辣根过氧化物酶固定化载体材料的研究进展
固定化酶载体的研究现状及其应用
ｅｇｎｅ ｎ ｄＳ ｎ ｍ ｏｉｚｄＥ ｚｍｅ ｅｃ ｒ（Ｍ Ｒ）ｗ ｕｄｂ ｅ ｅ ｒｈ ｎ ｅｒ ｇａ ｏ ．Ｉ ｍ ｂｌｅ ｎｙ ａｔ Ｉ Ｅ ｉ ｉ ｎ Ｏ ｉ Ｒ ｏ ｏｌ ｅａ ｗ ｆ Ｍ ｆ ｅ印ｐｉ ｔ ｎ ｆｍ ｏ ｉｚｄｅｚｍｅ ｗ ｅ ｎ ｉ ｏ ｔ ｌ ａｉ ｓ ｍ ｂｌｅ ｎｙ ｓ ｈｎｉ ｃ ｏ ｏｉ ｉ ｔ
酶 的固定化 是用 一定 的材料将 活 性酶束 缚或 限制 于一
定的 区域 内 ， 但仍 能进行 酶所特 有 的催化 反应 ， 可 回收及 并 重复使用的一种新 技术。与水溶酶相 比， 固定 化酶在保 持其
质， 同时 又易于接 枝而 改性 ， 再加 上其 来 源丰 富， 成本 低廉 ， 制备简单 ， 已成 为开发 固定化酶载体 材料 的方 法之一 。利用
中图分类号 ： ３ Ｏ６１
文献标 识码 ： Ａ
文章 编号 ： ０３ ５ １ （０ ７ ０ — ０ ９ ０ １０ － ７ ０ ２０ ）２ ０２ — ３
酶固定化技术的最新研究进展
西安工程大学学报J o u r n a l o f X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y第38卷第1期(总185期)2024年2月V o l .38,N o .1(S u m.N o .185)引文格式:潘虹,陆天炆,王晓军,等.酶固定化技术的最新研究进展[J ].西安工程大学学报,2024,38(1):83-91.P A N H o n g ,L U T i a n w e n ,WA N G X i a o j u n ,e t a l .R e c e n t a d v a n c e s i n e n z y m e i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g y [J ].J o u r n a l o f X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y,2024,38(1):83-91. 收稿日期:2023-08-06 修回日期:2023-10-21基金项目:陕西省自然科学基础研究计划项目(2021J Q -672㊁2022J Q -117);陕西省教育厅专项科研计划项目(22J K 0399) 通信作者:潘虹(1988 ),女,讲师,博士,研究方向为固定化酶和多孔水凝胶㊂E -m a i l :441595837@q q.c o m 酶固定化技术的最新研究进展潘 虹,陆天炆,王晓军,洪一楠(西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048)摘要 酶作为一种催化性能好且安全可靠的生物催化剂,在食品㊁医药及环境治理等诸多领域得到了广泛应用,但因受限于游离酶较差的环境稳定性而难以实现进一步的工业化应用㊂酶固定化技术有助于提高游离酶对敏感环境的耐受性和操作过程中的稳定性,大大缩减了应用成本㊂回顾了近五年内固定化技术的发展及现状,总结了吸附法㊁结合法等传统固定化方法,共固定化酶法等新型固定化方法,以及天然材料载体㊁复合材料载体和纳米载体等不同固定化载体在各个领域的研究进展㊂相比于游离酶,固定化酶体系在稳定性和重复使用性等方面得到了显著提升,但同时也存在一些不足,如固定后的活性回收率降低㊁载体合成途径繁琐且成本较高以及固定化酶作用机理尚不完善等㊂结合这些不足之处提出了酶固定化技术在未来的发展方向㊂关键词 酶固定化;固定化载体;固定化方法;纳米载体;共固定开放科学(资源服务)标识码(O S I D )中图分类号:Q 814.2 文献标志码:AD O I :10.13338/j .i s s n .1674-649x .2024.01.011R e c e n t a d v a n c e s i n e n z y m e i m m o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g yP A N H o n g ,L U T i a n w e n ,WA N G X i a o ju n ,H O N G Y i n a n (S c h o o l o f E n v i r o n m e n t a l a n d C h e m i c a l E n g i n e e r i n g ,X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y,X i a n 710048,C h i n a )A b s t r a c t A s a n e f f i c i e n t a n d s a f e b i o c a t a l y s t ,e n z y m e s h a v e b e e n w i d e l y u s e d i n m a n yf i e l d s s u c h a s f o o d ,m e d i c i n e a n d e n v i r o n m e n t a lg o v e r n a n c e ,b u t i t i s d i f f i c u l t t o r e a l i z e f u r th e ri n d u s t r i a l a p-p l i c a t i o n d u e t o t h e p o o r e n v i r o n m e n t a l s t a b i l i t y o f f r e e e n z y m e s .E n z y m e i mm o b i l i z a t i o n t e c h -n o l o g y h e l p s t o i m p r o v e t h e t o l e r a n c e o f f r e e e n z y m e s t o s e n s i t i v e e n v i r o n m e n t s a n d t h e s t a b i l i