生物学实验(1)
植物生物学：实验1(细胞的基本结构)
• 3. 盖盖玻片时一定要慢、稳、准，以防气泡产生。
• 4. 装片时加入稀释的 I-KI 溶液，可使细胞核更为 清晰。
洋葱表皮细胞图
洋葱表皮细胞图
2.制作番茄果肉细胞临时装片，观察番茄果 肉细胞：
实验材料：洋葱、番茄 实验内容及方法：
• 1.制作洋葱表皮临时装片，观察洋葱表皮细胞的 结构：取洋葱肉质鳞叶一片，在其下表面用解剖 刀轻划两刀或将鳞片叶掰成两半，用镊子从切口 或断裂处轻轻夹住表皮，切勿用力，沿一个方向 撕下表皮，制成临时装片，置显微镜下观察。
注意事项 :
• 1. 材料不可过大，勿超出盖玻片范围。
4.绘出的图要与实物相符，观察时要把混杂 物、破损、重叠等现象区别清楚，不要把这 些现象绘上。
5.图的阴暗及浓淡，可用细点表示，不要采 用涂抹方法。点细点时，要点成圆点，不要 点成小撇。
6.整个图要美观、整洁、特别注意其准确性 与科学性。
植物细胞的显微图的绘制过程
（三）植物细胞基本结构的观察
柿胚乳切片
胞间连丝
观察与思考
•什么是胞间连丝？
•胞间连丝有何功能？
•柿胚乳细胞的细胞壁 是初生壁还是次生 壁？
2. 红（青）辣椒果 实表皮的初生纹孔 场
• 取一块新鲜红（青） 辣椒果皮，将内果皮 朝上平放在载波片 上，用刀片刮去果 肉，将留下的表皮加 I-KI
• 高倍物镜的使用：在低倍镜下将要放大观察的部分移至 视野中央，通过物镜转换器把高倍镜转至中央对正，用 细调焦螺旋调至物象最清晰。
• 无需使用油镜，即100倍物镜。
还镜步骤：
• 关闭光源，将光源旋钮调至最低，防止重新开机 时电压高而烧灯泡
微生物学实验一 微生物制片及形态观察
实验一微生物制片及形态观察一、显微镜油镜的使用显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。
显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。
1. 结构光学显微镜是由光学放大系统和机械装置两部分组成。
光学系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等；机械系统一般包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座等（图1－1）。
图1－1 光学显微镜结构图标本的放大主要由物镜完成，物镜放大倍数越大，它的焦距越短。
焦距越小，物镜的透镜和玻片间距离（工作距离）也小。
油镜的工作距离很短，使用时需格外注意。
目镜只起放大作用，不能提高分辨率，标准目镜的放大倍数是十倍。
聚光镜能使光线照射标本后进入物镜，形成一个大角度的锥形光柱，因而对提高物镜分辨率是很重要的。
聚光镜可以上下移动，以调节光的明暗，可变光栏可以调节入射光束的大小。
显微镜用光源，自然光和灯光都可以，以灯光较好，因光色和强度都容易控制。
一般的显微镜可用普通的灯光，质量高的显微镜要用显微镜灯，才能充分发挥其性能。
有些需要很强照明，如暗视野照明、摄影等，常常使用卤素灯作为光源。
2. 原理显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。
所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。
要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。
显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。
3. 使用方法1）低倍镜观察先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。
生物化学实验指导实验一蛋白质的性质实验（一）（呈色反应）一、目的1
生物化学实验指导实验一蛋白质的性质实验（一）（呈色反应）一、目的1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式。
2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法二、虽色反应：(一)双缩脱反应：1.原理：尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。
双缩脲在碱性环境中能与cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。
可用于蛋白质的定性或定量测定。
