牛乳中微生物的检测与分析
西藏自然发酵牛乳的微生物区系分析
采样地点 拉萨当雄 拉萨纳木错 1 米拉山 1 拉萨达孜 拉萨纳木错 2 拉萨纳木错 3 拉萨当雄 米拉山 2 山南琼结 山南隆子 山南扎囊 山南扎岗 山南贡嘎 山南琼结 山南浪卡子 八一镇菜市场
八一 日喀则江孜东郊村
日喀则谢通门 日喀则谢通门达那答
日喀则市 1 日喀则市 2 日喀则萨迦县桑木林村 日喀则岗巴县昌龙乡 昌都芒康
2 结果与分析
2.1 样品的采样地分布情况 由表1可知：29份自然发酵 牛乳样品中，有8份采自拉萨、7份采自山南、2份采自林 芝、7份采自日喀则，3份采自昌都、2份采自那曲。
作者简介：南志强（1982—），男，山西新绛人，农艺师，研究方向：农业微生物。 收稿日期：2019-08-24
25 卷 17 期
26
安徽农学通报，Anhui Agri，Sci，Bull，2019，25（17）
西藏自然发酵牛乳的微生物区系分析
南志强
（西藏自治区农牧科学院农业研究所，西藏拉萨 850032）
摘 要：为探明西藏自然发酵牛乳的微生物组成，采用传统稀释法培养发酵牛乳中的微生物，结果表明：29 份
自然发酵牛乳样品中，24 份样品的乳酸菌数在（1.10±0.20）×106~（6.78±0.04）×107CFU/g，25 份样品的酵母菌数
1 材料与方法
1.1 样品来源与采集方法 在西藏6个地市的不同地方 采集自然发酵牛乳样品29份。在发酵罐中，将发酵牛乳 充分搅拌均匀后，用已灭菌的吸管分多次吸取80~120mL 样品装入已灭菌的玻璃瓶中并塑料薄膜密封好，储藏箱 低温保存，带回微生物实验室后存放于4℃冰箱中，以待
进行微生物区系分析。 1.2 实验方法 每个样品称量5g，放入有45mL无菌水的 三角瓶中，放在70r/min的摇床上震荡15~20min，然后静静 放置10min左右，吸取1mL发酵牛乳悬浮液加入到有9mL 无菌水的试管中稀释，配成1/100倍稀释溶液，依次按照 10倍梯度稀释，依据预测结果确定每种菌培养的合适浓 度，正式进行接种培养。用MRS琼脂培养基［6］培养乳酸 菌，临用时每1000mL培养基中加入1000ppm放线菌酮液 10mL并摇匀；用酸化PDA培养基［7］培养酵母菌，临用时每 1000mL培养基中加入1%链霉素液3mL；用牛肉膏蛋白胨 培养基［7］培养芽孢菌，接种前发酵牛乳稀释溶液需80℃水 浴10min。采用稀释倾注平板法，厌氧条件下30℃恒温培 养乳酸菌48h后计数；28℃恒温培养酵母菌和芽孢菌48h 后计数。
实验一 牛乳中细菌的检查
实验一牛乳中细菌的检查一、目的要求1．了解牛乳的细菌学检查方法——显微镜直接计数法和标准平板计数法。
2．学习牛乳的巴斯德消毒法。
二、基本原理从健康母牛体内刚挤出的牛乳，含有少量的正常起始微生物。
生牛乳是一种流体,富含糖类,蛋白质,脂肪,无机盐和维生素等营养物质,其中的细菌会很快繁殖,因此,采用不同细菌学检查方法对牛乳中细菌进行卫生检查,比较得出最佳检测方法,确定不同来源的生牛乳的等级、巴氏消毒牛乳的卫生标准。
但将牛乳装入未消毒的器具和在分装、运输过程中，会被很多其他微生物甚至致病菌污染，而且牛乳含有丰富的营养物质（碳水化合物、蛋白质、脂肪、无机盐和维生素等），在其中的微生物，会很快生长繁殖，因此，一份牛乳样品的细菌含量可反映母牛的健康状况和牛乳生产与保藏的条件。
显微镜直接计数法适用于含有大量细菌的牛乳，生牛乳可用此法检查。
标准平板计数法是广泛用于牛乳微生物计数的常规方法，此法比较敏感，牛乳中含少量细菌时，能得出比较正确的结果。
三、器材及试剂生牛乳10ml，灭菌水，肉膏蛋白胨琼脂；灭菌培养皿，1ml与10ml灭菌吸管，灭菌试管，微量吸液器与吸嘴各一个，载玻片，美蓝染液，烧杯，显微镜，水浴锅，试管架，吸水纸等。