t yd u r i n g o pe r a t i o n ,a n d g r e a t l y r e d u c e s t h e a p p l i c a t i o n c o s t .T h i s p a p e r r e v i e w s t h e d e v e l o pm e n t a n d c u r r e n t s i t u a t i o n o f i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g yi n t h e p a s t f i v e y e a r s ,a n d s u mm a r i z e s t h e r e -s e a r c h p r o g r e s s o f d i f f e r e n t i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s(i n c l u d i n g t r a d i t i o n a l i mm o b i l i z a t i o n m e t h-o d s s u c h a s a d s o r p t i o n m e t h o d a n d b i n d i n g m e t h o d a n d n e w i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s s u c h a s c o-i mm o b i l i z a t i o n e n z y m e m e t h o d)a n d i mm o b i l i z a t i o n c a r r i e r s(i n c l u d i n g n a t u r a l m a t e r i a l c a r r i e r s, c o m p o s i t e c a r r i e r s a n d n a n o c a r r i e r s)i n v a r i o u s f i e l d s.I n g e n e r a l,c o m p a r e d w i t h f r e e e n z y m e s, t h e i mm o b i l i z e d e n z y m e s y s t e m h a s b e e n s i g n i f i c a n t l y i m p r o v e d i n t e r m s o f s t a b i l i t y a n d r e u s-a b i l i t y.H o w e v e r,t h e r e a r e s o m e s h o r t c o m i n g s,s u c h a s l o w e r r e c o v e r y r a t e a f t e r i mm o b i l i z a-t i o n,c u m b e r s o m e a n d c o s t l y c a r r i e r s y n t h e s i s p a t h w a y,a n d i m p e r f e c t m e c h a n i s m o f i mm o b i l i z a-t i o n e n z y m e.F i n a l l y,t h e d e v e l o p m e n t d i r e c t i o n o f t h e t e c h n o l o g y i n t h e f u t u r e w a s p u t f o r w a r d b a s e d o n t h e s e s h o r t c o m i n g s.K e y w o r d s e n z y m e i mm o b i l i z a t i o n;i mm o b i l i z a t i o n c a r r i e r s;i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d;n a n o c a r r i-e r s;c o-i mm o b i l i z a t i o n0引言生物酶是一类具有催化效率高㊁专一性强的生物催化剂[1],其本质是一种蛋白质㊂因此,生物酶通常需在常温常压等温和条件下才能表现出其高催化性能,当离开特定环境就会出现酶活性和稳定性迅速降低的缺点[2]㊂活性炭可以吸附蔗糖酶进行蔗糖水解,且保持了蔗糖酶较好的催化活性[3]㊂由此,固定化酶的思想被首次提出㊂随后,研究人员开始通过一系列酶固定化技术来改善游离酶存在的缺点㊂酶固定化技术就是指将游离酶通过一定的技术手段固定在某些不溶性载体上,进而使其在敏感环境下仍然表现出较高的稳定性和酶活性[4]㊂经固定化后的酶,可以借助载体的保护作用或者与载体之间相互作用,保护了酶蛋白的空间构象[5],进而提高了对p H㊁温度㊁重金属离子等影响因素的耐受性㊂同时,固定化酶可以通过简单的离心过滤等手段从反应体系中分离出来,促进漆酶的回收和重复使用[6]㊂目前,固定化酶技术已经在食品加工[7]㊁生物传感器[8]㊁纺织印染废水处理[9-10]㊁生物漂白[11]等诸多领域得到广泛的应用,其固定化技术也表现出愈发成熟的发展㊂本文综述了近五年酶固定化技术的发展,重点表现在固定化方法和固定化载体上,以及酶固定化技术在多个领域的应用㊂1酶固定化方法酶固定化方法可分为传统固定化方法和新型固定化方法㊂表1列出来近五年的一些酶固定化技术所用的方法㊂表1固定化酶所用固定化方法T a b.1I mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s u s e d i n d i f f e r e n t i mm o b i l i z a t i o n t e c h n i q u e s固定化方法固定化对象载体材料参考文献传统固定化方法吸附法漆酶/α-淀粉酶生物炭/复合晶凝胶[12-13]共价结合法脂肪酶M