白血病随机扩增多态DNA分析及其临床意义_李昕权
PCR扩增Ig,TCR基因重排片段：检测急性淋巴细胞白血病残留细胞
PCR扩增Ig,TCR基因重排片段：检测急性淋巴细胞白血病
残留细胞
李昕权
【期刊名称】《国外医学：儿科学分册》
【年(卷),期】1993(020)004
【摘要】淋巴细胞在分化过程中,免疫球蛋白基因和T细胞受体基因片段发生重排,作为急性淋巴细胞白血病细胞克隆特异性标记,用于PCR扩增检测微小残留病,敏感度达1:10~4～1:10~6个残留白血病细胞,具有临床应用价值。
【总页数】4页(P191-194)
【作者】李昕权
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】R733.71
【相关文献】
1.RQ-PCR检测Ig/TCR基因重排监测急性淋巴细胞白血病患儿治疗过程微小残留白血病 [J], 李彦媚;叶铁真;赖冬波;何映谊;林慧玲
2.BIOMED-2引物系统检测 T 淋巴母细胞性淋巴瘤/急性淋巴细胞白血病中
Ig/TCR基因重排 [J], 潘鑫艳;冯强;黎贵芸;杨长绍;杨举伦;王丽
3.PCR扩增TCRγ基因重排检测急性淋巴细胞白血病微量残留病的研究 [J], 戴木水;洪文德
4.半重叠PCR扩增IgH和TCR基因重排检测微小残留病 [J], 赵洪宁;黄志光;朱梅
刚;张素娟;董敬朋
5.PCR扩增IgH和TCR_β基因重排在检测淋巴细胞白血病微小残留病中的应用[J], 赵洪宁;黄志光;朱梅刚;张素娟;董敬朋
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南通大学学报(医学版)(原南通医学院学报)2020年第40卷第1~6期总目次
南通大学学报(医学版)(原南通医学院学报) 2020年第40卷第1~6期总目次论著·免疫专栏α-突触核蛋白的突变体A53T对小胶质细胞激活的影响何润超,王金今,张倩,郑娜,彭聿平(1) IL-17A敲除对帕金森病模型小鼠神经退变及神经炎症的影响王金今,何润超,张倩,郑娜,彭聿平(5)新型冠状病毒肺炎专栏2019新型冠状病毒肺炎26例临床特征分析田李均,徐俊贤,李晗,薛红,王娟,张晓芳,陆雪峰,明芳,韩旭东(99)两种检测方法对新型冠状病毒感染诊断价值的比较黄圣勇,陆仁飞,朱高琴,金鑫,纪荣峰,花蕾蕾(102)专家述评环状RNA在肝癌进展中的作用及其潜在价值姚敏,杨婕,姚登福(197)论著·编委有约海马外泌体中miR-219a-1-3p对神经干细胞向神经元分化的影响李雯,成翔,秦建兵,田美玲,何辉,赵荷艳,金国华(202)高压氧治疗对小鼠慢性炎症性疼痛和组织水肿的影响朱鸣镝,赵林霞,高永静(206)长链非编码RNA ZFAS1在胃癌患者血清中的表达及临床意义张艳,施英娟,申娴娟,王峰,鞠少卿(210)白桦脂酸通过抑制NLRP3/NF-κB信号通路保护四氯化碳所致肝损伤的机制研究严丽军,徐立新,何红梅,居玲玲,张湘云,邵建国(215)论著重度创伤性脑损伤患者预后的影响因素研究…章奇,刘苏,孙丽,周小云,顾琦,秦正积,沈光宇(9) 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NSCLC患者血清中miRNA675的表达及临床意义姚坚,陈金亮,孟梦,谢海琴,沈亮,吕学东,陈建荣(427)髓内钉与锁定钢板治疗胫腓骨AO分型A、B型骨折的临床效果比较王峰,史旭,孟晨,曹兴兵,陈奇,孙继芾,孙焱,黄永辉,左华,徐晓峰,李大鹏(432)右美托咪定对老年急腹症腔镜术后血流动力学及认知功能的影响周旺,单春丽,朱翔(435)转录因子12在卵巢癌中的表达及其与预后的相关性高赛楠,张玉泉,刘益飞,卞婷婷,苏敏(438)不同翻身角度配合肺部物理治疗对脑出血患者肺部感染的预防效果石慧,陈晓艳,张燕萍,吴小波,苏星(443)连续性运动康复训练对老年慢性心力衰竭患者的影响梅洁,林依青,丁云,蔡钰,王冬梅,杨希,沈益敏,张建芳(446)母血、乳汁中CTRP3水平与重度子痫前期的相关性研究黄海燕,顾艳,顾冬梅,沈红五(450) GnRHa联合生长激素治疗女童初潮后特发性中枢性性早熟张凡,顾谦学