四、操作步骤1．显微镜直接计数（1）在白纸上画出1cm2的方块，然后载玻片放在纸上。
（2）用10μl的微量吸液器吸取混匀了的生牛乳样品，放在载玻片 1cm2区域的中央。
（3）用接种针将牛乳涂匀，并涂满1cm2的范围。
（4）使涂片于空气中慢慢干燥。
将铁丝试管架放在沸水浴中，然后置已干燥的涂片于试管架上，用蒸汽热固定5分钟，待干。
（5）浸于美蓝染液烧杯内染色2分钟。
（6）取出载玻片，用吸水纸吸去多余的染料，晾干。
（7）再用水缓缓冲洗，晾干。
（8）油镜下观察细菌数，共数30—50个视野。
（9）计算细菌的数目2．巴斯德法消毒牛乳(1)将水浴锅的温度调节到63℃。
(2)将生牛乳样品用力摇匀，使微生物能均匀分布。
牛乳中嗜冷菌的危害 牛乳中嗜冷菌的检测方法 - 养牛技术
牛乳中嗜冷菌的危害牛乳中嗜冷菌的检测方法-养牛技术嗜冷菌在-15—20℃之间最宜生长，其在保存过程中产生的大量胞外耐高温的脂肪酶和蛋白酶会分解脂肪和蛋白质，所以在高温杀菌后仍有残留，从而造成牛奶腐败变质。
为避免鲜牛乳发生变质,一般从收集到加工过程中都采取冷藏,但此时往往会导致乳中嗜冷菌占具主导地位,而其产生的耐热性酶类是主要造成鲜牛乳以及乳制品质量变差的一个主要原因.检测牛乳中细菌总数一般在37℃温度下进行48h培养,但该条件下嗜冷菌不会生长,从而往往被忽视,应加强检测。
下面就具体来了解一下：牛乳中嗜冷菌的危害牛乳中嗜冷菌的检测方法。
1、来源鲜牛乳中的嗜冷菌具有比较广泛的来源，且可分成较多类型的菌株，其中数量较多的是微球菌、假单胞菌以及产碱杆菌。
微球菌分布比较广泛，主要存在于动物体表、空气、水源以及、设备上；假单胞菌属主要在海水、淡水、土壤以及多种植物体内存在；产碱杆菌主要在饲料、水源以及粪便中存在。
在污染嗜冷菌的途径中，主要是通过接触个人，如药浴杯污染、挤奶工双手不卫生、水清洗乳头污染、贮存及运输设备不干净或没有严格消毒等，都容易导致嗜冷菌含量过高。
2、危害鲜牛乳中主要为兼性嗜冷菌，产碱杆菌属、假单胞菌属、克雷伯氏杆菌属、黄杆菌属以及无色杆属等，是目前经常能够分离到的嗜冷菌。
通过对以上菌株进行特性分析，发现其都会影响鲜牛乳的保存。
例如，假单胞菌具有很强分解蛋白质和脂肪的能力，能够导致脂肪发生分解，从而容易形成脂肪哈败味，还能够使其中的蛋白质发生分解产生蛋白胨；产碱杆菌，自身无法使牛乳中的糖类发生分解而产酸，但能够生成棕黄色、灰黄色的色素，还能够导致牛乳中含有的有机盐发生分解而生成碳酸盐，从而导致牛乳呈碱性，能够造成乳制品发生黏性变质。
也就是说，嗜冷菌能够使牛乳中的成分被破坏，这主要是由于嗜冷菌能够分泌耐热蛋白酶、脂肪酶而导致蛋白质、脂肪发生分解。
另外，在有氧低温条件下，嗜冷菌能够引起生色反应，如黄色、奶油色、绿色、红色、金色、黑色或者棕褐色等。
乳与乳制品中微生物及其检测
❖ 次质鲜乳——有微酸味(说明乳已开场酸败)， 或有其他轻微的异味。
❖ 劣质鲜乳——有酸味、咸味、苦味等。
❖ 乳是营养丰富，容易消化吸收的食品，含有
蛋白质、脂肪、糖、无机盐、维生素等多种 营养物质。其中，乳蛋白中含有人体所必需 的各种氨基酸；乳脂肪含有较多的不饱和脂 肪酸，故其熔点较低(27℃～34℃)，因此， 容易被人体消化吸收。乳糖对儿童大脑的发 育是不可缺少的，它能促进脑组织中糖脂化 合物的生成，还能促进机体对食中的钙和磷 的吸收及贮存；
❖ 2、原料乳卫生状况对乳及乳制品质量的影响
❖ 原料乳卫生质量的优劣直接关系到乳及乳制 品的质量。原料的卫生质量问题主要是病牛 乳(结核病、乳房炎牛的乳)、高酸乳、胎乳、 初乳，应用抗生素五天内的乳、掺伪乳以及 变质乳等。患结核病牛的乳汁不得作消毒乳 供人饮用，只能加工成乳制品。患乳房炎牛 乳、产犊前十五天的胎乳、产犊后七天的初 乳、应用抗生素五天内的乳及变质乳既不得 作消毒乳也不得加工成乳制品。