I L-53(F e)/球形S i O2[14-15]化学交联法漆酶/葡萄糖淀粉酶磁性纳米粒/纳米S i O2[16-19]包埋法漆酶海藻酸铜微球[20]新型固定化方法吸附-交联法脂肪酶/β-葡糖糖苷酶大孔树脂/纳米S i O2[21-22]吸附-包埋法多种酶/纤维素酶多孔淀粉-阿拉伯胶微囊体/仿生S i O2[23-24]交联-包埋法漆酶聚集体介孔S i O2[25]脂肪酶/磷脂酶聚乙烯亚胺[26]共固定法葡萄糖淀粉酶/葡萄糖氧化酶S i O2[27]葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶磁性聚乙二醇微凝胶颗粒[28]1.1传统固定化方法1.1.1吸附法吸附法即物理吸附,物理吸附是一种简单易行的方法,通过氢键㊁疏水作用和范德华力等相互作用48西安工程大学学报第38卷使酶吸附到不溶于水的载体表面,该方法操作步骤简洁且不需要额外添加化学试剂,但其固定效果较差且容易受外界条件影响[29]㊂WA N G等采用吸附法将漆酶固定在碱改性生物炭(A-M B)上实现对孔雀石绿(MG)的吸附降解,结果表明,A-M B对MG 表现出最大吸附量757.58m g/g,固定化漆酶A/l a c @A-M B对MG的去除率可达97.70%,10次循环后仍然表现出超过75%的去除率[12]㊂A C E T等以沸石颗粒(P P A)为原料,通过简单方法制备了C u2+-A P P a C包埋型复合晶凝胶(C u2+-A P P a C)用于α-淀粉酶吸附固定,结果表明,α-淀粉酶最大吸附量可达858.7m g/g,同时相较于游离酶,其操作稳定性和存储稳定性也表现出明显的优势[13]㊂1.1.2结合法结合法是利用酶的侧链基团与载体表面的基团发生反应形成共价键,利用共价键将酶固定在载体上[30]㊂G H A S E M I等将M I L-53(F e)通过表面官能化对2种脂肪酶进行共价固定,结果显示脂肪酶固定化体系虽然没有实现对酶的高负载,但仍然表现出更广泛的温度和p H值稳定性,同时实现了酶的可重复使用能力和稳定性的显著改善[14]㊂此外,共价结合法由于化学键的形成,容易使酶的蛋白质构象发生改变,从而降低酶活性[31]㊂F A N等采用戊二醛多点共价结合法和吸附-交联法,以球形二氧化硅为载体,固定化皱纹假丝酵母脂肪酶(C R L),结果表明,多点共价处理后脂肪酶二级结构发生变化,使酶的残余活力下降[15]㊂但相比之下,共价结合法制备的酶体系具有更好的重复使用性和稳定性,使其在酸化油脂催化水解中更有潜力㊂1.1.3化学交联法交联法是通过一些双功能试剂将酶和载体进行连接[31],主要用到的交联剂有戊二醛㊁1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(E D C)㊁二醛淀粉和二醛纤维素[30,32-33]等㊂C H E N等以戊二醛作为交联剂制备了一种具有超顺磁性的固定化漆酶F e3O4@S i O2-N H2-L a c,该固定化体系表现出了良好的稳定性,对有机溶剂㊁金属离子有显著的耐受性和良好的循环使用性,同时在对酚类化合物的去除降解方面也表现出巨大的潜力[16]㊂Q I U等以二醛淀粉为交联剂,采用共价固定法将漆酶在离子液体改性的磁性纳米载体上进行固定,较于其他固定化漆酶,在处理含酚废水中表现出更大优势[17]㊂然而常见的交联剂在固定化过程往往会表现出一定的负面影响[34],为此研究人员着手发掘绿色安全的新型交联剂来避免这种负面影响㊂例如,O U Y A N G等提出了一种新的绿色高效固定化酶的方法 京尼平苷酶解物作为交联剂固定化漆酶[18]㊂与直接使用京尼平或戊二醛作为交联剂,该方法绿色㊁安全,可应用于需要严格控制毒性的食品和医药行业㊂D A N I E L L I等研究了一种双功能交联剂2,5-二甲酰基呋喃(D F F)将葡糖淀粉酶固定在氨基官能化甲基丙烯酸树脂上[19]㊂使用海洋细菌费氏弧菌进行了生态毒性测定,相比于戊二醛,D F F表现出更低的生物毒性㊂1.1.4包埋法包埋法是将酶固定在聚合物材料的网格结构或微囊结构等多空隙载体中[35]㊂这种方法可以提供更好的保护和稳定性,限制了酶的扩散㊂但同时也存在孔隙的扩散阻碍,使得该方法的循环使用效率下降㊂例如,L A T I F等采用包埋法将漆酶固定化在海藻酸铜微球上进行双酚A的降解[20]㊂相比于游离酶,固定化漆酶表现出更高的p H㊁温度稳定性及储存稳定性,但在循环使用5次后剩余酶活降到了21.5%㊂1.2新型固定化方法1.2.1传统固定化方法的改进传统的单一固定化方法进行酶固定往往存在各自的缺点,因此出现了将单一方法进行两两结合来固定化酶的改进方法㊂常见的包括吸附-交联法[21-22]㊁吸附-包埋法[23-24]㊁交联-包埋法[25]等㊂例如,F A T H A L I等以介孔二氧化硅为载体,采用交联-包埋相结合的固定化方法制备了包埋交联漆酶聚集体(E-C L E A)[25]㊂相对于游离漆酶,条件优化后的固定化漆酶显示出较好的热稳定性和p H稳定性㊂此外E-C L E A存储21d仍然具有较高的相对活性,在重复使用20次后,其活性保持率可达初始活性的79%㊂对污染废水中苯酚的去除率可达73%[25]㊂1.2.2共固定化酶法共固定化酶是指将多种酶同时固定化在同一载体上的一种方法㊂A R A N A-P EÑA等实现了将5种酶进行逐层固定化的策略,使得整个固定化酶体系的活性明显增强[26]㊂与单一酶的固定化相比,共固定化酶法通常具有更大的优势㊂在保证了固定化后酶稳定性提高的同时,不同酶在共固定后,由于处于58第1期潘虹,等:酶固定化技术的最新研究进展同一载体上,酶之间可以发挥协同作用,且反应底物可以连续在酶之间传递,从而简化了反应步骤㊂G A O等制备了一种化学酶级联反应体系(G A&G O x@A u-S i O2),实现葡萄糖淀粉酶(G A)和葡萄糖氧化酶(G O x)共固定化[27]㊂借助于双酶和载体之间的级联效应,实现了从可溶性淀粉中高效提取葡萄糖酸㊂在保证了固定化双酶稳定性的同时,A u的加入可以使中间产物H2O2快速脱除,显著提高固定化体系的重复利用率㊂类似地,L I U等制备了一种具有可逆热响应释放的双酶固定化体系共固定G