一切蛋白质或二肽以上的多肽部有双纳脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
2.试剂：(1)尿索： 10克(2)10%氢氧化钠溶液 250毫升(3)1%硫酸铜溶液 60毫升(4)2％卵清蛋白溶液 80毫升3.操作方法：取少量尿素结晶，放在干燥试管中。
用微火加热使尿素熔化。
熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。
冷后，加10％氢氧化钠溶液约1毫升，振荡混匀，再加1％硫酸铜溶液1滴，再振荡。
观察出现的粉红颜色。
避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
向另一试管加卵清蛋白溶液约l毫升和10％氢氧化钠溶液约2毫升，摇匀，再加1％硫酸铜溶液2滴，随加随摇，观察紫玫色的出现。
(二)茚三酮反应1.原理：除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
该反应十分灵敏，1：1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生成有色物质。
反应机理如下：此反应的适宜pH为5—7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
2.试剂：(1)蛋白质溶液 100毫升2％卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清：水＝1：9)(2)0.5％甘氨酸溶液 80毫升(3)0.1％茚三酮水溶液 50毫升(4)0.1％茚三酮—乙醇溶液 20毫升3.操作方法：(1)取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1毫升，再各加0.5毫升0.1％茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1—2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。
细胞生物学实验(本科生)实验内容
细胞生物学实验（本科生）实验内容实验一细胞的结构目的：1、熟悉实验室规范2、掌握光镜下细胞器的形态、分布特点；3、掌握临时制片法；4、学会生物绘图内容：（一）录像：临时标本片的制作（二）光镜下细胞器形态学观察：1、高尔基体（兔神经节切片）2、细胞核及核仁（蝾螈表皮装片）3、线粒体（肾小管切片）4、细胞骨架（培养肝癌细胞飞片）5、中心体*（马蛔虫受精卵切片）（二）操作：制作人口腔上皮细胞临时制片（显示活体线粒体）（三）实验报告：绘制人口腔粘膜上皮细胞实验二细胞化学细胞工程目的：1、掌握甲基绿-派洛咛染色法原理及操作技巧2、了解几种化学成分的显示方法及原理；3、观察各种化学成分在细胞中的分布；4、了解PCC原理；5、了解细胞融合及其应用；内容：（一）录象：克隆羊（二）观察：1、糖原（动物肝切片，PAS反应）2、酸性蛋白（蟾蜍血涂片，酸性固绿染色）3、酸性磷酸酶*（鼠腹腔液涂片，金属沉淀法显色）4、DNA* （小鼠睾丸切片，Feulgen反应）5、DNA、RNA*（人口腔粘膜上皮细胞涂片，吖啶橙染色，荧光显微镜观察）6、细胞融合（鸡血细胞、培养细胞）7、PCC*（Hela细胞）（三）操作：制作蟾蜍血涂片，显示DNA、RNA（四）实验报告：甲基绿-派洛咛染色原理、步骤及结果实验三显微测量细胞的生理活动目的：1、掌握显微测量技术；2、观察细胞的生理活动；3、掌握死活细胞的鉴别方法及原理；内容：(一)录象：细胞的活动显微测量（二）观察：1、胞质环流（黑藻叶片）2、吞噬作用*（小鼠白细胞）3、吞噬作用（蟾蜍白细胞）（三）操作：1、显微测量（蟾蜍红细胞）2、死活细胞鉴别（酵母细胞）（四）实验报告：1、测量5-10个细胞的大小，计算平均值；2、计算细胞存活率。
实验四细胞增殖染色体（质）目的：1、熟悉细胞增殖的主要方式；2、掌握细胞增殖周期各期的形态学特点；3、熟悉人染色体的基本形态特征；4、掌握X染色质标本的制备方法及原理；内容：（一）观察：1、动物细胞有丝分裂（马蛔虫受精卵切片）2、植物细胞有丝分裂（洋葱根尖纵切片）3、收缩环*（肝癌细胞飞片）4、无丝分裂*（草履虫装片）5、人染色体的基本形态（人血涂片）（二）操作：1、制作有丝分裂压片（洋葱根尖）2、制作X染色质标本片（人口腔粘膜上皮细胞）（三）实验报告：绘有丝分裂图、X染色质图。
分子生物学实验方法(1)
分子生物学实验新疆农业大学农学院生物技术系实验1 植物总DNA的提取和紫外分析一、实验目的了解植物DNA提取的主要方法及其原理，掌握SDS法或CTAB法抽提植物总DNA的基本程序和操作要求。