❖ (3)湿度：对于固体、半固体的乳制品，贮藏环境湿 度不能过大，因为这些乳制品受潮后易使微生物繁 殖生长或结块等。如炼乳，乳粉的贮藏环境应通风 良好，保持枯燥。硬质干酪要求贮藏在相对湿度 80 ％～85％的环境里。
❖ (4)光线：光线照射可加速乳及乳制品中一些成分 的变质，如脂肪、维生素等的氧化。因此乳及乳制 品在加工、运输、贮藏、销售等过程中均应尽量防 止光线照射。
❖ (2)时间：乳及乳制品贮藏时间过长就容易发生卫生
质量的改变。因此乳及乳制品在销售时要注意贮新
售旧，超过保存期的不得出售。消毒牛乳保存期为 24小时，酸牛乳的保存期为72小时，全脂无糖炼乳 保质期为1年，罐装的为全脂加糖炼乳保质期为9个 月，瓶装者3个月，奶油在－15℃以下冷藏保质期6 个月，4～6℃存放时间不得超过7天，乳粉有罐装 密封充氮包装时保存期为2年，罐装非充氟包装的 保存期为1年，玻璃瓶装者保存期为9个月，塑料袋 装保存期为4个月。
原料牛乳中亚硝酸盐的几种检测方法
含量超过正常值 。这种方法适用于在生鲜牛乳收购 现场的简单验收 ， 检测限为 ０ 毫克 ／ 。此方法操 ． ５ 升
作简单快速 ， 能在短时间 内得 出是否合格 的结论 ， 但
缺点是不能确定亚硝酸盐的含量。
３ 光 度 法
测定亚硝酸盐因仪器设备简单 、 易操作 、 准确度 高而在分析 中占 据重要的地位 。其特点是灵敏度高 、 准确度高 、 相对误差较小 、 仪器价廉 、 操作简单和应 用 广泛 。 ’ 目前 ， 光度法测定牛乳硝酸盐 、 亚硝酸盐的方法 除 经 典 的 “ 里斯 ” 剂 比色法 及 其 改 良法外 ， 有 格 试 还 些报道 ， 如催化 （ 褪色 ） 光度法 、 流动注射 系统分 光光度法 、顺序注射系统分光光度法 、导数光度法 等 。常用分光光度法主要有 ３ ， 目视 比色法 、 种 即 可 见分光光度法 、 紫外分光光度法。
条 件 下 ， 硝 酸 盐 与 琴 亚
二酚及锆氧
处 测 吸光 度
色鳌合物 ，于 ３２ ８ 纳米 在 ０ １２ ０ ． — ． 毫克 ／ ０ ｏ 升范
养殖技术顾 问 ２１．１ ０１１
检 疫 检 验
嗣 内与 吸光 度 呈线 性关 系 ， 为 简 易 、 速 的测 定食 成 快 品 中微 量亚 硝 酸盐 的方 法 ，通 过 对 原 料 乳 及几 种 乳 制 品 样 品 中 的 亚 硝 酸 盐 进 行 测 定 具 有 良好 的 重 现 性 。该分 析方 法操 作简便 、 速 、 快 干扰 少 ， 良好 的选 有 采 用 超声 萃 取 的方 法 进行 提 取 和净 化 ，用 阴离 子 交
检 疫 检 验
原 料 牛 乳 中 亚 硝 酸 盐 的 几 种 检 测 方 法
王 瑞 珍 （ 锡林郭勒职业学院 ０６０ ） ２００
新疆石河子生鲜牛乳微生物污染状况分析与评价
牛 乳 具 有 较 高 的营 养 价 值 ， 但 溶液， 用于制备稀释液 。 菌吸管 ： 无 容 琼 脂充分混 匀 ， 直至液 体营养琼 脂凝 是， 生鲜牛乳安 全状况不容 忽视 。牛 量分别为 １０ Ｌ和 ０ １Ｌ 培养皿 ： ．ｍ ．ｍ 。 经 固。最 后将培养 皿放入培 养箱 （０ ３ 乳 是微 生物发酵 良好 的培养 基 ， 具有 预先消 毒 的一次 性塑料培养 皿 ， 可 ３ ℃） 或 ５ 培养 ７ｈ ２。 ．．． 易腐 的特性 ， 易被微生物污 染 。微 多次使用 的玻璃培养 皿。玻璃培养 皿 ２ ２ ２ ３ 计 数 极 使用前须进行消毒 。 用于孢 子生长的 从培 养箱 中取 出 已培养 的培 养 生物 的大量繁殖 ， 会严重危 害消 费者 统计培养过程 中长 出的菌落数。 的身体健康 ， 有加 以控制 。