(453)眼轴与糖尿病性视网膜病变的相关性分析蒋晓冲,杨卫丹,成铃,陈晨(455) HBO1和Geminin在胶质瘤中的表达及与临床病理特征的关系田薇,王燕,章建国,刘益飞,王东林,靳钦(458)多疣壁虎血细胞形态分析王莹洁,宋红花,何兵强,孙春帅,王勇军(461)肿瘤微环境相关因子RAGE和FOXP3在结直肠癌组织中的表达及意义钱飞,黄建辉,李小龙(464)联合检测血清及腹水中的肿瘤指标对腹水性质鉴别诊断的价值彭超男,刘肇修,江枫,鲍柏军,徐伟松,倪润洲,肖明兵(495)流程质控在急性缺血性卒中静脉溶栓治疗中的应用陈鑫,周婷婷,沈加兵,何爽,曹林,蔡可夫,汪跃春,季秋虹(499) IL-33通过ST2改变MDSC功能参与MCMV肺炎郭秉楠,燕宪亮,许铁(502)不同实验条件对流式细胞术细胞周期分析结果的影响秦建兵,李雯,衣昕,田美玲,何辉,金国华(508) ICU内早期康复锻炼对呼吸衰竭患者预后质量的效果评价钱畅,韩旭东,黄晓英,张素燕,曹志龙,林金锋,袁晓宇(512)口服维生素C脂质体的制备及其稳定性考察周瑶,曹欣雨,周佳敏,朱红艳(515)无锡地区正常妊娠期妇女甲状腺功能状况研究袁世强,朱云龙,赵军,顾颖(518)基于GWAS数据库鉴定与食管癌相关的易感基因姜赟,史加海(522) 2018年扬州市居民早死亡现况及顺位分析杨文彬,解晔,李秋梅,时巧梅(526)基于德尔菲法的PICC患者健康教育路径表的构建张建红,高红娟(530)肝素结合蛋白对急性百草枯中毒患者预后判断的价值肖恒,陶言言,陆国玉,王方莉(534)异常肌电反应监测在面肌痉挛显微血管减压术中的临床意义蒋锐,刘倩倩,陈建,沈剑虹,施炜(536)社区贫困康复期精神分裂症患者伴发抑郁的现况调查及危险因素分析黄建飞,吴霞,沈春美,翟丽丽,赵晓玲,丁小兵(539)心脏超声在不同类型妊娠期高血压疾病患者心功能评价中的应用陈先锋,陆娴,张海波(542)综述NLRP3在血栓栓塞性疾病中的研究进展李树林,傅应云(50)迁移率族蛋白B1在新生儿脑损伤中的研究进展黄铧,赵建美(55)S100A8/A9异二聚体在卵巢恶性肿瘤微环境中作用的研究进展张倩,郑艳莉(59)家族性高胆固醇血症伴发缺血性脑卒中的研究进展赵晓妍,张云峰(62)组蛋白修饰在缺血再灌注损伤中的研究进展陈佳男,刘维,张嘉轩,赵珺(67)气体信号分子硫化氢在颅脑外伤中的作用及其研究进展武钰,单海燕,张明阳(162)环状RNA在泌尿系恶性肿瘤中的研究进展孙志伟,孙斐,李文光(167)眼部常见整形手术进展张童,周天球(172)内脏动脉瘤腔内治疗研究进展葛炳豪,仲崇俊,明志兵(260) Lnc RNA在食管癌中的研究进展王鹏,申文豪,郭卿,张玮,姚娟,余磊,杨颂,黄俊星(264)胃肠道间质瘤术前及术后诊断的研究进展蒋颖,闫骏(272)肠道菌群与自身免疫性甲状腺疾病的研究进展祝青,王雪琴(276)多巴胺调节免疫系统功能的研究进展蔡唤唤(354) NGAL与糖尿病肾病的研究进展王熙坚,祁月,戴厚永(358)环状RNA在疾病发展中的研究价值任逸喆(362)桥本氏甲状腺炎发病中CD4+T细胞的研究进展周美云,李双双(365)临床研究纳米炭示踪剂在甲状腺癌118例手术中的应用体会徐艳波,王华,何志贤(72)房颤合并功能性三尖瓣反流的右心超声心动图改变及其机制探讨黄楚翘,周爱云(75)西吡氯铵含漱液联合牙周洁治对口腔正畸单纯性牙龈炎青少年患者龈沟液PGE2和MMP-8水平影响的研究曹智辉(78)超声“萤火虫”成像及常规高频超声在乳腺微钙化中的研究顾星(81)小肠原发性CD20+T细胞淋巴瘤临床病理观察张伟,曹鹏,周萍,朱正龙(83)多发性骨髓瘤患者外周血淋巴细胞亚群的检测及临床意义丁侣霞,赵枰,陈相(86)人血清趋化因子CXCL8在HBV感染性肝脏疾病中的表达水平及相关性研究王德麟,汪晓莺(88)大数据下皮肤科住院患者临床分析及护理改进张丽,傅琳玲,孙雨秋,吴淼(91) 3T MRI扩散张量成像联合前列腺特异抗原密度在前列腺癌诊断中的价值徐进,吴献华,符益纲,周仪,周笑(175)个体化延续性护理对糖皮质激素性骨质疏松患者饮食依从性的效果研究俞俊俊(179)婴儿鹅口疮354例淋巴细胞亚群调查分析陈玲,李濯非,刘超(181)。
