一个新的二色补血草金属硫蛋白基因LbMT2的克隆及其表达分析
小金海棠金属硫蛋白基因MxMT2克隆与生物信息学分析
ｂ ｉｅｅ ｔ ｌｓｒｅ ｉｇ ｏ ｈ ｕ ｔ ｃｅ ＤＮ ｉｒｒ ｒｍ Ｍａｕ ｉｏｉｅ ｓ ｈ ｎ ｔＪａ ｇ ｗ ｉｈ ｗ ｓｎ ｍｅ ｙ ｄｆ ｒｎｉ ｃｅ ｎｎ ｆｔｅ ｓ ｂｒ ｔｄ ｃ Ａ ｌ ａｙ ｆ ｌｓｘａｊ ｎｉ Ｃ ｅ ｇ ｅ ｉｎ ， ｈｃ ａ ａ ｄ ｆ ａ ａ ｂ ｏ ｎ ｓ
（ ． 岛农 业 大 学 园林 园艺 学 院 ， 东 青 岛 １青 山 ２ ６０ ２ 中 国农 业 大 学 园艺 植 物 研 究 所 ， 京 ６ １９；． 北 １０ ９ ） ０ １３
摘 要 ： 苹 果 属植 物 小 金 海 棠 （ ｌｓ ｉｏｎｎｉＣ ｅｇｅ Ｊ ｎ ） 试 材 ， 差 异 筛 选 消 减 ｃ Ｎ 文 库 得 到 的 ２ 以 Ｍａｕ ａｆ ｅｓ ｈｎ ｔ ｉ ｇ 为 ｘ ｓ ａ 将 ＤＡ ７个 金 属硫 蛋 白 ｃ Ｎ 片段 序 列 构 建 成 本 地数 据 库 ， 过 电 子 拼 接 和 Ｒ －Ｃ 相结 合 的方 法 ， 离 到 了 小 金 海 棠 金 属 硫 蛋 Ｄ Ａ 通 ＴＰ Ｒ 分
（ ． ｏ ｅｅｏ ｏｔ ｕｔ ｅ ＱｎｄｏＡ ｒ ｕｔｒ ｎｖｒ ｔ， ｉ ｄｏ ２６ ０ ， ｈｎ ； １Ｃ ｌ ｇ ｆ ｒｃ ｌ ｒ ， ｉｇａ ｇｉ ｌ ａ Ｕ ｉｅ ｉ Ｑ ｎ ａ ６ １９ Ｃ ｉａ ｌ Ｈ ｉ ｕ ｃ ｕ ｌ ｓｙ ｇ
２ Ｉｓｔｔ ｆ ｏ ｉ ｌ ｒ ｌｎｓＣ ｉａＡ ｒ ｕ ｕａ Ｕ ｉ ｒｔ， ｅ ｉｇ １０９ ，ｈｎ ） ．ｎｔｕｅ ｏ Ｈ ｒｃ ｔ ａ Ｐａ ｔ，ｈｎ ｇ ｃ ｌ ｒｌ ｎｖ ｓｙ Ｂ ｉｎ ０ １３ Ｃ ｉ ｉ ｒ ｔ ｕｕ ｌ ｉ ｔ ｅｉ ｊ ａ
ｔｅｃｎｅ ｅ ｏ ａ ｓ ｈ ｒ ｌｋ ｏ ｎＭ ， ｈｃ ａ ４Ｃ ｓ ｓ ｕ ｓｃ ｓｔａ ｈｖ ｏｓｒ ｄｓｑ ｅ ｃ ｏｉｏ ｈ ｏｓｒ ｄｄｍ ｉ ａｅ ｉ ａ ｎｗ Ｔ ｗ ｉ ｈ ｓ ｙｒ ｉ ｅ（ ｙ）ｈｔ ａｅｃｎｅｖ ｅｕ ｎｅｐｓ ｉ ｖ ｎ ｓ ｄｎ ｌ ｈ １ ｅｄ ｅ ｔｎ
二色补血草中2个金属硫蛋白基因的克隆及分析
ｐ ｇ ＷａｇＹ ｃｅｇ ＷａｇＢｎｆ ｇ Ｓ ｈｏ ｏ ｏｅｔ ，Ｎ ｒ ｅｓ Ｆ ｒｓ ｎｖｒｔ，Ｈａ ｉ １０４ ，Ｐ ． Ｃ ｉ ｉ ， ｎ ｕ ｈｎ ， ｎ ｉ ｅ （ ｃｏｌ ｆＦｒｓ ｙ ｏｔ ａｔ ｏ ｔ Ｕ ｉ ｓ ｙ ｎ ｇｎ ｒ ｈ ｅｒ ｙ ｅｉ ｒ ｎ ０ ０ ．Ｒ ｂ ５ ｈ—
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第 ３ ５卷 第 ８期 ２０
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Ｖｏ ． Ｎｏ． １３５ ８
Ａｕ ｇ． ２ ０７ ０
Ｊ ＯＵＲＮ ＯＲＴ ＡＬ ＯＦ Ｎ ＨＥＡ Ｔ Ｆ Ｓ ＯＲＥ Ｔ Ｓ ＲＹ ＵＮＩ Ｒ Ｉ Ｙ ＶＥ Ｓ Ｔ
１ｃ ｌｒ ｗｅ【ｈ ｆｅ ｏ ｉ ｒ ｔｉ ｓ ８ ０ ｗｉｈ ｔ ｅ ｉｏ ｌｃｒｃ ｐ ｉ ｆ５． ｅ ｕ ａ ｉ ｔｏ ｎｃ ｎｇ ｐ ｅ ｎ ｉ ０ ０ ｔ ｈ ｓ ｅｃ ｔｉ ｏｎｔｏ ０． Ｂｏｈ ＬｂＭ Ｔ１ ｎ ｄ Ｌｂ ７ ａ ｅ １ Ｃｙ ｒ ｓｄ ｅｓ ｇ ｄ ｏ ｔ ａ Ｍ ２ ｈ ｖ ４ ｓｅ ｉ ｕ