二、实验原理核酸分子是基因工程研究的主要对象，核酸样品的质量直接关系到基因研究一系列试验的成败。
核酸包括DNA和RNA两种分子，在细胞中它们都是以与蛋白质结合的状态存在。
真核生物的染色体DNA为双链线性分子，原核生物的“染色体”、质粒及真核细胞器DNA 为双链环状分子。
一般地说，总DNA主要是指基因组DNA（genomic DNA），即细胞核内的染色体DNA分子。
植物总DNA的抽提常采用两种方法：SDS法和CTAB法。
CTAB法：简便、快速，DNA产量高，但纯度稍次，适用于一般分子生物学操作。
CTAB 是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。
CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1～0.5mM NaCl）下，CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70％～75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。
再经过氯仿/异戊醇（24:1）抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
SDS法：离子去污剂，过程长，纯度高。
三、主要仪器、试剂、耗材1、植物材料叶片（根、茎、花、果等）2、主要仪器及试剂微量高速离心机、紫外分光光度计、水浴锅、离心管、移液枪、枪头等。
CTAB提取缓冲液（2%CTAB，1.4M NaCl，20mMEDTA，100mMTris-HCl，pH8.0）、氯仿/异戊醇（24:1,v/v）、无水乙醇、75%乙醇、TE缓冲液。
四、实验方法与步骤（一）CTAB法提取植物叶片DNA1、植物组织的破碎：取0.1g新鲜的植物叶片，在液氮中研磨至粉末状，转入1.5ml离心管中。
分子生物学实验-实验1 DNA重组和细胞转化2015
1. 平端连接
增加DNA浓度或提高连接酶浓度以提高连接效率
2. 粘端连接
效率较高，加入连接酶后可立即转化，即有转化子 出现
3. 粘-平连接
31
连接酶的选择：
T4 DNA连接酶：适用粘端、平端连接 可用于DNA-RNA，RNA-RNA杂交体
大肠杆菌DNA连接酶：适用粘端连接（也可用于平端， 效率低）
4
2. 实验试剂： 常规试剂通常3人一组放在桌上，部分试剂一大桌放一管
需要低温放置的试剂在讲台，需到讲台来加样，特别是酶， 加完及时放回原位
有些常规用试剂（如水，加样buffer），可室温保存，多 次使用
5
3. 离心机的正确使用：（注意安全和仪器保护）
➢ 平衡—— 15ml连同托架一起平衡，
➢
1.5ml目测体积，对应位置放置
走廊左侧有饮水机
3
实验注意事项
1. 实验用品分组（3人一组）标记，放于实验桌上。实验开 始时清点；实验结束，请各组同学将用品归于原位，整理好 本组桌面后再离开。需要回收的器皿初步冲洗后浸泡在水槽 内的盆中（如玻璃耗材等，有疑问请咨询带教老师）
实验开始前请勿乱翻动！
每组2个盆，1个桶，分别放冰，液体垃圾， 固体垃圾，结束时每组自行清理
如：Amp抗性平板
33
四、实验步骤
（详见实验讲义）
1. 目的基因c-myc与pSV质粒载体的连接(粘端)
注意：
1. 加样前短暂离心 2. 加样顺序 3. 保证每个样品加
入其中 4. 加样完成后混匀
后离心
目的基因片段（4.8kb），20ng/μl 4.5 μl
载体DNA（3.5kb）， 12ng/μl
细胞生物学实验 (1)
结构特点：
a.光源：最好采用单色光，因为光的速度，折射率，和干涉现象 由于波长的不同而有差异。一般镜检可使用普通光。
b.目镜：要带有十字线的目镜。
c.聚光镜：为了取得平行偏光，应使用能推出上透镜的摇出式聚 光镜。
d.伯特兰透镜：聚光镜光路中的辅助部件，这是把物体所有造成 的初级相放大为次级相的辅助透镜。它可保证用目镜来观察在 物镜后焦平面中形成的干涉图样。
3 、材料：
兔肝， 蟾蜍， 洋葱鳞莖、黄豆幼苗根尖
实验步骤：
样品的制备→染色→观察
作业：
绘出你所观察到的动植物液泡及线 粒体
设计性实验：细膜的通透性
原理
细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构。 可选择性地让某些物质进出细胞，各种物质出 入细胞的方式是不同的，如水分子可以按照物 质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗 透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动 物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细 胞会吸水膨胀直至破裂。
