原悬液，滴于玻片上。
-取另一滴抗原悬液，滴于玻片上。
4.将抗体悬液滴在玻片上：-取一滴抗体悬液，滴于第一个抗原滴上。
-取另一滴抗体悬液，滴于第二个抗原滴上。
5.用手柄将滴液混合：-使用手柄，将抗原和抗体滴液混合均匀。
6.观察凝集反应：-仔细观察玻片上的滴液，在镜下或肉眼下观察滴液是否产生凝集反应。
凝集反应的判断：凝集程度从强到弱分为四个级别：-4+级：滴液完全凝集。
-3+级：滴液凝集但小颗粒仍可见。
-2+级：滴液中有颗粒形成局部凝集。
-1+级：滴液中颗粒分散但有局部凝集。
-凝结反应：滴液颗粒完全分散，未发生凝集。
注意事项和解释：-实验前要确保玻片表面干燥干净，无杂质，以免影响试验结果。
-抗原浓度、抗体浓度和试验条件等多个因素都会影响凝集反应的强度。
-通常情况下，抗原与抗体的相对浓度应该事先确定，以选择最佳条件进行试验。
-可以通过多次进行试验、更改抗原浓度或抗体浓度来优化试验条件。
-玻片凝集试验也可以通过计算凝集反应的面积或测定反应的光密度来定量化。
总结：。
直接凝集实验(Direct agglutination reaction)：玻片凝集反应
直接凝集实验（Direct agglutination reaction）：玻片凝集反应一、概述颗粒性抗原（细菌、螺旋体、红细胞等）与相应的抗体血清混合后，在电解质参与下，经过一定时间，抗原抗体凝聚成肉眼可见的凝集块，这种现象称为凝集反应。
血清中的抗体称为凝集素（Agglutinin），抗原称为凝集原（Agglutinogen）。
细菌或其他凝集原都带有相同的电荷（阴电荷），在悬液中相互排斥而呈均匀的分散状态。
抗原与抗体相遇后，由于抗原和抗体分子表面存在着相互对应的化学基团，因而发生特异性结合，成为抗原抗体复合物。
由于抗原与抗体结合，降低了抗原分子间的静电排斥力，抗原表面的亲水基团减少，由亲水状态变为疏水状态，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒。
出现了肉眼可见的凝集反应。
一般细菌凝集均为菌体凝集（O凝集），抗原凝集呈颗粒状。
有鞭毛的细菌如果在制备抗原时鞭毛未被破坏（鞭毛抗原在56℃时即被破坏），则反应出现鞭毛凝集（H凝集），鞭毛凝集时呈絮状凝块。
二、玻片凝集反应玻片凝集反应一般用于未知细菌的定性，所以又称为定性凝集反应。
实践中常用于新分离的大肠杆菌和沙门氏菌的鉴定和分型。
反过来，也可用已知的细菌抗原去鉴定未知抗体，如鸡白痢沙门氏菌病的清群就是采用已知鸡白痢菌抗原去检测鸡白痢抗体。
（一）材料与试剂载玻片、已知抗血清、待测细菌等。
（二）操作方法取洁净载玻片一张，用铂金耳钓取已知诊断血清1滴置于载玻片一端，另端置生理盐水1滴做对照。
然后用铂金耳钓取被检细菌少许，置生理盐水滴中研磨混匀，再将铂金耳灭菌后冷却，钓取被检菌少许置于血清滴中研磨混匀。
（三）结果判定在1min～3min内，血清滴出现明显可见的凝集块，液体变为透明，盐水对照滴仍均匀混浊，即为凝集反应阳性，说明被检菌与已知诊断血清是相对应的。
实验一--凝集试验
由兽医生物药品厂生产供应。该抗原为布 氏杆菌死菌混悬液，每1ml约含菌100亿。 是将牛型、羊型、猪型三型布氏杆菌的培 养物杀死，悬浮于0.5%的石炭酸生理盐水 中制成。静置时上层清亮无色或略呈灰白 色，瓶底有菌体沉淀。用时需充分摇匀， 并用0.5%的石炭酸生理盐水按规定倍数稀 释（1：20）。
凝集试验的类型： 直接凝集试验 间接凝集试验 协同凝集试验 桥梁凝集反应 病毒的血凝和血凝抑制试验