Ｉ Ｔ１ ｇ ｎ ｓ５ ９ ｂ ｎ ｌｎｇｈ．ｉ ｌ ｄｉｇ ２ ｐ ｏ ｕ ｒ ｎ ｌｔｄ ｒｇ ｏ ｄ ３ ０ ｆ３ ｕ ｔａ ｌｔ ｄ ｒ ｇｏ ｅ ｅ ｉ ６ ｐ ｉ ｅ ｔ ｎｃｕ ｎ ３ ｂ ｆ５ ｎｔａ ｓａｅ ｅ ｉｎ ａ ０ ｂｐ ｏ ｎ ｒｎｓａｅ ｅ ｉｎ． Ｉ ａ ｎ ｎ ｔｈ ａ ｓ
二 色补 血 草 中 ２个 金属 硫 蛋 白基 因 的克 隆及 分 析 ’
李 红 艳 杨 传 平 王 玉 成 王 丙锋
（ 林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室 （ 东北林业大学）， 尔滨 ，５０ ０ 哈 １０ ４ ）
摘 要 从二 色补血草 中分 离出２个金属硫 蛋 白基 因的 ｃ Ｎ 全序 列， ＤＡ 分别命 名为 Ｌ ｎ 和 Ｌ ＭＴ 。Ｌ ｎ ｂ ｂ ２ ｂ 全 长 为 ５９ｂ ， 中 ５非 编码 区 ２ ｐ３非 编 码 区 ３０ｂ ， 放读 码框 （ Ｒ ） ２６ｂ ， 码 含 ８ 个 氨 基 酸 的蛋 白 ， ６ ｐ 其 ３ｂ ， ０ ｐ 开 Ｏ Ｆ 长 ４ ｐ 编 １ 相 对 分子 质 量 为 ８７ ， 电点 为 ４ ７ Ｌ Ｍ／ 全 长 为 ５ ３ ｐ 其 中 ５非 编码 区 ６ ｐ３非 编 码 区 ２６ ｐ 开放 读 码 框 长 ２ ００ 等 、 ；ｂ ２ ２ ， ｂ ｌ ， ｂ １ ， ｂ ６ ４ ｂ， ｐ 编码 ８ 个氨基 酸， １ 编码蛋 白的相对分子质量为 ８０ ， 电点为 ５ ０ ００ 等 ． 。这 ２个基 因编码的氨基 酸都含有 ｌ ４个半胱 氨 酸 Ｃ ｓ 分布 在 蛋 白质 的 Ｎ 端和 ｃ端 ， Ｃ Ｃ Ｃ和 Ｃ Ｘ ｙ， 呈 Ｃ、Ｘ Ｘ Ｃ形 式排 列 。疏 水性 分析 表 明 ： ２个蛋 白都 存在 ３ ４ 这 ５— ８ 个氨 基 酸之 间较 强 的疏 水 区。 通过 对 多种 植 物 的 ＭＴ蛋 白序 列 比 对 分析 表 明 ， 属 硫 蛋 白家 族 在 氨 基 酸 数 目上 保 守 金 性 差 ， 半胱 氨 酸 残基 （ ｙ） 但 Ｃ ｓ 的位 置 和数 目保 守性 达 到 １０ ， 示 了 Ｃ ｓ 金 属 硫 蛋 白 的功 能 十 分 重要 。 这 ２个基 ０％ 揭 ｙ对 因 已经在 Ｇ ｎ ａｋ上 注 册 ，ｂ ｅ ｂｎ Ｌ ｎ 基 因的 登 录 号 为 Ｅ １３ ７ ，ｂ ２ 基 因 的 Ｇ ｎ ａｋ登 录号 为 Ｅ １３７ 。 Ｆ０ ５４ Ｌ Ｍ／ ｅ ｂｎ Ｆ０ ５５ 关 键 词 二 色补 血 草 ； 因克 隆 ； 属 硫 蛋 白 基 金 分 类 号 Ｑ ８ ７５
二色补血草硫氧还蛋白(Trx)的克隆和表达分析
论等 电点（Ｉ为 ９６ Ｂ ａｔ ｐ） ． ８ ｌｓ Ｐ分析表 明二 色补血草
与拟 南芥 序 列 同源性为 ５ ％，与葡萄 序列 同源性为 ７ ％，从 ２ ６
ｌ 个物种 的氨基 酸多序 列比对可 以看 出Ｔ ｘ氨基 酸序 列保 守性较 高。实时定量 Ｒ ．Ｃ １ ｒ Ｔ Ｐ Ｒ方法检测低温、Ｎａ １ Ｐ Ｇ胁迫 Ｃ和 Ｅ 不同时间后的基 因在二 色补血草 中表达模式 的结果表明 ，Ｎ Ｃ 能诱导 Ｔｘ基 因在二 色补血草叶 中表 达 ，胁迫 ２ ａ１ ｒ ４ｈ后达到 高峰 ，而聚 乙二 醇和低温 处理 则抑 制 Ｔｘ ｒ 在二 色补血 草根 和叶 的表 达。 关键 词：二 色补血草 ；硫 氧还蛋 白；基 因克隆 ；实时荧光定量 Ｐ Ｒ Ｃ