O x和辣根过氧化物酶(H R P),在葡萄糖浓度检测过程中表现出优于单酶检测试剂盒的良好性能[28]㊂此外,有学者研究发现,对于如漆酶这种绿色催化剂,较低的氧化还原电位大大限制了其在各个领域中的应用㊂但发现在固定化体系中引入具有高氧化还原电位的介体可以弥补漆酶的这一不足[36]㊂L O U等基于MO F s膜实现了漆酶和介体A B T S的共固定化,结果显示,固定化漆酶的底物亲和力要高于游离漆酶[37]㊂2酶固定化载体用于酶固定化的载体主要包括天然载体㊁人工合成载体和纳米载体,见表2㊂在选择固定化载体时要充分考虑具体的应用领域和需求等㊂表2固定化酶所用载体材料T a b.2 C a r r i e r s f o r i mm o b i l i z e d e n z y m e材料类别载体材料固定化对象固定化方法参考文献天然材料羧甲基纤维素漆酶包埋法[38]琼脂糖脂肪酶吸附法[39]磁性壳聚糖葡萄糖氧化酶共价结合法[40]藻酸盐脱氢酶/蛋白酶吸附法/包埋法[41-42]壳聚糖-黏土复合微球漆酶+介体包埋法[43]海藻酸钠-壳聚糖中性蛋白酶包埋法[44]人工合成材料改性二氧化硅乳酸脱氢酶/碳酸酐酶/甲酸脱氢酶化学交联法/共价结合法[45-47]二氧化钛漆酶吸附法[48]硅酸盐漆酶/葡萄糖氧化酶吸附-共价结合法/吸附法[49-50]氧化铝漆酶共价结合法[51]聚酰胺-胺树枝状大分子脂肪酶化学交联法[52]聚乙烯醇水凝胶-硅胶烯还原酶包埋法[53]二氧化硅-壳聚糖漆酶共价结合法[54]纳米材料磁性纳米粒子漆酶共价结合法[55]金属有机框架MO F s漆酶化学交联法[56]介孔Z I F-8过氧化物酶化学交联法[57]中空微球漆酶吸附法[58]共价有机框架C O F葡萄糖氧化酶+F e3O4吸附法[59]金属酚醛网络M P N酒精脱氢酶吸附法[60]磁性纳米颗粒漆酶+介体A B T S吸附法[61]2.1天然载体材料天然载体最大的优点就是来源广泛㊁低成本和低生物毒性㊂常用的天然载体有纤维素[38]㊁琼脂糖[39]㊁壳聚糖[40]和藻酸盐[41-42]等㊂同时,将天然载体杂化后用于酶固定化可以表现出更优良的固定化能力㊂M E H A N D I A[43]等利用天然载体制备了壳聚糖-黏土复合微球(C C B-L),采用包埋法对漆酶和介体进行共固定㊂微球在洗涤和储存期间均未观察到酶泄漏㊂同时固定化漆酶-介体体系通过填充床反应器系统(P B R S),对纺织废水的脱色率可达78%,C O D㊁B O D以及毒性水平均下降㊂类似地, B A I等将海藻酸钠和壳聚糖交联形成复合凝胶球,采用包埋法固定中性蛋白酶[44]㊂固定化酶在较宽的p H(5~8)和温度(30~80ħ)范围表现出高于游离酶的相对活性,循环使用性和存储稳定性也保持在良好水平㊂68西安工程大学学报第38卷2.2人工合成载体材料2.2.1无机材料无机材料来源广泛㊁合成简单㊁机械强度高,可以直接用于酶的固定㊂常见的无机材料有二氧化硅[45]㊁二氧化钛[48]㊁硅酸盐[49-50]和氧化铝[51]等㊂为了提高固定化效率,常常会先对无机材料进行表面改性再用于固定化㊂Z H A I等使用聚乙烯亚胺(P E I)和多巴胺的共沉积对二氧化硅微球进行改性,用于C O2酶促转化甲酸盐㊂优化后P D A/P E I-S i O2载体使得甲酸盐合成的初始反应速率从13.4倍增加至27.2倍㊂再通过固定化碳酸酐酶(C A)后,甲酸盐的合成速率增加到48.6倍[46]㊂随后,L I U等同样对S i O2微球进行P E I的表面改性后用来固定化甲酸脱氢酶,同样实现了C O2酶促转化甲酸盐的高效合成[47]㊂2.2.2高分子材料人工合成的高分子材料具有良好的结构刚性和其他优良的力学性能㊂如聚酰胺㊁聚乙烯醇等具有良好的固定化能力㊂Z H A O等采用3种胺类试剂将聚酰胺-胺树枝状大分子(P AMAM)接枝到F e3O4纳米粒子上,利用戊二醛作为交联剂得到了不同代数的F e3O4@S i O2/P AMAM磁性纳米载体[52]㊂固定化酶表现出相对游离酶更高的活性,而且改善了其在更宽的p H和温度范围内的耐受性㊂A L A GÖZ等先用聚乙烯醇水凝胶包裹烯还原酶(E R),再固定到氨基官能化的硅胶上㊂包埋后的E R比游离E R的热稳定性高34.4倍㊂在重复使用10次后,固定后的E R仍保持其初始活性的85%[53]㊂2.2.3复合材料针对有机㊁无机材料在实际应用中存在的不足,不少文献报道了将2类材料通过物理或化学手段进行复合得到新型复合材料,可以得到性能更优的固定化载体㊂例如,G I R E L L I等将二氧化硅和壳聚糖杂化得到复合材料,相比单材料拥有更好的机械强度㊁热稳定性及生物相容性㊂存储30d后仍具有大于70%的相对活性㊂对漆酶进行固定化后,固定化率达到92%,在较宽的温度和p H范围内固定化后漆酶表现出的稳定性也要高于游离漆酶,重复循环利用15次剩余活性仍在61%以上[54]㊂2.3纳米材料载体纳米材料凭借其小尺寸㊁高表面积和易改性等特点,成为了酶固定化载体研究的焦点㊂各种改性后的纳米材料也在酶固定化领域得到蓬勃发展㊂2.3.1磁性纳米载体磁性纳米载体是一种可以通过外部磁场实现固定化酶快速分离的良好材料㊂凭借这种磁学性质和低生物毒性[16],其在固定化载体的选择上表现突出㊂F e3O4是被广泛使用的一种磁性材料㊂但由于纯F e3O4自身的表面惰性和高团聚,往往需要对其进行表面改性后再应用于固定化㊂R A N等制备了一种壳核结构的磁性纳米载体F e3O4@M o S2@P E I 用于漆酶固定㊂在二硫化钼(M o S2)和聚乙烯亚胺(P E I)的修饰下,磁性载体拥有较大的比表面积并减弱了自身团聚效应,对漆酶的负载量可达120m g/g,酶活回收率可达90%,同时对于水中持久性致癌有机污染物也表现出了良好的降解效率[55]㊂2.3.2介孔纳米载体介孔材料作为一种多孔材料,凭借多孔结构和大的比表面积,也是酶固定化的理想载体㊂金属有机框架(MO F s)[56]凭借着可调控的孔径和较大的比表面积在酶固定化方面得到广泛应用㊂L I等采用水热法合成氨基官能化的MO F材料制备固定化漆酶,在最优条件下实现了95%的刚果红去除率,6次循环后降解率仍达到84.63%[56]㊂L