结构特点：
相差物镜、具有环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿色的 滤光片。
使用方法 :
相差装置为多功能系列显微镜中的附属装置．与普通显微镜配合使用。 (1) 相差装置的调换安装卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装 在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可吸收红色和蓝色光，使 波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良 好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。
实验目的
了解细胞膜的渗透性及各种物质进入细胞的速度。
实验器材与材料
1、器材
烧杯、试管、移液管等
2、试剂
氯化钠、氯化铵、草酸铵、硫酸钠、甘油、乙醇、丙醇等。
3、材料
血 、半透膜、洋葱、鸡蛋等
植物生物学实验_一)实验六_植物叶的形态结构 (1)
黑松针叶横切面
黑松针叶横切面
黑松针叶横切面
玉米叶横切，示维管束鞘
水稻叶横切，示维管束鞘
C4 植物叶片横切面
C3 植物叶片横切面
裸子植物叶表皮 • 叶肉 约3-4层细胞，没有栅栏组织和海绵 组织之分。 • 树脂道 分布在叶肉组织近下皮处 • 内皮层 位于叶肉组织内方，在内皮层细胞 的径向壁上具有类似双子叶植物根中所具 有的凯氏带结构。 • 维管组织
单子叶植物叶的解剖结构
• 以禾本科植物水稻叶为观察对象。了解表 皮、叶肉和叶脉等结构。
过水稻叶片主脉作横切面
示水稻小叶脉
玉米叶片过主脉作横切面
竹叶横切面
禾本科植物叶片内的维管束鞘
• 在禾本科植物的叶片中，维管束鞘有两种类型： • a C4 植物，如玉米、高粱等的维管束鞘有单层薄 壁细胞所组成，细胞较大，内含多量的叶绿体，这 种叶绿体的体积比叶肉细胞内的个大、色深；维管 束鞘细胞和其外侧紧密毗连的一圈叶肉细胞共同组 成了所谓的花环结构。 • b C3 植物如水稻、小麦等的维管束鞘 有两层细胞 (水稻细脉中，一般具一层维管束鞘)，外层为薄壁 细胞，内含较少的叶绿体，内层是厚壁细胞，几乎 不含叶绿体。
双子叶植物叶的解剖结构
• • • • 观察女贞叶横切面，叶片的结构分为： 表皮 叶肉 叶脉
女贞叶横切面
女贞叶横切面
女贞叶横切面
异面叶和等面叶
• 根据叶肉有无组织分化可分为异面叶和等 面叶，如：女贞叶为异面叶，水稻也为等 面叶；叶的上下面都具有栅栏组织的也属 于等面叶，如：夹竹桃、印度橡皮树等。
植物生物学实验（一）
实验六 植物叶的形态结构
叶的外部形态
• • • • • • 1. 叶形 2. 叶缘 3. 叶尖 4. 叶基 5. 叶脉： 叉状脉序 、网状脉序 、平行脉序 6.叶序
实验一 植物生物学实验基本方法、植物的细胞与组织
细胞；
女贞叶——同化组织
狐尾藻茎横切面示通气组织
毛茛根中的贮藏组织
（四）机械组织
功能：支持植物体。
特征：细胞壁增厚。 分类： 厚角组织 厚壁组织
1、厚角组织：
3、居间分生组织
分布：成熟组织之间，如玉米节下方， 韭菜叶基部。 功能：一定时间内仍有分裂能力。 特征：不分化，未成熟，初生性质。
（二）保护组织
分布：植物体表。
功能：减少水分流失、防止病原微生物侵害、 控制气体交换。
1、初生保护组织——表皮
特征：排列紧密，不含叶绿体的生活细胞；
外覆角质层；
常有气孔。
女贞叶表皮
禾本科植物叶片的表皮蚕豆叶片下表皮2、次生保护组织——周皮
特征：分三个层次，径向排列整齐； 分层： 木栓：数层细胞，矩形，细胞壁强烈木 栓化。 木栓形成层：单层细胞，扁长方形，细 胞核明显。 栓内层：1-3层。
椴树茎周皮
（三）基本组织（薄壁组织）
分布：各器官内。 特征：细胞壁薄，排列疏松，具明显的细胞间 隙。 • 功能：
5、分泌结构
（一）分生组织
细胞小、细胞壁 薄； 细胞核大、居中； 液泡小而分散、 细胞质浓厚。
1.顶端分生组织
2、侧生分生组织
分布：根、茎的外周部分。
2.1 形成层（维管形成层） 分布：木质部与韧皮部之间。 特征：扁砖形细胞，环状排列。 功能：分裂，使根茎增粗。 2.2 木栓形成层 分布：周皮内。 特征：扁砖形细胞，环状排列。 功能：形成次生保护组织。
注意事项：
• 开机与关机前，保证光源调至最暗；
现代生物学实验I.