一、直接凝集试验 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体 结合并出现凝集现象称直接凝集试验 (direct agglutination test)。
按操作方法分玻片法和试管法两种。
（一）试管凝集试验
实验材料:
② 按上表在各管中先加0.5％石炭酸生理盐水。 ③ 以1ml吸管吸取待检血清0.2ml，加入第1管
中，充分混匀，吸出1.5ml弃之，再吸出0.5ml 加入第2管，混匀后吸出0.5ml加入第3管，依 此类推至第4管，混匀后弃去0.5ml。 ④ 第6管中加1:25稀释的布氏杆菌阳性血清0.5ml ⑤ 第7管中加1:25稀释的布氏杆菌阴性血清0.5ml ⑥ 每管各加以0.5％石炭酸生理盐水稀释20倍的 布氏杆菌试管凝集抗原0.5ml。
作用： 在各试管加完抗原后，将7支试管同时充 分混匀，置37℃培养箱中4～l0h，取出后 置室温18～24h，然后观察并记录结果。
结果记录：
﹟： 液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于 管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒 状（即100％的菌体被凝集）
+++ 液体略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管 底，振荡时情况如上（75％菌体被凝集）。
2、布氏杆菌病待检血清 从被检动物采取。被检血清必须新鲜、无 明显蛋白凝块、无溶血现象和腐败气味， 采血后不得迟于2～3d检验。否则需加防 腐剂或冰冻保存。
凝集反应
凝集程度：
凝集物 全部凝集 上清液 澄清 凝集程度 ++++
大部份凝集
有明显凝集 很少凝集 不凝集
基本透明
半透明 基本混浊 混浊
+++
++ + -
效价（滴度）判定： 首先观察对照管为阴性，说明结果可信，
再观察各实验管以判断效价。
效价判断:以产生明显凝集现象（2+）的
最高血清稀释度为该血清的抗体效价。
1：160
2.5ml N.S
1：320
1：640
稀释血清 1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
1/640
N.S
每管加0.5ml
O抗原 H抗原 每管加0.5ml 甲-H抗原 乙-H抗原 丙-H抗原 稀释倍数 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280
37℃过夜，观察
概念：
颗粒性抗原 + 相应抗体
↓(适量电解质)
凝集现象 可溶性抗原（或抗体) + 载体颗粒 ↓ 致敏颗粒+相应抗体（或抗原）
↓(适量电解质)
凝集现象
特点：
1.抗原为颗粒性抗原或可溶性抗原致敏颗粒； 2.反应时间较短，需几到十几分钟； 3.反应产物为凝集块； 4.凝集反应抗原分子大，反应面积小，为使抗 体分子不致过多，试验时需稀释抗体 。
肥达氏反应
用已知的伤寒沙门菌O、H抗原，甲、乙、 丙型副伤寒沙门菌的H抗原与患者血清做 半定量试管凝集试验； 以出现“++”凝集的最高血清稀释度作为抗 体的效价，测定相应抗体的含量，用以辅
助诊断肠热症。
玻片凝集试验和试管凝集试验的临床应用。
玻片凝集试验和试管凝集试验的临床应用。
玻片凝集试验和试管凝集试验是常见的免疫学检验方法，广泛用于临床实验室中。
它们可以用于检测体内的免疫反应，诊断免疫性疾病和监测疾病的治疗效果。
本文将详细介绍这两种方法的基本原理、操作步骤以及临床应用。
一、玻片凝集试验（Slide Agglutination Test）玻片凝集试验是一种简单、快速的免疫学检验方法，被广泛应用于临床诊断和流行病学调查中。