U等以酵母为生物模板,将Z I F-8自组装到酵母上得到杂合Y@ Z I F-8,再用交联剂固定过氧化物酶得到Y@Z I F-8 @t-C A T㊂固定化酶的温度㊁p H耐受性得到提高,更值得一提的是固定化酶在存储45d后活性仍保持在99%以上[57]㊂除此以外,T A N G等还制备了具有中空结构的共价有机骨架微球(H-C O F-OM e)[58]㊂这种孔缺陷的中空结构有助于加快反应物的扩散,从而改善催化反应过程,对四环素具有优秀的降解效果㊂2.3.3金属纳米载体金属纳米材料由于引入了金属离子,可以提高载体的理化性质,在酶固定化过程中表现出重要作用㊂F U等将F e3+/F e2+固定到纳米花形的共价有机框架(C O F)中实现了固定化酶的磁分离[59]㊂L I 等研究了以磁性F e3O4为核,将单宁酸(T A)与不同类型金属离子(C u㊁F e㊁Z n㊁M n㊁A u)配位获得了用于固定化的金属酚醛网络(M P N)涂层[60]㊂不同金属离子的不同极化能力对M P N涂层的亲水性和疏水性造成影响,从而给酶的固定化效率㊁催化活性78第1期潘虹,等:酶固定化技术的最新研究进展和稳定性带来影响㊂对于漆酶而言,引入C u2+对漆酶的活性中心具有正向的促进作用,可以大大提高固定化漆酶的催化活性和底物亲和力[61]㊂3结论与展望生物酶作为一种极具潜力的生物催化剂,通过固定化技术使其在污染物的降解㊁食品加工㊁生物传感器等诸多领域得到了广泛应用㊂酶固定化技术促使酶在较宽的p H值和温度范围下表现出更优良的催化活性,大大提高了生物酶在敏感环境下的稳定性,实现了生物酶的可分离性及循环使用性㊂但目前看来,酶固定化技术依然存在一些不足㊂1)酶在固定化后,由于载体的存在使得底物扩散受阻,无法与酶充分接触,导致酶活性降低㊂可以通过基因工程技术从酶本身出发,利用定点突变或基因重组改变酶结构来提高酶活㊂同时,通过掺杂合适的单一过渡金属离子或多金属离子协同作用激发酶活也值得深入研究㊂2)目前固定化酶技术在污染物降解等领域的实际应用已经颇为成熟,但对于更深层次的作用机制还停留在较为浅薄的层面㊂在未来,随着生物信息技术的不断发展,将固定化酶技术与计算机模拟技术交叉,利用计算机软件模拟分析更深层次的机制原理,可以更好地掌握酶固定化技术㊂3)酶固定化技术仍处在实验室研究阶段,在实现更大规模的工业化应用仍然存在较大的挑战㊂同时,考虑到有些固定化载体制备的时间成本和资金成本,载体若仅用于一次固定化后就无法回收再利用就会造成过度浪费㊂如何实现固定化酶失活后固定化载体与酶的高效分离,从而实现载体的循环使用是一个新的挑战㊂因此,酶固定化技术仍然处在不断发展进步的阶段,需要更多的科研者来完善研究㊂参考文献(R e f e r e n c e s)[1]刘茹,焦成瑾,杨玲娟,等.酶固定化研究进展[J].食品安全质量检测学报,2021,12(5):1861-1869.L I U R,J I A O C J,Y A N G L J,e t a l.A d v a n c e s o f e n-z y m e i mm o b i l i z a t i o n[J].J o u r n a l o f F o o d S a f e t y&Q u a l i t 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辣根过氧化物酶酶学特性及应用进展
形式下 ， 一些 键才 是 稳定 的 ， 这 是 通过 氢键 与 远 端
性（ Ｈ Ｒ Ｐ — Ｄ ， 一 Ｅ ） 含糖量较低 ， ｐ ， 值在 １ ０ ． ６ ＞ １ ２ 范围
内。 １ ９ ９ ０ 年Ｓ ｍｉ ｔ ｈ 等 最早 成 功研制 出重 组酶 ， 而 且 对 ＨＲ Ｐ — Ｃ的 结 构 和 功 能 研 究 有 了 重 大 的 进 展 。 １ ９ ９ ７ 年， Ｇ ａ ｊ ｈ ｅ ｄ ｅ 等 人 通 过 ｘ射 线 晶体 学 解 出 了 ＨＲ Ｐ的三 维结 构 ， ２ ０ ０ ２ 年 贝里 隆德 等嘲 人 描 述 出酶
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ４ － ０ ２ － １ ５
血红素 Ａ ｒ ｇ ３ ８ （ 远端精氨酸 ） 和Ｈ ｉ ｓ ４ ２ （ 远端组氨酸 ） 的氨 基酸 侧链 之 间 的相 互作 用 。２ 个 钙原 子 的结 合
位 点 分别 位 于血红 素 平面 的远 端 和近端 ， 并且 通 过 氢 键 被 连 接 到 血 红素 结 合 区 。每个 钙 原 子 结 合 位
Ａｕ ｇ ２ ０１ ４
文章编 号： １ ６ ７ ４ — ０ ８ ７ ４ ｆ ２ Ｏ １ ４ １ Ｏ ４ 一 （ ） ０ ３ ０ 一 Ｏ ５
辣 根 过 氧 化 物 酶 酶 学 特 性 及 应 用 进 展
张丽华 ， 蒋俊峰
（ 山 西 大 同大 学化 学与 环 境 工程 学院 ，山西 大 同 ０ ３ ７ ０ ０ ９ ）
催 化循环 的高分辨率 中间体 。Ｈ Ｒ Ｐ — Ｃ 含有 ２ 种不 同类 型 的金 属 中 心 ， 铁（ Ｉ Ｉ Ｉ ） 原卟啉 Ｉ Ｘ（ 通 常 被称 为
“ 血红 素 ” ） 和２ 个钙原 子 （ 图１ ， ２ ） 。
化物酶也是一种利用过氧化氢可 以氧化大多数有 机 物 和无机 物 的血 红素 酶 。 由于 其 比活性 高 、 耐 热 性高 、 酸碱稳定性好 ， 对污染物浓度和盐度都有较 高的耐受性 ， 与抗原 或抗体偶联后 ， 活性损 失很 少， 因此被广泛用于污水处理 、 食品工业 、 有机合 成 和分 析检测 等领 域 。本文介 绍 了 ＨＲ Ｐ的结 构 、 固 定化及其在各个领域 中的应用 ， 并对其应用前景进
固定化酶载体材料的研究进展
1 对固定化酶载体材料性能要求
存和操作稳定性，酶活性损失较小。
成性质稳定、生物相容性高、并且具有高强度、
由于固定化酶载体材料对酶的性质影响
2.2 合成有机高分子载体
适于工业化生产的固定化酶载体材料，仍然是
极大，因此，对载体材料的种类和性能要求十分
合成有机高分子材料由于其化学、物理性 固定化酶技术研究领域的重要课题。
天然多糖类化合物比较适合担当酶的载 PCVA 进行交联反应，得亲水性显著改善的球 学报，1998(2):66-68.