为此应 无 菌 固体培 养 基 ，可用 普 通营 养 琼 皿 ， 必 当加强生鲜牛乳 的微生物监控 。 脂， 但最 好使用进 行孢子计 数的专用 计算 结果 ： 最好选 用那 些最后 的 １ 材 料 培养基 。 两个 水 浴 锅 ： 个 ８ ℃水 浴 ， 菌 落计 数 在 ３ ￣３０个之 间的 培养 一 ０ ０ ０ 各 牛场 每 天 交售 的生 鲜 牛 乳及 用于 原奶 样 品的加 热 （ 溶解 固体琼 皿 。用数 出 的菌 落 数乘 以稀 释 系数 ， ０ ０ 用于冷却 （ 稀释液 １的系数 为 ｌ稀释液 ２的系 ， 实验室 常用试剂 。培养箱 、 浴锅及 脂） 一个 ４ ￣５ ℃的水 浴 ， 水 ０ ０， 实验室常用设备 。 琼脂 ，维 持 琼脂 液 体状 态 以便 倒平 数 为 １ ，稀释 液 ３的系数 为 １０ 稀 皿 。 释液 ４的系数为 １ ０ ） 得 出每 ｍ ００ ， Ｌ测 ２ 方 法 培养箱 ： 温度为 ３ ￣３ ℃的培养 试样品 中的总孢子数 。 ０ ５ ２ １ 样 品的采集 ． 以石河子 各规模化 牛场 、 殖小 箱 。 养 ２ ２３ 耐热 芽 孢 总 数 ．． 区和 奶站 收售 的生鲜 牛 乳为 监测 对 煮开水 的壶和加热板 ： 溶解 固态 目前 ， 耐热芽孢 总数 ” 对“ 一词没 象 ， 品的采 集应 由具 有一定 专业 技 的无菌 营养琼脂 。 样 有 明确 的解 释 ，所使用 的程序 不 同， 得 出的结果也不 同。 下面论述方法 的 术 、 传 染性疾 病 的人 员操 作 ， 集 无 采 试管 ： 备用 吸管 ：０ Ｌ的吸管。 ｌｍ 优 点在于操 作简单 ， 不需要高压 杀菌 的样 品应 能代表 该批样 品的真 实 属 性。取样 器具必须清洁干燥、 清洁、 无 温度计 ：～ １０ Ｏ ０ ℃。高压灭菌器 ： 程 序 ， 然而 ， 当与 不 同实 验室 所做 出 菌。采集 的样 品应 保存在 ０ ５Ｃ冷藏 用于玻璃器械 ， －＂ 营养 基质的杀菌 。 的耐热芽孢 总数进行 比较 时， 必须注 容器 内， 运输途 中也不得超 过 ８Ｃ， ＂ 并 ２ ２ ２ ２ 方 法 ．．． 意使用 的方法和 流程 。 由专人负责 ， 保奶样在运 输途 中不 确 将 一定容 量 （～ ｌｍ ） ５ Ｏ Ｌ 的原奶 放 ２ ２ ３ １ 材 料 ． ． ． 损坏 、 不受污 染、 不混淆 ， 于 ６小 时 入一个 试管 ， 另一试 管中加入 与奶 应 在 吸 管 ： 吸 量 分 别 为 １Ｏ Ｌ 和 ．ｒ ａ 内送达检验 室。 等量 的水 。将两 支试 管放 入 ８ ℃水 ０ １Ｉ的无 菌吸管 。 ０ ．Ⅱ ｌ Ｊ 从各 规模化牛场 、 养殖 小区和奶 浴 。在 加水 的试 管 中插 入 一根 温 度 培养 皿 ： 经预 先消毒 的一次 性塑 站交售 的生鲜 牛乳中 ， 月随机抽样 计 ， 度升 到 ８ ℃， 每 温 ０ 再等 ｌｍ ｎ 用冷 料培 养 皿或 可 多次 使用 的玻璃 培养 Ｏｉ ， 检验 两 次 ， 以此作 为 该牛 场 、 站该 水冲 ， 含原奶样 品的试 管冷却 。用 皿 ， 奶 使 玻璃培养皿使用前必须 消毒 。 月 的微生物检验数据 。 加热后 的原奶样 品制备稀释样 品， 在 孢 子 生长 的无 菌 固体营 养 培养 ２ ２ 检 测 方 法 ． ９ｍ ９Ｌ无菌稀释液 （ 放入 一个无菌稀释 基 ：可用 普通细 菌总数营养琼 脂 ， 但 ２ ２ １ 菌落 总数 ：菌 落总数 的测定 烧瓶） 中加 入 ｌＬ己加 热 的原奶 ， ．． ｍ 并 最好使用进行孢子计数专用培养基 。 按按 Ｇ ６ １— ９ ６中规定执行 。 Ｂ９４１８ 摇动 使其彻底混匀 。 用吸管将样 品加 水 浴 箱 ： 温 度 设 在 ４ ℃ ， 以 将 Ｏ 用 ２ ２２ 芽孢 总数 ．． 