现代生物学实验I习题及参考答案一、填空题1细胞生物学研究中常用的光镜有普通显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜。
2细胞培养一般分为原代培养和传代培养两种情况。
3感光片的种类很多，感色性是胶片的主要特性，根据这个特性一般黑白胶片分为色盲片、分色片、全色片。
4人口腔粘膜上皮细胞活体染色显示线粒体时用1/5000詹纳斯绿B染液染成亮绿色。
5小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察实验前两天给小鼠腹腔注射肉汤的目的刺激小鼠腹腔产生较多巨噬细胞。
6鉴别死活细胞用0.4%台盼氏蓝染色液染色。
7过滤除菌常用的滤器玻璃滤器、微孔滤器、蔡氏滤器或称赛氏滤器。
8使用高压蒸汽锅灭菌时注意排放冷空气再升压，容器灭菌时不能使用橡皮塞以免炸裂。
9干热灭菌的缺点是传导较慢。
10提取线粒体时匀浆机离心控制在0~4℃进行。
11、普通光镜样品的制备通常是将样品经过固定剂（如甲醛）固定后，包埋到包埋剂（如石腊）中，然后切成厚约5μm 的薄切片，再经过染色，以便进行观察。
12、目前在光镜水平对特异蛋白质等生物大分子进行定性定位研究的最有力的工具是荧光显微镜技术，该技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。
在此基础上若要重构出样品的三维结构，可采用激光共焦点扫描显微镜技术。
13、超薄切片技术是基本的电镜实验技术，样品制备时常用的固定剂为锇酸和戊二醛、包埋剂为环氧树脂、切片机为超薄切片机、切片刀为玻璃刀，电镜样品仅用重金属盐进行染色以形成明暗反差，因此，只能通过电子束振幅的改变观察到黑白图像。
14、观察线粒体和叶绿体基粒的精细结构时可采用负染色电镜技术，观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构时可采用冷冻蚀刻电镜技术；电镜三维重构技术主要用来分析难以形成三维晶体的膜蛋白以及病毒和蛋白质-核酸复合物等大的复合体的三维结构，扫描电镜技术主要用来观察样品表面的形貌特征，该技术具有景深长，成像具有强烈的立体感等特点。
15、电镜三维重技术与X射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。
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生物学实验(1)
10. 去掉上清液，室温干燥； 11. 将沉淀溶于50μl TE缓冲液，储于20℃冰箱中。
五、作业
➢质粒DNA和染色质DNA有什么不同？试述本实 验将质粒DNA从染色质DNA分离提取的原理。
➢影响本实验结果的因素有哪些
➢步骤5为什么温和颠倒而不能够剧烈振荡
生物学实验(1)
实验四 DNA聚合酶链式反应(PCR)
一、实验目的
➢ 了解PCR反应的基本原理和基本操作技术
二、实验材料和用品
实验仪器设备：
移液器、PCR仪、灭菌锅、制冰机、凝胶成像 系统、微波炉等
生物学实验(1)
试剂：
反应缓冲液、dNTP、MgCl2、引物、DNA 聚合酶、TBE、加样缓冲液EB、琼脂糖等
上游引物5 µM
1
下游引物5µM
1
DNA
1
DNA Taq聚合酶
0.2
ddH2O
17.3
终浓度
1x 1.5 mmol/L 200 µmol/L 0.2 µmol/L 0.2 µmol/L 20-50 ng 0.5-1 U
生物学实验(1)
94℃ 4 min (预变性)
94℃ 30 sec
34
个
Tm 30 sec
生物学实验(1)
四、实验步骤
➢ 受体菌的培养
1. 划LB平板， 37℃培养过夜；挑单克隆，接 种于3ml LB液体培养基，37℃振荡培养过夜；
2. 将该菌悬液以1:50-100比例接种于200ml LB液体培养基，37 ℃振荡培养至OD 600 =0.5
➢感受态细胞制备( CaCl2 法)
3. 将培养液转入离心管中，冰上放置10min， 离心：4℃，3000g，10 min ；
恒温培养箱、摇床、离心机、灭菌锅、涡旋 振荡器、琼脂糖电泳系统和水浴锅等
生物学实验(1)
试剂：