它适用于检测细菌和病毒等微生物的抗原和抗体，以及测定人血清中的抗体滴度。
1.原理：玻片凝集试验基于免疫沉淀反应的原理。
当抗原与抗体结合形成可见的凝集物时，说明体内存在相应的免疫反应。
这种凝集物可以在显微镜下通过直接观察进行评价。
2.操作步骤：（1）制备试验装置：准备好玻片、悬滴管和相应的免疫试剂。
（2）加荧光染料：将被测物加入荧光染料，使其标记上荧光物质，以便观察凝集情况。
（3）滴加试剂：在玻片上滴加一定量的荧光染料标记的抗原或抗体，然后滴加等量的被测物，静置几分钟等待反应发生。
（4）观察凝集情况：在显微镜下观察玻片上的凝集情况，通过对凝集形态、密度和大小的评估，来判断是否存在免疫反应。
3.临床应用：玻片凝集试验在临床上有广泛的应用。
以下是几个具体的应用举例：（1）致病菌的鉴定：可以检测常见的致病菌，如流感病毒、结核杆菌等，通过检测其相应的抗原或抗体来诊断疾病。
（2）传染病的流行病学调查：通过对群体施加的玻片凝集试验，可以评估人群中感染某种疾病的程度和传播情况，从而制定相应的防控措施。
（3）自身免疫性疾病的诊断：可以检测人体内的自身抗体，如类风湿因子、抗核抗体等，用于诊断自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等。
二、试管凝集试验（Tube Agglutination Test）试管凝集试验是一种比玻片凝集试验更灵敏的免疫学检验方法，常用于检测细菌和病毒的抗原和抗体。
相比玻片凝集试验，试管凝集试验通常需要较长的反应时间和更多的试剂，因此操作较为复杂。
凝集反应
质偶联在红细胞上，常用的偶联剂有戊二醛、CrCL3
和双偶氮联苯胺。
临床免疫学及免疫检验
2.胶乳颗粒载体及致敏
聚苯乙烯胶乳颗粒是人工合成的载体，它是一种大小均
一，直径为0.8μm大小的圆形颗粒，带有负电荷，可用物 制备成带有化学活性基团的颗粒(如带有羧化聚苯乙烯胶 乳)，抗原或抗体能以共价键交联在胶乳表面(通过缩合剂 碳化二亚胺将胶乳颗粒表面的羧基与被交联物上的氨基
的反应。1945年Coombs等根据抗体球蛋白对异种动物亦 是抗原的原理，把产生“不完全抗体”的机体正常血清球 蛋白，注射到异种动物使之产生抗球蛋白，这种抗球蛋 白加入表面结合有不完全抗体的红细胞的复合物中，就
能出现可见的凝集现象，称抗球蛋白试验。因为此反应是
Coombs首先建立的，故又称Coombs试验。
(1) 取细菌或红细胞悬液1滴，在玻片上 和1滴诊断血清混匀。 (2) 置室温，数分钟后即可用肉眼或低 倍显微镜观察凝集结果，出现颗粒凝 集者为阳性。
临床免疫学及免疫检验
3．方法评价 本试验是一种特异性强、简
便、快速的定性试验方法。 4．临床意义 适用于大量普查，未知菌种 的鉴定或分型，或用标准血清作红细胞 ABO血型的鉴定。有时也可用于定量检测 前的筛选试验(如布氏菌、土拉弗氏菌等 抗原)，初步观察病人血清中有无相应的 抗体，然后再对阳性标本作试管凝集试验 测定其效价。
间接凝集试验又称被动凝集试验(passive agglutination test)。所用的与免疫无关颗 粒称为载体，将抗原(或抗体)吸附或偶联 于颗粒表面的过程称致敏。而吸附有已 知抗原或抗体的颗粒称致敏颗粒。
临床免疫学及免疫检验
一、间接凝集技术类型
根据致敏载体用的是抗原或抗体以及 凝集反应的方式，间接凝集反应可分为：
第十章 凝集试验
载体 可溶性抗原 致敏
用特异性抗 原致敏载体， 检测标本中 的相应抗体 的方法。
待测抗体
致 敏 颗 粒
NS
凝 集 颗 粒
已知抗体
载体
＋
致敏
致 敏 颗
粒
用特异性抗 体致敏载体， 检测标本中 的相应抗原 的方法。