入 培养皿 ，每 一步骤 用一个培养 皿 ， 冷却液化营养琼脂培养基 。 将 少 量原 奶 （— ０ Ｌ 在 ８ ℃条 并在 培养皿上作 出标记 。 ５ １ｍ ） ０ 煮开水 的壶和加热 板 ： 来对原 用 件下加热 ｌｍ ｎ Ｏ ｉ 。这一过程可 杀死大 例如 ： 号 ： ．ｍ ｌ １０ Ｌ加热 的原奶样 奶样品进行加热处理 。 多数 生长 的微生物 ， 仅有耐热 的活菌 品 ； ２号 ： ．ｍ ０ １Ｌ加 热 的 原 奶 样 品 ； ３ 二个培养箱 ： 一个温度 调至 ３ ～ ０ 可存 活下来 。 面对 已加热处理的奶 号 ：．ｍ 下 １ ０Ｌ经稀 释 的加热 原奶 样 品 ； ３ ℃ ， 一 个 调 至 ５ ￣ ５ ℃ 。 ４ ５ 另 ０ ５ 样品进行细 菌总数 测定。 号： ．ｍ ０ １Ｌ经稀释 的加热原奶样 品。 试 管： 备用 ２２ ２ １ 材料 ．．． 在 每个 含 原奶 样 品 的培 养皿 中 ｌｍ ＯＬ的吸管 ： 备用 。 无菌稀 释烧瓶 ： 内装 ９ｍ ９Ｌ无 菌 分 别加入约 ｌｍ Ｏ Ｌ冷却 的无菌液 态营 温 度计： 测量范围为 ０ ０ ℃。 ～１０ 稀释 液。氯化钠 ： ０ ９ 氯化 钠的水 养 琼脂 ／转动 培 养基 使样 品与液 体 含 ．％ 高压灭菌 器 ：用０ ３
微生物法检测牛乳中β-内酰胺类抗生素残留的对比研究
杆 菌 （ ａｉｕ ｔ ｒｈｒ ｏｈｌ ，０ ４ ） 中 科 院微 生 Ｂ ｃｌ ｓａｏ ｅｍ ｐ ｉ １ １９ ： ｌ ｓ ｅ ｔ ｓ ｕ 物研 究所 ； 霉素 Ｇ、 苄西林 、 唑西 林 、 青 氨 苯 头孢 吡林 和 青 霉 素 酶 ： 国 Ｓｇ ａ公 司 ； 美 ｉｍ 阿莫 西林 和 头孢 氨苄 ： 中 国药 品生 物 制 品 检 定 所 ； 脂 乳 粉 和 全 脂 无 抗 乳 粉 ： 脱
３Ｔ ｅ ｘｉ ｕｒｎｉｅ ｆｈ ＣｔｏＤ ｎｎｎ， Ｄ ｎ ｎ ｇ１７ ０ ） ｈ Ｅ－ ｍＱ ａ ｔ ｏｔｅ ｉ ｆ ｏｇｉｇ ｏｇ ｉ ５ ２ ０ ａ ｎ ｙ ｎ
摘要 ： 对牛乳 中 Ｂ 内酰胺类抗生素残 留的三种微生 物检测法进行 比较 ， 一 确定三种方法对牛乳 中常见 Ｂ ．内酰胺类抗生素残 留 的检测限、 检测时间、 检测成本 、 操作难易程度等关键参数 ， 同时指出 国标 Ｔ ｃ法在检测限方面 ， Ｏ Ｃ认证的 Ｂ Ｄ ｒ Ａ Ａ Ｓ Ａ法在操作难易程
李延 华 １ 王伟 军 ：‘ 张兰威 ， ２ ・ 马微 陈 丽安
Ｌ ａ—ｕ ， Ｗａ ｇＷｅ－ ｎ一 Ｚ ａｇＬ ｎｗ ｉ， ＭａＷｅ ａ ｄ Ｃ ｅ ｉ ｎ ｉ ｎｈ ａ Ｙ ｎ ｉｕ ， ｈ ｎ ａ— ｅ ｊ ｉ ｎ ｈ ｎＬ— ａ
（ １通 化 师 范 学 院 制 药 与 食 品科 学 系， 通 化 １４ ０ ； ３ ０ ２ ２ 哈 尔 滨工 业 大 学食 品科 学 与工 程 学 院， 哈 尔 滨 １０ ９ ； ５０ ０
生鲜牛乳检验方法
主题：
生鲜牛奶检验方法
版号：A/0
页码：5/49 煮沸试验
1．原理
牛乳酸度升高，蛋白质稳定性下降，牛乳经过高温蛋白质就会变性，且牛乳酸度越接近蛋白质等电点，牛乳在高温情况下变性越严重。
煮沸试验就是利用牛乳经高温处理后产生的蛋白凝块的严重程度来判定牛乳的新鲜程度。
2．仪器
电炉、试管、烧杯（500mL）、三角瓶（150mL）
3.方法
3.1取约10mL牛乳，放入试管中，置于沸水浴中5min，取出在光线充足的白色背景下观察。
3.2取50mL牛乳于150mL烧杯中，置于电炉上加热至沸腾，在煮沸过程中不断摇动，待煮沸后观察三角瓶底部的颗料状况。
4．判定
4.1试管煮沸试验，新鲜牛乳管壁无絮片出现不发生凝固现象；如果产生絮片或发生凝固，表示牛乳已不新鲜。
4.2三角瓶煮沸试验的判定标准，参照附表1判定。