ｕ ｔａ —ｌｔｄｒ ｇｏ ．ｔ ａ ｎｏ ｅ ａ ｉｇｆａ ｎ ｎ ｓａｅ ｉｎ Ｉ ｈ ｄａ ｐ ｎｒ ｄｎ ｒｍｅ（ ）ｏ ９ ｐａ ｄｅ ｃ ｄ ｄａｐ ｏｅｎｗｉ ６ ｍｉｏａ ｉ ｒ ｅ ｅ ＯＩ ｆ ８ｂ ｎ ｏ ｅ ｒｔｉ ｔ ２ ５ａ ｎ ｃｄ ７ ｎ ｈ
１ ０ ０．Ｃｈｉ ５０ ４ ｎａ
Ａｂｓ ｒ ｔ ｔ ａｃ ：Ｔｈｅｆ ｌｌｎ ｈ ｃ ｕｌ ｅ ｇｔ ＤＮＡ ｆａｎ ｅ ｈｉ ｒ ｄ ｉ ｓｃ ｏ ｅ ｒ ｍ ｍｏｎ ｕ ｂ ｃ ｌ ｒｃ ｏ ｏｖ ｌ ｏ ｅ ｏｘ ｎ ｗａ ｌ ｎ ｄ ｆｏ Ｌｉ ｔ ｉ ｍ ｉ ｏ ｏ ＤＮＡ ｉ ａ ｙ． ｅ ｌｂｒ ｒ Ｔ ｈ ｓ ｑ ｎｃ ｏ ｅ ｏｘ ｎ ｗａ ３８ ｂ ｎ ｌ ｎｇ ｈ， ｎｃ ｕ ｉ ２ ｆ５ ｕ ｒ ｎｓａ ｅ ｅ ｉ ｎｄ ２１ ’ ｅ ｕｅ ｅ ｏｆｔ ｒ ｄ ｉ ｓ １１ ｐ ｉ ｅ ｔ ｉ ｌ ｄ ｎｇ １ ８ ｂｐ Ｏ ’ ｎｔａ ｌ ｔ ｄ ｒ ｇ ｏｎ ａ ２ ｂｐ Ｏｆ３ ｈｉ
二色补血草LbGST基因的原核表达载体构建与表达
刁桂萍 刘彬令 雷作霖 郭荫久 王玉成
（ 东北林业 大学 ， 哈尔滨 ，５ ００ １０４ ）
摘 要 从二 色补 血草 （ ｉｏ ｉｍ ｂ ｏ ｒ 中分 离出一个 编码谷 胱甘肽硫转 移酶 （ ｂ Ｓ ） 因 ， Ｌｍ ｎ ｉ ｌ ） ｕ ｃｏ ＬＧ Ｔ 基 并将该 基 因构 建到 ｐ Ｅ ４ － Ｇ Ｘ一 Ｔ ２原核表 达载体 ， 转入 大肠杆 菌（ ｓ ｅｉ ｉ ｌ Ｂ２１中， 用 Ｏ １ｍ ｏ Ｌ的 ＩＴ Ｅｃ ｒｈ ｃ ｉ Ｉ ｈ ｃａ ｏ ） 利 ． ｍ ｌ ／ Ｐ Ｇ诱 导该基 因在 大肠杆 茵 Ｂ ２ Ｌ １中进行表 达。Ｓ Ｓ Ｐ Ｇ Ｄ — Ａ Ｅ检测表 明， 出现 了特 异 的分子 量为 ５ Ｄ 左 右的融合 蛋 白， 明该基 因 Ｏｋ ａ 说 在大肠杆菌 中成功表达 ， 该基 因的成功表达为分 离纯化 Ｌ Ｇ Ｔ蛋 白并研 究其 功能奠定 了基 础。 ｂＳ 关键词 二 色补血草 ； 谷胱甘肽硫转移酶 ； 原核表 达
中华补血草金属硫蛋白基因的克隆及高盐处理下的表达模式分析
ｈ 利 用半 定量 一Ｐ Ｒ技 术 对该基 因在 盐胁迫 下表 达模 式的 分析表 明 ， ３ Ｎ Ｃ 处理条 ， Ｃ 在 ％ ａ１ 件 下 ， 着盐 处理 处理 时 间的 延 长该基 因的表 达 量逐 渐 升 高 ， 盐处理 ４ 随 在 ８ｈ时表 达 量 最
高， 之后 其表 达 量 出现 下 降．
的质量 ． １ｇ 用 ｔ ｇ的中华补 血草 总 Ｒ Ａ用 于 ｃ Ｎ Ｎ ＤＡ
（ 台 大学 化 学 生 物 理 工 学 院 ， 烟 山东 烟 台 ２４ ０ ） ６ ０ ５
摘要 ：以中华补 血草 叶 片为材 料 ， 取 其 总 Ｒ Ａ 并反 转 录 ｃ Ｎ 并 以 ｃ Ｎ 提 Ｎ Ｄ Ａ， Ｄ Ａ为 模 板 ， 克 隆得 到 包含该 基 因完整 开 放 阅读框 的 ｃ Ｎ Ｄ Ａ序 列 ， 列 分 析表 明 ， 基 因开 放 阅读 框 长 序 该
助 项 目（ Ｙ ７ １ ） Ｈ ０ Ｂ６ ．
作者简介 ： 刘瑜 （９２ ） 女 ， １８ 一 ， 山东蓬莱人 ， 硕士研究生 ， 研究方 向： 植物发育分子生物学 ； 通信作者 ： 陈世华 （ｓ － ｎａ ｃｈｙ ｔ ａ ｉ ＠ １３ ｃｍ） 博士 ， ６ ．ｏ ， 副教授 ； 郭善利 （ｓ＠ｙｕ ｅｕ ｃ ） 博士 ， ｇｌ ｔ． ｄ ．ｎ ， 教授．
收 稿 日期 ： ０ ０ １—０ ２ １—２ １
（Ｌｍ ｎｕ ） ｉ ｏ ｉｍ 多年 生 泌 盐 草 本 植 物 ． 植 物 可 该