PLZF_RAR_RAR_PLZF双阳性转基因小鼠发生白血病模型研究
血病 ( A PL ) 发病中的作用及发病机制。通过交配 建立 PLZ F RAR /RAR PLZ F 双阳性 转基因小鼠 ( TM )模 型; 采
用 PCR、R T PCR 方法检测融合基因的整合和表达; 应用血象、骨髓象、病理和流式细胞术等对疾病表型进行检测分
析; 并观察全反式维甲酸 ( A TRA ) 或 ATRA 与 tr ico sta tin A ( T SA )联合 用药对 PLZ F RAR /RAR PLZ F 双阳性转
基因小鼠骨髓细胞的作 用。结果表明, 在近 18个月的时间观察到 51只 PLZF RAR /RAR PLZF 双阳 性转基因小
鼠中有 5只小鼠发病, 发病率约 10% , 与我所 同期的 仅 PLZ F RA R 转基因 阳性小 鼠 11. 3% 的 发病率 相似。发病
时间均在 6月龄以后, 与 PLZ F RAR 转基因阳性发病 小鼠相 比示提 前, 但 疾病表 型不同, 2只 ( 40% )为急 性早幼
J Exp H em a to l 2005; 13( 6): 924- 931
基金项目: 国家自然科学基金资助 ( 30300139) ; 上海市博士后科研资助计划资助 ( 2003 - 16 ) 通讯作者: 陈赛娟, 院士、执行所长、医学基因组学国家重点实验室主任.21) 64743206. E m ai:l sjchen@ stn. sh. cn 2004 - 11- 29 收稿; 2005- 6- 6 接受
材料和方法
hCG PLZF RAR /hCG RAR PLZF双阳性 TM 模型的建立及融合基因表达的 RT PCR检测 在 以 往 的 研 究 中 已 建 成 了 hCG PLZ F RAR 和 hCG RA R PLZF 两种转基因小鼠模型 [ 1, 2] , 质粒的 构建是将 PLZ F RAR 和 RAR PLZ F克隆入 pUG hCG (人组织蛋白酶 G, hum an cathepsin G, hCG ) 载 体, hCG 是调 控 PLZ F RAR 和 RAR PLZ F 表达 的微基因。小鼠的品系为 C57W T 与 CBA 杂交鼠。 在此基础上分别将 hCG PLZ F RAR TM 4个家系 ( 01号、15号、23 号和 95 号 ) 与 hCG RAR PLZ F TM 3个家系 ( 02号、40号和 84号 ) 进行交配繁殖, 4周龄后剪取鼠尾组织 1 cm, 加鼠尾裂解液 450 l 及蛋白酶 K 50 l( 1 m g /m l) , 55 消化过夜, 平衡 酚 - 氯仿抽提获得基因组 DNA, 检测融合基因整合 情况。用半定量 RT PCR各设计 1对跨融合位点的 引物, 采用 PCR 法 检测。 18SRNA 为 内参 照, RT PCR检测融合基因表 达方法见参考文献 [ 1, 2], 由 于导入的 PLZ F RAR 和 RAR PLZF 是 cDNA, 为 避免基因 组 DNA 污 染, 设 计 的引 物跨 越了 载体 hCG 的第 1个内含子。
治疗相关性白血病异基因造血干细胞移植疗效分析
Efficacy analysis of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation on therapy-related leukemia Zhang Shuqin, Fei Xinhong, Wen Hongxia, Liu Yuanyuan, Cheng Haoyu, Zhang Weijie, Wang Jingbo Department of Hematology, Aerospace Central Hospital, Beijing 100049, China Corresponding author: Wang Jingbo, Email: dpwangjingbo@
2 结果
2.1 — 般 资 料 14例 患 者 原 发 病 的 类 型 ：急性曱-幼粒细胞n 血