图中1、2、3为合格可接收；4、5、6为不合格拒收。
主题：
生鲜牛奶检验方法版号：A/0 页码：49/49
附录：
生鲜牛乳中糊精检测比色标准板
使用说明：
标准板中随糊精含量增加，1号~6号溶液颜色逐渐由无色到深红棕色，其中3号管颜色为结果判定基准颜色。
糊精检测阴性：试验结果与3号管颜色相同或浅于3号管（如1号、2号管），则判定该牛乳糊精检测阴性，检测结果合格；
糊精监测阳性：试验结果比3号管颜色深（如4号、5号、6号管），则判定该牛乳糊精检测阳性，检测结果不合格。
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牛乳中微生物的检测与分析张月月刘敏王荣峰王君孙鹏郭海萌张帅（山东农业大学生命科学学院，泰安271000）摘要：【目的】了解牛乳的消毒和细菌学检查的重要性，及其卫生质量的判断标准。
学习牛乳的巴斯德消毒法和细菌学检查的方法。
【方法】采用显微镜计数法、美蓝还原酶实验法、标准平板计数法进行测定，确定不同来源的生牛乳的等级、巴氏消毒牛乳的卫生标准。
【结果】微生物显微镜直接计数法随机性大，对茵体数量不能做出较为宏观，全面的反应．优点是计数快速；美蓝还原酶实验法是用于测定牛乳质量的一种定性检测法，操作简便，不需特别设备。
它不能做为定量检查；平板茵落计数法速度慢，需要平板上长出茵落一段时后才能计数。
【结论】由于平板茵落计数法通常做梯度稀释，所以计数的线性范围大．由于是茵悬液涂布，所以比较均匀，能较好的反应茵落的疏密程度。
重复性，平行性很好。
是经典的计数方法。
关键词：牛乳;微生物;检测;分析Detection and analysis of microorganisms in milkYueyue Zhang，Min Liu，Rongfeng Wang，Jun Wang，Peng Sun，Haimeng Guo，Shuai Zhang (College of Life Sciences, Shandong Agricutual University, Tai’an, 271000, China)Abstract:【Purpose】to understand the milk sterilization and bacteriological examination of importance, and its hygienic quality judgment standard. Learning milk Pasteur disinfection method and bacteriological examination method. 【MEFHOD】Uses the microscope count the methylene blue reductase method，the standard plating count method to carry on the determination of the number of bacteria，determined different origin the fresh COWS milk rank，pasteurized milk hygienic standard．【RESULTS】Microorgaism microscope direct countmethod 。