LB液体培养基、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、 饱和酚、氯仿:异戊醇（24:1）、TE缓冲液、 TBE 缓冲液 、上样缓冲液 、DNA Marker等
实验材料：
E. coli DH5α或 JM 109菌株
生物学实验(1)
6. 弃上清，加70%乙醇(DEPC水配制)，洗涤； 7. 离心， 4℃ ，12000g，5min，弃上清； 8. 干燥，加入50 µl DEPC水；
9. 取5 µl 测A260、A280，取5 µl电泳，其余 储藏于-70℃冰箱；
生物学实验(1)
➢ 总RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳
10. 配制1.0%甲醛变性琼脂糖凝胶； 11. 在5 V/cm条件下电泳30 min； 12. 凝胶成像系统观察拍照。
3’
5’
5’
第n次延伸
3’
3’
5’
5’
3’
四、实验步骤
1. 加入PCR反应组分，具体见表（也可以 加1滴石蜡油以防止蒸发）；
2. 置于PCR仪中，设置程序开始PCR;
生物学实验(1)
反应物
体积/µL
10 x Buffer
2.5
MgCl2 25 mmol/L 1.5
dNTP 10 mmol/L
0.5
实验材料：
E. coli DH5α或者JM 109菌株
生物学实验(1)
三、实验原理
感受态制备原理：
细菌细胞经过一些特殊方法【如电击法、或者 CaCl2、RbCl、KCl 等化学试剂法】处理，细 胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为能允许 外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
生物学实验(1)
二、实验材料和用品
实验仪器设备：
冷冻高速离心机、灭菌锅、水浴锅、水平 电泳系统、200度以上烘箱、匀浆器 、凝 胶成像系统、微波炉、紫外分光光度计等
试剂：
焦碳酸二乙酯(DEPC)、RNA提取试剂 (Trizol)、异丙醇、氯仿、甲醛、乙醇、琼 脂糖等
生物学实验(1)
实验材料： 贝或者鱼组织
9. 弃上清，加入70％预冷乙醇；
生物学实验(1)
10. 离心： 12 000 g ，5 min，弃上清; 11. 室温干燥10min，加入50-100 μl TE， 溶解DNA；
➢ 琼脂糖凝胶电泳
12. 配制浓度0.8％的凝胶；
13. 取1-2微升DNA上样； 14. 调节电压至3~5 V/cm(约150 V) ； 15. 凝胶成像系统扫胶和记录实验结果。
实验材料：
DNA或者质粒
生物学实验(1)
三、实验原理
PCR原理：
1986 年由Kallis Mullis发现。通过变性、退火 和延伸，扩增位于两端已知的序列之间的DNA 区段。每经过一个循环，样本中的DNA量应该 增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的 模板，经过25～30个循环后DNA可扩增10 6 ～ 10 9 倍。
样本中含有机溶剂、高离子浓 度或呈碱性
液相分离时温度高于10℃
增加TRI 量 4℃离心处理，液相分离
五、作业
➢ 实验中DEPC、异丙醇的作用是什么? ➢ 哪些步骤最容易导致RNA降解？为什么？
生物学实验(1)
实验三 质粒DNA提取
一、实验目的
➢ 学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA
二、实验材料和用品
实验仪器设备：
系。溴化乙锭（EB）可与DNA分子形成EB-DNA
复合物，在紫外照射下发射荧光，强度较游离状
态EB大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正
比。据此可以间接观察DNA。
生物学实验(1)
四、实验步骤
➢DNA的提取
1. 剪取0.1g闭壳肌或鱼的肌肉，剪碎，加入 450微升抽提缓冲液； 2. 加入50 μl 10%SDS和8 μl 蛋白酶K至终 浓度100-200μg/μl；
生物学实验(1)
实验一 水产动物DNA提取
一、实验目的