病 [急 性 髓 系 白 血 病 （AML)-M,]2 例 ，子宫绒毛膜癌 2 例 ，骨 肉 瘤 2 例 ，急 性 淋 巴 细 胞 内 血 病 （ALL) 1 例 ， 乳 腺 癌 1 例 ，结 肠 癌 1 例 ，子 宫 颈 癌 1例 ，混合型畸胎 瘤 1例 ，侵 袭 性 葡 萄 胎 1 例 ，肝 癌 1 例 ，霍奇金淋巴瘤 (HL)1例 ：原发病的治疗：白血病和妇科肿瘤患者均 接 受 化 疗 ，其他实体瘤患者均接受手术及化疗，淋巴 瘤患者均接受放化疗及自体干细胞移棺(表1) 2 . 2 造血重建情况
【Abstract】 Objective To investigate the clinical efficacy of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT) on therapy-related leukemia (TRL). Methods The clinical data of 14 patients with TRL who received allo-HSCT in Aerospace Central Hospital from April 2012 to February 2020 were retrospectively analyzed, and the therapeutic efficacy and survival status were also analyzed. Results Of the 14 patients, 5 were males and 9 were females; the median age was 35 years old (12-59 years old). There were 12 patients with acute myeloid leukemia, 1 patient with chronic lymphocytic leukemia/small cell lymphoma, and 1 patient with acute lymphoblastic leukemia. At the time of transplantation, 4 patients achieved hone marrow complete remission, 3 patients achieved bone marrow partial remission, and the remaining 7 patients had no remission. Five patients received HLA-matched sibling transplantation, 9 patients received haplotype transplantation, and they all received myeloablative pretreatment schemes. All 14 patients were successfully implanted; the median engraftment time of granulocyte was 16 d (10-24 d), and the median engraftment time of platelet was 13 d (10-34 d). Grade I - II acute graft - versus - host disease (GVHD) occurred in 7 patients, chronic GVHD occurred in 6 patients, and grade HI intestinal GVHD occurred in 2 patients. The median follow up time was 32 months (4-97 months). Among 14 patients, 5 patients died. Conclusion The allo-HSCT can improve the prognosis and long-term survival rate of TRL patients.