It has big ran domness cannot make comparatively macroscopic ，overall comprehensive for milk quantity ．But the advantages are coninung and fast for counting of bacteria ；The methyrlene blue reductases method is used in determining the COW'S milk quality．It is simple．No special equipments needed．But it cannot use for the quantitative examination ；The plating colony count methods is relatively slow，needs the growth of bacteria on the plate and colonies can be counted．【CONCLUSION】Because the plating count method usually makes the gradient to dilution，therefore the counting linear scope is broad ．Because bacterium suspended solution is poured out on the culture of bacterium uniformly ．The bacterial colony density degree can obtain ．The retentiveness，parallelism is very good．It is the classical method of counting bacteria ．Key words: milk ；microbial ；detection；analysis；前言牛乳是一种营养全面的液态天然饮料,含有人体所需的碳水化合物、蛋白质、脂肪、各种矿物质和维生素[1] 。
其中的细菌会很快繁殖，因此，采用不同细菌学检查方法对牛乳中细菌进行卫生检查，比较得出最佳检测方法，确定不同来源的生牛乳的等级、巴氏消毒牛乳的卫生标准。
现今常用显微镜计数法、美蓝还原酶实验法、标准平板计数法进行测定，切入点不同的方法各有优缺。
随着人们生活水平的提高,对乳制品的需求亦不断上升。
目前国内对乳制品的研究主要集中在发酵酸奶上,但由于国人习惯消费短期内的乳制品,故巴氏杀菌乳在整个消费中仍占主导地位。
牛乳的细菌学检查一般有显微镜直接计数法、检测大肠菌群、美蓝还原酶试验和标准平板计数法[2]，现通过试验来了解掌握牛乳的巴斯德消毒方法以及微生物细菌学检测方法,试验通过美蓝还原酶试验和标准平板计数法分别定性、定量检测牛乳样品的细菌数含量，同时通过对照试验，确定在牛乳消毒中被广泛应用的巴斯德消毒法的卫生标准是否达标。
1材料与方法1.1实验器材1.1.1培养基和牛乳样品亚奥特巴氏消毒牛奶样品亚奥特巴氏消毒变质牛奶样品牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g 蛋白胨10g 氯化钠5g 琼脂15～20g 水1000ml PH 7.0～7.2 121℃灭菌20nin1.1.2溶液和试剂美兰溶液（1：250 000）无菌水1.1.3主要仪器和其他用品超净工作台，水浴锅，高压灭菌锅，酒精灯，恒温培养箱，9 cm无菌培养皿，无菌18×180mm试管，试管架。
无菌250ml三角瓶，无菌棉塞，移液枪与相应规格的无菌枪头1.2试验方法1.2.1材料预算，培养基配制，无菌水分装，高压灭菌。