➢ 学习动物总DNA的抽提方法和基本原理 ➢ 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳技术
生物学实验(1)
二、实验材料和用品
实验仪器设备：
离心机、灭菌锅、水浴锅、移液器、制胶 盘、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统、 微波炉等
试剂：
抽提缓冲液〔STE、1% 2-巯基乙醇〕、蛋 白酶K、10%SDS、饱和酚、氯仿、乙醇、 异戊醇、TBE、DNA Marker、溴化乙啶 (EB)、琼脂糖等
三、实验原理
DNA提取原理：
当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色质 DNA变性，而共价闭合环状DNA的两条链分开， 外界条件恢复正常时，染色质DNA片段难复性， 与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，离心后 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等 被除去，而质粒DNA双链恢复原状，以溶解状态 存在于液相中。
5. 加入新配的溶液Ⅱ 200μl，盖紧管口，快速 温和颠倒数次，冰浴5min；
6. 加150μl预冷的溶液Ⅲ，温和振荡10sec， 冰浴中5-10min，离心: 4℃，12000g，5 min；
7. 取上清，加等体积酚/氯仿(1:1)，振荡，离 心：4℃，12000g，5min；
8. 取上清，加2倍体积的无水乙醇，混匀后20℃20min，离心：4℃ ，12000g，10min；
生物学实验(1)
四、实验步骤
➢ 总RNA提取
1. 取0.2g组织加10倍体积的 TRIzol，匀浆； 2. 室温放置5 min，加0.5 ml的氯仿，剧烈 摇动5 min； 3. 室温静置2-15分钟（氯仿使蛋白变性）； 4. 离心： 4℃，12000g，10min；
生物学实验(1)
5. 吸上清至一新离心管，加0.5倍体积异丙醇， 室温静置10 min以上 ，重复步骤4；
生物学实验(1)
实验材料： 贝类或鱼
三、实验原理
DNA提取原理：
十二烷基硫酸钠(SDS)是去污剂，能溶解细 胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得 以游离出来。蛋白酶K消化细胞后加入苯酚和氯 仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分
相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，离心除去 细胞碎片和大部分蛋白质后的上清液中加入乙醇
M
28S
RNA电
泳图
18S
生物学实验(1)
问题 可能原因
解决方案
产量太低 样本裂解或匀浆不充分
RNA溶解不充分 匀浆后未室温静置5min
A260/A280 水相酚残留 <1.65 蛋白沉淀污染
延长匀浆时间 65℃加热10min 放置有利于RNA与蛋白的解离 吸取上清不要搅动有机相 吸上清不要搅动蛋白沉淀层
3. 55 ℃水浴，消化完全后加入500 μl 饱和 酚，颠倒混匀5 min；
生物学实验(1)
4. 室温离心：12 000 g，10 min；
5. 轻轻吸上清夜至另一新的离心管，加入等 体积氯仿:异戊醇（24:1），颠倒混匀5min； 6. 重复步骤(5)； 7. 小心吸取上清夜至另一新的离心管，加入2 倍体积无水乙醇，室温放置15min以上； 8.重复步骤(5)；
生物学实验(1)
2020/11/26
生物学实验(1)
分子生物学实验多媒体课件简介
分子生物学实验多媒体课件包括了分子生物学 全部实验课程。为满足学生对《分子生物学》理论 课中的基本概念、理论和知识要点的深入理解，以 及灵活运用所学的知识指导实验设计和操作的需要， 特编写本课件。课件包括水产动物DNA提取、水产 动物RNA提取、质粒DNA提取、DNA聚合酶链式反 应(PCR)、大肠杆菌感受态细胞的制备、质粒转化、 钙调蛋白提取与聚丙烯酰胺凝胶电泳共七个实验。 采用图文结合、实践和理论结合、抽象和感性结合 方式，介绍了实验目的、设备仪器与材料、基本技 术和操作技能，便于学生理解和掌握。