血液病基因检测的临床意义
PH染色体[t(9;22)(q34;q11),BCR/ABL]阳性 的慢性髓系白血病（CML） 慢性中性粒细胞白血病（CNL） 慢性嗜酸粒细胞白血病/高嗜酸粒细胞综征 （CEL/HES） 真性红细胞增多症（PV） 慢性原发性骨髓纤维化（伴髓外造血） （CIMF） 原发性血小板增多症（ET） 不能分类骨髓增生性疾病 七 类
亚型
5.难治性贫血伴 原始细胞增多1型 （RAEB-1） 6.难治性贫血伴 原始细胞增多2型 （RAEB-2） 7.未归类的MDS （MDS-U）
外周血象
骨髓象
8.5q-综合征 [del（5q）]
血细胞减少， 一系或多系细胞增生异常； 原始细胞＜5% 原始细胞5%~9%； 未见Auer小体； 未见Auer小体； 单核细胞＜1×109/L 血细胞减少， 一系或多系细胞增生异常； 原始细胞5%~19% 原始细胞10%~19%； Auer小体（±）； Auer小体（±）； 单核细胞＜1×109/L 血细胞减少， 单一髓系细胞增生异常； 未见或罕见原始细胞； 原始细胞＜5% ； 未见Auer小体； 未见Auer小体； 贫血； 少叶核巨核细胞正常或增多； 血小板计数正常或增高； 原始细胞＜5% ； 原始细胞＜5%； 细胞遗传学检测仅见 del（5q）异常； 未见Auer小体；
骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤 （MDS/MPN）
是一种克隆性造血干细胞疾病，特点表现为MDS 与MPD交叠，有多种“有效”造血及病态造血存 在。 慢性粒-单核细胞白血病（CMML） 不典型慢性髓系白血病（aCML） 幼年型粒-单核细胞白血病（JMML） 不能分类的MDS/MPD
四 类
骨髓增生异常综合征（MDS）
基因突变的特点
大多数基因突变对生物体 是有害的，只有少数是有利的， 有些既无害也无益。
一种颠倒进食节律的新的肥胖小鼠模型建立方法
一种颠倒进食节律的新的肥胖小鼠模型建立方法*陈嘉瑶1， 李婷1， 李欣1， 康栩倩1， 林冬莹1， 徐洁华2， 王桂香1， 臧林泉1△［1广东药科大学，广东 广州 510006；2东玄德（广州）健康管理科技有限公司，广东 广州 510030］［摘要］ 目的：建立一种成本较低、用时较短的肥胖小鼠模型。
方法：雄性昆明小鼠以丙硫氧嘧啶（14.4mg/kg ）生理盐水溶液腹腔注射，颠倒小鼠进食节律，记录摄食饮水量。
连续造模9周，以体重、Lee 指数、体脂率、皮下脂肪占总脂肪比例和口服葡萄糖耐量实验结果为检测指标；采用酶联免疫吸附测定检测血清甘油三酯（TG ）、总胆固醇（TC ）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL -C ）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL -C ）水平；对小鼠肝脏进行HE 染色和油红O 染色观察组织形态学及脂滴分布。
取小鼠肝脏进行转录组分析以找到该模型的差异表达基因及最显著表达通路。
结果：该方法成功使模型组小鼠的体重、Lee 指数和体脂率均显著增加（P <0.01），而皮下脂肪占总脂肪比例显著减少（P <0.01）。
与对照组相比，模型组小鼠的TG 含量显著增加（P <0.01），TC 和LDL -C 含量显著增加（P <0.05），HDL -C 含量显著减少（P <0.05）。
HE 染色结果显示，模型组小鼠肝脏中央静脉放射状纹理消失，出现核皱缩、细胞肿大、肝细胞内出现脂肪滴并发生气球样病变的情况。
油红O 染色结果显示，模型组小鼠肝细胞内出现密集的橘红色油滴。
KEGG 功能富集结果显示，模型组小鼠肝脏内的差异表达基因显著富集在昼夜节律调节通路，显著性排名12，排名第1的是过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR ）信号通路。
该通路下，差异基因主要富集在以PPARα为核心的脂肪细胞因子信号通路，有7个基因表达上调，11个基因表达下调。
结论：该造模方法可能通过抑制PPARα调节脂代谢的相关信号通路，在9周内快速建立肥胖小鼠模型。
26448102_氯膦酸二钠脂质体清除巨噬细胞对小鼠造血干祖细胞归巢过程的影响
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[文章编号] 1007
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2022)