1.2.2美兰还原酶试验法1)标记3个无菌试管1、2、32)分别向3个试管中加入10ml不同品牌的生鲜牛乳样品（1号变质亚奥特牛奶，2亚奥特纯牛奶，3号亚奥特纯牛奶）3)分别向试管中各加入1ml美兰，盖紧管塞4)轻轻倒转试管约4次，置于37℃水浴中，并记录培养时间5)测试管在水域中稳定5min中后，取出，轻轻倒转一次后再放回水浴中6)每隔30min观察记录试管中美兰颜色的变化，直至3～6h1.2.3巴斯德法消毒牛乳1)将水浴锅的温度调至80℃2)将牛乳样品用力摇匀，使微生物能均匀分布3)用灭菌的10ml吸管吸取5ml生牛乳样品放入灭菌试管内，然后将试管放入调好温度的水浴锅中，水面要超过牛乳表面4)保持15min，并不时摇动5)一到15min立刻取出试管，用流水冲试管外壁，使其中的牛乳迅速冷却。
1.2.4标准平板计数法1)将巴氏消毒的牛乳样品充分摇匀，系列稀释至10-2、10-3和10 -4。
2)用1ml无菌吸管从三个梯度分别取1ml注入空白平板内3)各平板倾注约15ml已经融化并冷却至45 ℃左右的牛肉膏蛋白胨培4)凝固后，倒置于37 ℃培养箱内，培养24h。
5)选择长有30~300个菌落的平板计数，并计算出1ml牛乳中的细菌总数。
6)普通生牛乳样品中的检查同上法，但稀释度为10﹣3、10 -4和10-5。
2实验结果与分析2.1 实验结果2.1.1美蓝还原酶试验法结果见表1。
2.1.2 标准平板计数法结果见表2。
“﹨”表示无该梯度浓度，“——”表示没有菌落。
2.2结果分析2.2.1美蓝还原试验法1号试管为变质亚奥特牛奶还原时间为90min，所以牛乳质量为“四级奶”；2号试管为亚奥特纯牛奶还原时间为330min，故牛乳质量为“二级奶”。
3号试管为亚奥特纯牛奶未加美蓝溶液，作为观察颜色变化的对照实验组。
2.2.2标准平板计数法从实验结果来看，对于巴氏消毒后牛乳的标准平板计数，平行实验平板间菌落个数不相近，存在误差；梯度浓度间菌落个数差别较为明显。
未经巴氏消毒牛乳梯度浓度间菌落数目差别不明显。
3讨论3.1结果分析美蓝还原酶试验中三支试管中美蓝的还原时间与牛乳的质量较匹配，实验结果可度较高。
而标准平板计数法中由于各种原因导致实验数据较真实情况有较大差异，实验结果不准确，可信度不高。
3.2标准平板计数法试验失败原因分析1)未做空白平板的对照，导致培养皿菌落数无法对照2)无菌操作不到位，尤其是在接种和倒平板时，操作未在无菌圈内进行，导致培养皿污染，使实验结果不准确3)在培养时，未倒置培养4)由于没搞清楚牛乳中细菌的生长条件，在培养时用报纸包裹培养皿培养，导致实验结果与实际差异较大3.3 讨论美蓝还原酶实验法是用于测定牛乳质量的一种定性检测法，操作简便，不需特别设备。
它不能作为定量检查；平板菌落计数法速度慢,需要平板上长出菌落一段时后才能计数。
由于平板菌落计数法通常做梯度稀释,所以计数的线性范围大。
由于是菌悬液涂布,所以比较均匀,能较好的反应菌落的疏密程度。
重复性,平行性很好,是经典的计数方法。
巴氏消毒后1ml牛奶中含菌数不超过30000符合我国消毒牛乳的卫生标准。
未经消毒的牛奶在培养基没长出菌落理论上是不应该的，首先因试验中每支试管中无菌水装了4.5ml，系列稀释时移液枪不够长很难吸取前一稀释度的溶液到后一试管，接下来也很难吸1ml稀释的溶液到培养皿进行培养，无法做3个平行，每个稀释度只做了一个平板，而且没做对照，无法确定培养基及操作方面的原因。
无菌水少也导致溶液混合不均匀，可能使加入培养皿的溶液含菌数少甚至不含菌。
其次，倒此组试验平板的培养基放置时间久，温度降低导致最后在三角瓶的培养基凝成块状，制出的培养基不均匀，不适宜细菌生长。
导致平板不长菌落还可能是系列稀释操作时枪头靠近酒精灯温度高把溶液中的细菌杀死了。
4. 结论牛乳的细菌学检查方法常用的有显微镜直接记数法、美蓝还原酶实验法、标准平板记数法。
显微镜记数法适用于含有大量细菌的牛乳, 生鲜牛乳可用此法检查。
如果显微镜检查,每个视野只有1～3 个细菌左右,此牛乳为一级牛乳; 如果牛乳中有很多长链球菌和白细胞,通常来自乳房炎的母牛;若一个视野中有很多不同的细菌,则往往是使用了脏器具保存的牛乳。