• 将标本进行一系 列对比稀释后反 应，以出现阳性 反应的最高稀释 度为效价（滴度）
第一节 直接凝集技术
（direct agglutination test)
•直接凝集试验：细胞性抗原在有电解质的
参与下，直接与相应抗体结 合出现的凝集现象。
•凝集原(agglutinogen)：凝集反应中的抗原。
•凝集素(agglutinin)：凝集参与反应的抗体
三、间接血凝试验(被动血凝试验)
（indirect hemagglutination test)
• 原理 将可溶性抗原(或抗体）
•操作步骤
吸附人的“O”型血红细胞 或绵羊或家兔的红细胞，
•方法评价： 敏感性较强、
制成致敏血红细胞,与相应
简便、快速、
抗体（或抗原）作用，在
成本低廉
适宜电解质参与下，出现 红细胞凝集现象。
直接与待测标本中相
RBC稳定、均一性好
应抗体（或抗原）发 2.与抗原结合的能力
生凝集反应。
及凝集性能不如RBC
年 五、间接凝集试验的应用
1. 抗体的检测
①检测细菌、病毒寄生虫感染后产生的抗体 ②自身免疫病患者的抗体的检测 ③变态反应患者的抗体的检测
2. 抗原的检测
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
在诊断血清中，混悬液由混浊变澄清并出凝集物，则 为阳性结果；混悬液仍为匀混浊的乳状液，则为阴性 结果。
肉眼观察不够清晰者，可在低倍镜下观察。
实验讨论
肥大试验是一种经典的半定量试管凝集试验。在临床上主要用 已知的伤寒沙门菌O或H抗原检测血清中有无相应的特异性抗体 及其效价，以协助诊断伤寒病或供流行病学调查。
以胶乳凝集试验检测类风湿因子（rheumatoid factor,RF）为例验证间接凝集实验的原理和特点
实验原理
类风湿因子（RF）是一种抗变性IgG的自身抗体， 具有与人或动物变性IgG结合的特点。将处理过的人IgG 与聚苯乙烯胶乳颗粒结合成致敏颗粒，当待测血清中含 有RF时，则与致敏颗粒上变性的IgG发生反应，出现凝 集现象。
第三单元
免疫凝集类实验
验证实验一 直接凝集实验
颗粒性抗原与相应抗体直接反应，在适当电解 质参与下出现的肉眼可见的凝集现象。
常用的试验方法有玻片凝集法和试管凝集法。
本 实 验 以 试 管 法 凝 集 试 验 —— 肥 大 试 验 （Widal test）验证凝集反应及其特点。
Widal test原理
胶乳颗粒 人IgG
致敏
待测RF
致 敏 胶 乳
NS
凝 集 颗 粒
实验器材
器械 黑色方格反应板、毛细滴管、试管、试管架、吸
耳球、恒温水浴箱等
试剂 人IgG致敏胶乳试剂（市售类风湿因子检测试剂）
类风湿因子阳性血清和阴性血清：临床标本筛选获得 待测血清
实验方法
待测血清、阳性血清、阴性血清分别用生理盐水作1∶20 稀释。
“+++”：上清液稍混浊，细菌大部分凝集并沉于管底 “++”：上清液较混浊，约50%的细菌凝集并沉于管底 “+”：上清液混浊，仅少量细菌凝集 “-”：不凝集，液体浊度与对照管相同
血清抗体效价：试验管出现“++”以上的凝集现象即可判断为阳
性；以出现“++”凝集的最高血清稀释度为该待测血清的抗体效价。
1 生理盐水
+ 伤寒杆菌
1:40 伤寒杆菌诊断学清 +
伤寒杆菌
2 生理盐水
+ 大肠杆菌
1:40 伤寒杆菌诊断学清 +
大肠杆菌
玻片凝集试验鉴定伤寒沙门 菌
玻片凝集试验 (slide agglutination test)
在玻片上
颗粒性抗原与相应 抗体直接结合
出现肉眼可见 的凝集现象
+
？
+
结果分析
凝集反应只有在抗原抗体比例适当时，才能出现肉眼可见的凝 集现象。