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SLCO1B1c.521T＞C基因多态性与大剂量甲氨蝶呤治疗儿童急性淋巴细胞白血病药代动力学及疗效评价
急性淋巴细胞白血病（ａｃｕｔｅ
ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ
ｌｅｕｋｅｍｉａ，ＡＬＬ）是儿童最常见的肿瘤之一。大剂量 甲氨蝶呤化疗加四氢叶酸解救构成了ＡＬＬ化疗方 案的核心，然而大剂量甲氨蝶呤在显著提高治愈率 的同时，不可避免地产生诸如消化道黏膜损害、骨髓 抑制和肝肾损害等严重的毒副作用，化疗药物毒性 作用不仅是患儿死亡的重要原因，也是患儿中断或 终止化疗而复发的原因。１；。甲氨蝶呤血药浓度与 临床疗效及毒性反应关系密切，血药浓度个体之间 的差异大、原因复杂。２一。。有机阴离子转运多肽１
ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｗａｓ
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万方数据
生堡』Ｌ型盘查！！！！生！！旦釜！！鲞笠！Ｑ塑￡！ｉ！』里型丝！：Ｑ堕生翌！Ｑ！兰：∑丛！！！堕！：！！
Ｊａｎｕａｒｙ ２００８
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白血病随机扩增多态DNA分析及其临床意义李昕权李丰益(1)廖清奎(1)罗春华(1)北京军事医学科学院附属医院*提要为探讨随机扩增多态DNA(RAPD)技术分析急性白血病基因组多态性特征及其临床意义,采用10种随机引物对急性白血病进行RAPD分析和选择特征引物进行临床观察。
结果显示:急性淋巴白血病与急性髓细胞白血病各自有特征的RAPD 标记,可以在DNA水平判别各类型白血病。
RAPD标记可能用于白血病的基因分型,微小残留病检测等研究。
关键词白血病DNA随机扩增多态随机扩增多态DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)技术是90年代Williams等人发展起来的一种新的遗传分析技术(1,2),RAPD是建立在PC R基础上,利用单个短脱氧核苷酸引物,对所分析的基因组进行随机扩增,经电泳检测被扩增DNA片段的多态性,即RAPD标记。
RAPD标记的数目和大小反映了基因组内相应区域DNA的多态性,客观代表基因组之间的差异,其符合孟德尔遗传规律。
RAPD技术具有分析快速、简便的优点。
已渗透到有关遗传研究的各个领域。
在植物、生动物、昆虫及人类学研究中,取得许多有意义的成果,故适用于各种生物基因组的研究。
白血病是造血细胞恶性克隆性疾病,其基因组内存在染色体异常,原癌基因及抗癌基因的突变、缺失等各种遗传变异,因而构成不同的多态性特征,这些变异可反映白血病细胞的一些生物信息,可能作为白血病的一种分子标记进行分析。
目前,临床在对急性白血病细胞形态、组织化学、免疫表型及染色体等检查的基础上,基因水平上主要以免疫球蛋白、T细胞受体、维甲酸受体及髓过氧化物酶等细胞谱系相关的基因分析,作为急性白血病诊断分型相关的基因标记(3),适用于一定分化类型的白血病。
而在部分白血病,尤其是杂合性及未分化型白血病的结果难以进一步分析。
本文探索用RAPD技术分析急性白血病基因多态特征及RAPD标记的临床应用的价值。
RAPD为白血病基因多态性的研究,提供了简便的手段。
该技术采用不同序列的9 -10碱基随机引物,通过聚合酶链反应(PCR)对所分析的基因组DNA进行扩增,再经电泳检测扩增DNA片段,即RAPD标记。
得到的相应扩增区域内DNA多态性特征,可用于各白血病细胞基因组DNA多态性的分析。
材料和方法1.骨髓细胞标本根据FAB分型诊断标准,14例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者初诊期骨髓标本14份,缓解期标本4份。
12例急性髓细胞白血病(AML)初诊期标本12*邮编100039 (1)华西医科大学附属二院份。
正常骨髓标本6份。
白血病细胞株K562、Namalva各一份。
2.标本处理骨髓液用肝素抗凝,淋巴细胞分离液(比重1.077)离心分离单个核细胞,PBS制备成单细胞悬液。
初诊期细胞再涂片,瑞氏染色后镜检90%以上为幼稚细胞。
白血病细胞株经培养后收集细胞,PB S 制成单细胞悬液,然后提取DNA,按常规方法进行(4)。
3.PC R扩增RAPD反应体系体积25ul,含有10mmol/L tris-HC1PH8.3,50mmol/L KC1, 2.0mmol/LMgCL,100umol/LdNTPs,0. 5umol/L引物,50ngDNA模板,1.5单位TaqD-NA聚合酶。