体材料，此类材料具有无毒，传质性能好和丰富 状载体，载体与胰蛋白酶进行偶联反应制备了 [5]潘丽军，陈实公，赵妍嫣.多孔淀粉接枝聚合
易的等特点，主要有壳聚糖、海藻酸钠和淀粉 固定化胰蛋白酶，该固定化酶的比活大幅提高。 物为载体固定化纤维素酶的研究[J].食品科学,
效果，近年来也有学者通过制备磁性壳聚糖微 程度提高。
球固定化酶，从而达到比较好的分离效果。如王
2.3 无机载体
[8]钱军民，李旭祥.HEC/SiO2 凝胶复合物包埋固 定化葡萄糖氧化酶的研究 [J]. 应用化学，2002,
斌等[3]利用反相总浮交联法制备磁性壳聚糖微
无机载体具有一些有机材料不具备的优 19(2)：153-157.
学等生命科学等领域的研究异常活跃，并得到 对酶有一定的保护作用，易接枝，并对酶热处理 丙烯酸羟乙酯的共聚体系中加人磁流体，制得
迅速发展和广泛的应用。在固定化酶技术中，载 一段时间后，酶的活力最大可提高 40%，这为 苯乙烯磁性微球，利用碳化二亚胺法固定中性
体材料的结构和性能对酶的活性保持及应用至 工业应用提供了一条新途径。例如，以淀粉接枝 蛋白酶，发现粒径越小，固定化酶的活性越高。
酶固定化技术的研究进展
酶分子 和交联试剂之 间 ，将不同的材料添加于交联体系 中， 再 加上一些不 同的交联 条件 ， 从而产生 固定 化酶 。交联法往往不 会独立存在 ， 通常作为其他 固定化方法 的辅助手段 。
包埋 法指 的是混 合载体 和酶溶液 ， 加入 一些引发 剂 ， 使 其
体 和固定化酶 ， 稳定性和重复使用性较好 ， 因此 ， 目前应 用 比较
广泛 。 但是 ， 这种方法有着剧烈的反应 ， 会严重损失 固定化酶的
活性 。
２ 新型酶固定化 方法
在 开发新型酶 固定化方法 时 ， 需 要遵循 以下原则 ： 在进 行 酶的固定化时 ， 需要在 比较 温和 的条 件下实现 ， 并且 在酶活 力 损失方面 ， 也需 要最 大限度地减少 ， 甚至避免 。 在制备高活性 固
１ 传统的酶 固定化方法
很 多的高度激发原 子、 分子 和离子等 ， 在 常温下存 在着大量 的
等离子体。等离子体可以自由修饰载体材料表面， 从而实现活
性基 团引入的 目的。Ｐ ｕ ｌ ｅ ｏ等将钛合金 Ｔ ｉ 一 ６ Ａ ｖ表面用丙 烯
传统 的酶 固定化 方法主要包括四个类型 ，分别是吸 附法 、
定化技术 ， 并且得 到了快速 的发展［ 】 】 。 酶 固定化技术指的是采用
离子体等 。ｔ Ｗ Ｃ ｓ 为辐射源 ， 利用射线在尼龙膜表 面共 聚 甲基丙 烯 酸甲酯接枝 ， 进一步活化 ， 就可以 固定青霉 素酚化酶。 光偶联 单 体聚合物包埋 具有光敏基 团载体 的共 价 固定 化酶或者普 通 的固定化酶 ， 在温和 的条件 下实现转 化 ， 因此获得 的 固定化 酶
其是使用 光敏性 和催化活性等等 ； 但是 ， 游离状态的酶对很多物质却有着较差 法是获得具有较高活力 固定化 酶的一种方法 ，
酶固定化载体的性能研究
酶固定化载体的性能研究摘要：固定化酶可以提高游离酶的稳定性，而且利于回收，能提高酶的循环利用率。
选择大孔吸附树脂HPD750和大孔离子交换树脂DK110两种填料作为载体，利用交联吸附法固定化括环酶，并对比酶液加入量、温度和固定化时间对两种载体的影响。
结果表明，吸附树脂最适固定化温度为35℃，离子交换树脂最适固定化温度为40℃。
对于固定化时间，吸附树脂固定6h时达到最大酶活，离子交换树脂在4h时达到最大酶活。
两种树脂在相同的酶液加入量时离子交换树脂的酶活更高。
经过比较，离子交换树脂的固定化效果最优。
关键词：扩环酶；树脂；固定化；酶活酶工程属于生物技术，是利用生物酶分子作催化剂，解决酶在化工、医药、轻工、能源、食品和环境工程等方面实际应用的相关技术[1]。
酶的催化作用具有专一性，催化效率高，可以在温和条件下进行反应，副产物少，具有很强的市场竞争力和发展前景[2]。
根据酶的使用形式不同，可以分为固定化酶和游离酶。
游离酶易溶于水,与底物作用面积大，反应充分，但是游离酶的稳定性差，在高温、酸碱和有机溶剂环境中容易失活，而且与底物难以分离，不能反复使用，不利于工业化生产[3]。