临床上开展的外斐反应是利用与立克次体有共同耐热性多糖抗 原的变形杆菌OX19、OX2、OXk菌株代替立克次体作为已知抗原， 与患者血清进行凝集试验，以辅助诊断斑疹伤寒、恙虫病等立 克次体疾病。
现有OX19、OX2、OXk三种诊断菌液和待测血清，请写出利用 试管凝集法进行的外斐试验的操作步骤。
1:2560
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 弃掉0.5
菌液
1 2 3 45 6 7
试
管
凝 集
试
验
原
结
理
果
结果判断
实验结果
将试管置于有良好光源和黑色背景下，观察管底凝集物的范围和上清 液的浊度，记录凝集程度，判断凝集效价用++++、+++、++、+、 -等符号记录凝集效价。
对照管：应无凝集现象 试验管：“++++”：上清液澄清，细菌全部凝集，凝集块全部沉于管底试管凝集法操作程序试 Nhomakorabea号1
生理盐水（ml) 0.5 待测血清（ml) 0.5 伤寒O菌液(ml) 0.5 血清稀释度 1:80
2
0.5 0.5
0.5 1:160
3
0.5 0.5
0.5 1:320
4
5
6
7
0.5 0.5
0.5 1:640
0.5 0.5
0.5 1:1280
0.5
0.5
0.5
0.5 0.5
注意事项
凝集反应只有在抗原抗体比例适当时，才能出现肉眼可见的反应 一般情况下，随着血清浓度的逐渐稀释，凝集反应越来越弱，但在抗 体浓度过高时，反而无凝集现象出现，此为前带现象，出现该情况时， 须加大抗体稀释倍数重新试验。
直接凝集试验也可以用玻片法 以鉴定伤寒沙门菌为例：取洁净载玻片2张，在玻片的左上角分别标明 “1”、“2”； 加入已知抗体（伤寒沙门菌诊断血清）和待测菌液 （伤寒沙门菌或其他细菌）。
思考题
为什么临床上不直接利用立克次体作为已知抗 原进行血清学诊断呢？
验证实验二 间接凝集实验
间接凝集实验（indirect Agglutination Test)
将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关、大小 均匀的惰性载体颗粒表面，使其成为致敏载体，然后再与 相应抗体（或抗原）结合，在适当电解质存在的条件下， 载体颗粒被动地发生凝集，出现肉眼可见的凝集现象。
1. 取试管7支，依次编号并做好标记。 2. 每支试管中加生理盐水0.5ml。 3. 倍比稀释血清：
取1∶20稀释的待测血清0.5ml加入到第1管，混匀后 吸取0.5ml加入到第2管，如此连续稀释至第6管，混匀后 吸取0.5ml弃去；第7管不加血清作为阴性对照。 4. 加诊断菌液：
每管加伤寒沙门菌H或O诊断菌液0.5ml，此时各管 血清最终稀释度依次为1∶80、1∶160、1∶320、 1∶640、1∶1280、1∶2560 5. 摇匀后置37℃水浴2～4h，取出观察结果或放室温过夜， 次日观察结果。
在黑色方格反应板上取3个格，用毛细滴管分别滴加稀释 待测血清、阳性血清、阴性血清各1滴，然后每格加入人 IgG致敏胶乳试剂1滴。
连续轻轻摇动反应板，2～3分钟后观察结果。
结果判断
若胶乳颗粒凝集且液体澄清者为阳性反应 胶乳颗粒不凝集仍保持均匀胶乳状者为阴
性反应
注意事项
试剂应4℃保存，严禁冻结，用时摇匀； 所有试验器皿和反应板均应洗净、干燥； 若阴性对照出现凝集，则表示致敏乳胶试剂有
将已知的颗粒性抗原（伤寒沙门菌）定量 加入到系列倍比稀释的待测血清中，根据各血清 稀释度凝集情况，测定血清中有无相应抗体及其 相对含量。
实验器材和材料
器械
试管、吸管、恒温水浴箱等
试剂
抗体 待测伤寒沙门菌免疫血清、抗原 伤寒沙门菌诊 断菌液（7×108/ml)、生理盐水
实验方法（Widal test）