采用PTC-100DNA扩增仪进行扩增。
RAPD反应包括94e变性1min,36e 退火1min,72e延伸2min,总计40个循环,最后于72e延伸5min。
每次均设空白对照。
扩增产物在1.4%琼脂糖凝胶电泳,2.5V/ c m,1小时,化乙锭染色,紫外灯下观察记录。
10个随机引物为基因公司产品(RAPD kit 1),见附表。
附表RAPD分析结果引物碱基序列(5.-3.)RAPD标记数1G TAG ACCCG T0~22CCTTGACGCA0~33TTCCCCCGCT1~34TCCGCTCTGG0~15GG AGGG TG TT0~26TTTGCCCG GA2~37AG GGAACGAG2~48CCACAGCAG T2~39ACCCCCG AAG0~110GGACCCTTAC0~24.RAPD结果分析记录电泳分离清晰的DNA条带。
对ALL、AML、白血病细胞株等标本的RAPD结果进行相似指数(SI)分析(5)。
根据公式:Sxy=2Nxy/(Nx+Ny)@ 100%。
其中Nxy为比较二标本共有的DNA 片段数目,Nx及Ny分别为比较二标本各自的DNA片段数目。
结果1.RAPD分析结果实验用10个引物扩增获得良好的扩增结果。
各引物扩增的DNA片段数目在0~4个之间,大小介于0.4 ~2.0Kb之间,见附表。
电泳结果见多数扩增位点为多态性,表现为DNA片段数目和大小的不同,根据电泳检测有清晰DNA条带的病例(ALL10/14例,AML8/12例)标本分析, RAPD标记可以区别ALL、AML及正常标本。
2.RAPD特征标记比较根据10个引物扩增结果分析,ALL与AML各自具有特征的RAPD标记。
ALL病例扩增片段平均18.5?4.2条,平均每个引物1.8条。
AML病例扩增片段平均16.5?4.5条,平均每个引物1. 65条。
正常骨髓标本扩增片段平均14?3.2条,平均每个引物1.4条。
细胞株na malva扩增16条,每个引物平均1.6。
K562扩增18条,平均每个引物1.8条。
结合电泳分析DNA片段大小不同,各标本之间有明显的差异,反映了各自的多态性特征。
以SI分析RAPD标记见,ALL与淋巴细胞白血病细胞株Namalva之间的SI为66.7%,AML与髓细胞白血病细胞株K562之间的SI为62.7%,正常标本与ALL及AML之间的SI分别为30. 2%和25.4%,而ALL和AML之间的SI为40%。
3.RAPD标记临床观察在6例ALL分析见引物4(TCCGC TC TGG)扩增出较一致的0.9kb的片段。
以此为特征标记对2例ALL 患者在临床治疗中进行RAPD分析,观察见1例在化疗缓解后该片段消失,同时病情处于临床缓解状态。
另1例经治疗临床获缓解后2个月连续2次检测到该片段,并且在1个月后病情复发。
讨论RAPD分析采用单个随机引物进行,所设计的引物不必事先知道DNA核苷酸序列,但有一定原则遵循,即G+C含量在50-80%,10-20个碱基长度,不含回文结构(1,2)。
所以说是某种意义上的通用引物,适用于各种生物基因组多态性分析。
RAPD 引物序列各不相同,但任一引物在所分析的基因组内部都有特定的互补部位,只要该部位序列符合PC R反应条件,即可能扩增出相应DNA片段。
如果引物扩增区域内部序列发生插入、缺失等突变,引物互补位点分布发生改变,RAPD产物会有增有减,或分子量发生改变。
因此,RAPD标记客观反映了基因组多态性的变异。
每一种生物的RAPD标记为该生物所特有,是按孟德尔方式遗传的、有用的分子标记。
本文筛选10种随机引物进行分析研究,在多数病例获得清晰的RAPD 标记,ALL和AML二类白血病之间显示明显不同的多态性特征,从RAPD图谱分析比较, ALL与白血病细胞系Namalva之间及AML与K562白血病细胞系之间的SI相近,而与正常标本的SI差异明显,提示RAPD标记可能为白血病研究的一种遗传标记。
白血病是恶性克隆性增殖性疾病。
引物4分析ALL表现出较特异的单态0.9kb片段,以该RAPD片段为标记,在2例ALL病例临床中观察,其中1例化疗获临床缓解后检测到该片段,而后病情复发。
另1例缓解后未检测到该片段,观察处于临床持续缓解。
结果提示,RAPD标记可能用于微小残留病的检测。
由于病例较少,还需要进一步研究。
RAPD技术是一简便的分析白血病基因多态性的方法,如能增加引物数目和扩大研究例数,并借助计算机图象分析,将可能提高RAPD分析的精确度,用于白血病的基因分型,造血干细胞移植后植入证据的鉴定,微小残留病的检测等。
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