为了解决游离酶的缺陷，科研人员将酶固定在载体上以提高其稳定性，达到回收再使用的目的[4]。
酶固定化是将游离酶束缚在一定空间或一不溶性载体上，限制游离酶自由流动[5]。
酶固定后，与固定基质间相互作用可能会改变酶催化活性中心以外的空间结构，由此改善酶在强酸强碱、高温或有机溶剂中的稳定性，同时还可以从酶反应体系中分离目标产物[6]。
这样，固定化酶可通过简单的机械分离或离心被移除，从而不再需要使用复杂的透析等产物分析技术[7]。
酶固定化最大的优势在于可产生一种新的酶系统，该系统可在连续催化反应循环中重复使用，降低生产成本[8]。
固定化在抗生素产业的发展中起着关键作用，而载体的设计与及其固定化方法是固定化能否充分发挥其潜力并被广泛扩展应用范围的关键所在。
辣根过氧化物酶活性的电化学研究
辣根过氧化物酶活性 的电化学研究
张 四方 王春 涛 张 亚媛 安 小花
（ 原师范学院 化 学系， 太 山西 太 原 ０ ０ ３ ） ３ ０ １
［ 要 ］ 将 辣 根 过 氧 化 酶 固 定 在 铜 电 极 的 表 面 制 成 酶 电 极 ， 用 循 环 伏 安 法 从 ｐ 值 、 集 时 摘 利 Ｈ 富 间 、 ｚ Ｈ ０ 浓 度 三 方 面 寻 求 酶 活 性 的 最 佳 条 件 ， 出 ｐ 一 ６ ７ 富 集 时 闯 为 ２ ｉ 时 ， 的 活 性 最 得 Ｈ ． ， ５ｍ ｎ 酶
展 有 限 公 司 ） 邻 苯 二 胺 （ 津 市 光 复 精 细 化 工 研 究 所 ） ３ 的 双 氧 水 （ 津 市 大 毛 化 学 试 剂 厂 ） 同 浓 度 的 ； 天 ；０ 天 不
Ｈ 用 ３ ０ 采 ０％的双 氧水稀 释 而成 ， 的浓 度采 用 高锰 酸 钾法 标 定 ； 有试 剂 均 为分 析 纯 ， 验用 水 均 ＨＯ 所 实
第 ９卷 第 ４期 太 原 师 范 学 院 学 报 （ 然 科 学版 ） 自 ２１ ０ ０年 １ ２月 Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＴＡＩ ＹＵＡＮ ） Ｎ（ＲＭＡＩ ＵＮＩ ＶＥＲＳ ＴＹ （ ｔ ｒ ｌ ｃｅ ｃ ｉｏ ） Ｉ Ｎａ ｕ ａ Ｓ ｉｎ ｅＥｄｔ ｎ ｉ
Ｖｏ． Ｎ ． １９ ｏ ４ Ｄｅ ． ２ １ ｃ ００
大 ， Ｈ ） 且 （ 浓 度 在 １ ．０× １ ～ ４ ０× １ ｔ ｏｌ 之 间 呈 良 好 的 线 性 关 系． ０ ． ０ ｏ ／Ｉ
［ 键 词］ 关
辣 根 过 氧 化 物 酶 ； 的 活 性 ； 环 伏 安 法 酶 循
‘
［ 章 编 号 ］ １ ７ — ０ ７ ２ １ ） ４ ０ ０ 一４ ［ 图 分 类 号 ］ 文 ６ ２２ ２ （ ０ ０ ０ — １ ０Ｏ 中
共固定化辣根过氧化物酶的最新研究进展
ＧＬ ＯＤ，ｅ ｃ ｎ ｔ ｙ ｅ ｅｂ ｕ ，ｔ ｉｎ ｎ ，ａ ｉ ｎ ｅ ，ｗｈ ｃ ｒ ｏ － ｎ ｙ ｅ Ｉ ｄ ｉｉ ｎ ｔ ｅｐ ｏ ｐ ｃ ｓｏ ｈ ｐ ｌ ｔ ，ａ ｄ ｍｅ ｈ ｌｎ ｌ ｅ ｈ ｏ ｉ ｅ ｎ ｌ ｅ ｒ ｄ ｉ ｉｈ ａ ｅ ｎ ｎ ｅ ｚ ｍ ． ｎ ａ ｄ ｔ ， ｈ ｒ ｓ ｅ ｔ ｆｔ ｅ ａ ｐ ｉ ｏ — ｃ ｔ ｎ ｆｈ ｒ ｅ ａ ｉｈ ｐ ｒ ｘ ｄ ｓ Ｏ ｉ ａ ｉ ｓｏ ｏ ｓ ｒ ｄ ｓ ｅ ｏ ｉａ ｅ Ｃ —ｍｍｏ ｉ ｚ ｔ ｎ ｉ ｔ ｅ ｒ ａ ，ｓ ｃ ｓ ｏ ｇ ｎｃ ｓ ｎ ｈ ｓ ｓａ ｅ ｐ ｏ ｏ ｅ ． ｏ ｂ ｌ ａ ｉ ｎ ｏ ｈ ｒａ ｅ ｓ ｕ ｈ ａ ｒ ａ ｉ ｙ ｔ ｅ ｉ ｒ ｒ ｐ ｓ ｄ ｉ ｏ Ｋｅ ｒ ｓ ｙ ｗｏ ｄ ｈ ｒ ｅ ａ ｉｈ ｐ ｒ ｘ ｄ ｓ ，ｃ － ｏ ｓ ｒｄｓ ｅｏ ｉａｅ ｏｉ ｍｍｏ ｉ ｚ ｔ ｎ，ｅ ｚ ｅ ｅ ｇ ｎ ｅ ｉ ｇ ｂｌ ａ ｉ ｉ ｏ ｎ ｙ ｎ ｉ ｅ ｒｎ ｍ
１ １ ＨＲ ． Ｐ和 葡萄 糖 氧化 酶 的共 固定化
葡 萄糖 氧化 酶 （ （ ） Ｈ Ｐ共 固定是 最常 见 的共 固定 Ｇ） 和 Ｒ Ｄ 体 系 ， 们存 在着 如下 所示 的反 应偶 联 ： 它
ｂｏ ｒｎ ｆｒ ｔ ｎａ ｄ ｆｏ ｄ ｓｒ ｉｔａ ｓｏ ｍａｉ ｎ ｏ ｄ ｉ ｕ ｔｙ，ｅｃ ｏ ｎ ｔ．Ｃｕ ｒｎ ｌ ，ｔ ｅｒｓ ａｃ ｏ ｕ ｅ ｎ ｔｅｂｏ ｅ ｓ ｒａ ｅ．Ｔｈ ａｅ ｔ ｅ ｅｒ ｈ ｒｅ ｔｙ ｈ ｅ ｅ ｒｈｉ ｆ ｃ ｓ ｄｏ ｈ ｉｓ ｎ ｏ ｒａ ｓ ｅｌｔｓ ｓａ ｃ ｒ ｄ ｖ ｌｐ ｅ ｔ ｆｉ ｏ ｉ ｅ ｅｏ ｍ ｎ ｓｏ ｔ ｃ－ｍｍｏ ｉｚ ｔｏ ｔ ｎ ｙ ｒ ｕ ｓ ｂｌ ａ ｉｎｗｉｈｅ ｚ ｍｅａｅｓ ｍｍａ ｉｅ ，ｉｃｕ ｉｇ ｇｕ ｏ ｅｏ ｉａ ｅ ｈ ｌｓｅｏ ｘｄ ｓ ，Ｉ ｉ ｒｚ ｄ ｎ ｌｄｎ ｌ ｃ ｓ ｘｄ ｓ ，ｃ ｏｅ ｔｒ ｌ ｉａ ｅ ． ｏ －
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无机材料及复合材料等方面综述 了 ＨＲ Ｐ固定化载 体材料的 研究进展 。结果表 明 ， 体材料 的发展 能有效地 改善 固 载 定化酶的性能 ， 并在 扩大其应用范围的 同时还 可能带来 固定化 酶技 术上的突破 。
关 键 词 辣根过氧化物酶 固定化 导电聚合物 纳米 材料
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Ｒｅ ｅ ｒ ｈ Ｐｒ ｇ ｅ ｓ ｉ ｕ ｐ ｒ ａ ｅ ｉ ｌｆ ｒ Ｉ ｍ ｏ ｉｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｓ ａ ｃ ｏ ｒ ｓ ｎ Ｓ ｐ ｏ ｔＭ ｔ ｒ ａ ｏ ｍ ｂ ｌｚ ｔｏ ｆ
维普资讯
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４ ・ ６
材 料 导报
２０ ０ ７年 １ １月第 ２ 第 １ 期 １卷 １
辣 根 过 氧化 物 酶 固定化 载 体 材 料 的研 究进 展
左 鹏 ， 少明 ， 于 杨杰茹 ， 章臻 嵩， 张 迟
（ 肥工业大学化学工程学 院， 合 合肥 ２ ００ ） ３ ０ ９ 摘 要 酶 的 固定 化 是 酶 工程 领 域 的 一 个 重 要 分 支 ， 固 定 化 酶 的 性 能 在 很 大 程 度 上 取 决 于载 体 材 料 的 性 质 ， 而 因 此 研 制 开发 性 能 优 异 的 固定 化 载 体 材 料 成 为 了 固 定 化 酶 技 术 最 为 活 跃 的研 究 方 向 之 一 。辣 根 过 氧 化 物 酶 （ Ｐ 是 ＨＲ ）
Ａｂ ｔａ ｔ ｓｒ ｃ
Ｅ ｚ ｍｅｉ ｎ ｙ ｍｍｏ ｉｚ ｔ ｎｉ ｎ ｆｔ ｅｉ ｏ ｔｎ ｓ ｅ ｔ ｆｅ ｚ ｅｅ ｇｎ ｅｉｇ ｎ ｈ ｅ ｆｒ ｎ ｅ ｂｌ ａｉ ｓｏ ｅｏ ｈ ｍｐ ｒａ ｔａ ｐ ｃｓｏ ｎ ｙ ｎ ｉｅ ｒ ，ａ ｄ ｔｅｐ ｒｏｍａ ｃ ｉ ｏ ｍ ｎ
ｐ ｌ ｅ ，ｉ ｏ ｇ ｎ ｃｍａ ｒｘ ａ ｄ ｈ ｂ ｉ ｔ ｒａ． Ｔｈ ｄ ａ ｃ ｍｅ ｔｏ ｕ ｐ ｒ ｔ ｒａ ｓ ｃ ｕ ｄ ｅ ｈ ｎ ｅ ｔ ｅ ｐ ｒ ｏ ａ ｃ ｏ ｙ ｒ ｎ ｒ ａ ｉ ｔ ｉ ｎ ｙ ｒｄ ｍａ ｅ ｉ１ ｍ ｅ ａ ｖ ｎ ｅ ｎ ｆ ｓ ｐ ｏ ｔｍ ｅ ｉｌ ｏ ｌ ｎ ａ ｃ ｈ ｅ ｆ ｒ ｎ ｅ ａ ｍ ｏ ｈ ｍｍｏ ｉ ｚ ｄ ｅ ｙ ｅ ｎ ａ ｇ ｈ ｉ ａ ｐ ｉａ ｉ ｎ ｆ ｌ ｓ ａ ｄ ｐ ｓ ｉ ｌ ｒｎ ｒ ａ ｔ ｒ ｕ ｈ ｉ ｈ ｎ ｙ ｅ ｉ ｆｔｅｉ ｂ ｌ ｅ ｎ ｍ ，ｅ ｌｒ ｅ ｔ ｅｒ ｐ ｌ ｔｏ ｉ ｄ ｎ ｏ ｓｂ ｙ ｂ ｉ ｇ ｂ ｅ ｋ ｈ ｏ ｇ ｎ ｔ ｅ ｅ ｚ ｉ ｚ ｃ ｅ ｍ ｍｍｏ ｉｚ — ｂｌ ａ ｉ
一
类在 生物传感 器、 有机合 成和废 水处理等领域 有着广泛应用的酶制剂 。人 们对其 固定化 进行 了大量的研 究， 取得 了
丰硕的成果 ， 开发 出 了许 多性 能 优 异 的 载体 材 料 。 结合 固 定化 ＨＲ 的应 用 ， 天 然 高分 子 材 料 、 成 高 分 子 聚 合 物 、 Ｐ 从 合
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