以使 盐土脱 盐 ， 改善 土壤 结构 ， 被誉 为盐 碱地 改造
的” 锋植 物 ” 本研 究从 中华 补 血草 中克 隆 出 了 先 ． 金 属硫 蛋 白基 因 ， 对该 基 因进 行 了序 列 分析 和功 能预测 ， 并分 析 了该基 因在 ３ Ｎ Ｃ 高盐 胁 迫 下 ％ ａＩ 的表达 模 式 ， 为研 究 中华 补 血 草 ＭＴ参 与 的盐 胁 迫 相关 生理 过程及 分 子应答 机 制打 下 良好 基础 ．
两个菜心CBL基因的克隆、生物信息学分析及其表达特性分析
㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(７):１~９ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０７.００１收稿日期:２０２２－１０－１７基金项目:国家自然科学基金项目(３２２０２４６５)ꎻ广东省自然科学基金项目(２０１９Ａ１５１５０１１６８０)ꎻ韶关市科技攻关项目(２００８１０２２４５３７５３５)ꎻ韶关学院博士科研启动项目(９９０００６１３)作者简介:朱云娜(１９８２ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ讲师ꎬ主要从事蔬菜生理与分子生物学研究工作ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｚｈｕｙｎ３２６＠１２６.ｃｏｍ通信作者:刘建国(１９８１ )ꎬ男ꎬ博士研究生ꎬ助理实验师ꎬ主要从事园艺生理生态研究工作ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｊｇｌｉｕ＠ｓｇｕ.ｅｄｕ.ｃｎ两个菜心ＣＢＬ基因的克隆、生物信息学分析及其表达特性分析朱云娜１ꎬ２ꎬ符质２ꎬ冯慧敏１ꎬ２ꎬ王斌１ꎬ２ꎬ沈雪晴２ꎬ汤婉君２ꎬ刘建国１ꎬ２(１.广东省粤北食药资源利用与保护重点实验室ꎬ广东韶关㊀５１２００５ꎻ２.韶关学院英东生物与农业学院ꎬ广东韶关㊀５１２００５)㊀㊀摘要:本研究以 油绿５０１ 菜心(ＢｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＬ.ｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ.ｕｔｉｌｉｓＴｓｅｎｅｔＬｅｅ)为材料ꎬ采用同源克隆方法对其ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９基因进行克隆ꎬ运用ＤＮＡＭＡＮ和ＭＥＧＡ软件对其编码蛋白序列进行同源性分析和系统进化分析ꎬ并利用ｑＲＴ－ＰＣＲ技术分析二者在菜心组织中及不同氮素形态条件下的表达模式ꎮ结果表明:菜心ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９基因的ｃＤＮＡ全长均为６４２ｂｐꎬ编码２１３个氨基酸ꎬ分别命名为ＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９ꎬ具有ＣＢＬ蛋白结合Ｃａ２＋所必需的ＥＦ－ｈａｎｄ型结构域(ＥＦｈ)ꎮＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９编码的氨基酸序列与拟南芥(Ａｒａｂｉ￣ｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)㊁大白菜(Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ)等物种的同源性均达９５％以上ꎻ二者分别与大白菜的ＢｒＣＢＬ１㊁ＢｒＣＢＬ９遗传距离最近ꎬ并与拟南芥ＡｔＣＢＬ１㊁ＡｔＣＢＬ９共同聚类为一支ꎮＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９在菜心各组织器官中均有表达ꎬ前者在菜心叶片中表达水平较高ꎬ后者在菜心荚果等组织中表达水平较高ꎻ两者表达受氮素形态及水平影响ꎬ前者在低浓度ＮＯ－３或ＮＨ＋４处理后上调表达ꎬ后者表达随ＮＨ＋４浓度增加而上调表达ꎮ该研究结果可为进一步研究菜心ＣＢＬ１和ＣＢＬ９在氮素吸收利用过程中的功能及其调控机制提供一定理论基础ꎮ关键词:菜心ꎻ氮素形态ꎻ类钙调磷酸酶Ｂ亚基蛋白ꎻ基因克隆ꎻ生物信息学分析ꎻ表达分析中图分类号:Ｓ６３４.９:Ｑ７８１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０７－０００１－０９ＣｌｏｎｉｎｇꎬＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＴｗｏＣＢＬＧｅｎｅｓｉｎＦｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅＣａｂｂａｇｅＺｈｕＹｕｎｎａ１ꎬ２ꎬＦｕＺｈｉ２ꎬＦｅｎｇＨｕｉｍｉｎ１ꎬ２ꎬＷａｎｇＢｉｎ１ꎬ２ꎬＳｈｅｎＸｕｅｑｉｎｇ２ꎬＴａｎｇＷａｎｊｕｎ２ꎬＬｉｕＪｉａｎｇｕｏ１ꎬ２(１.ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆＦｏｏｄａｎｄＭｅｄｉｃｉｎａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓｉｎＮｏｒｔｈｅｒｎＲｅｇｉｏｎꎬＳｈａｏｇｕａｎ５１２００５ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＨｅｎｒｙＦｏｋＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＳｈａｏｇｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｏｇｕａｎ５１２００５ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅＣＢＬ１ａｎｄＣＢＬ９ｇｅｎｅｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｂｙｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｃｌｏｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｆｒｏｍｆｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅ(ＢｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＬ.ｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ.ｕｔｉｌｉｓＴｓｅｎｅｔＬｅｅ)ｖａｒｉｅｔｙ Ｙｏｕｌü５０１ ꎬｗｈｏｓｅｈｏｍｏｌｏｇｙａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇＤＮＡＭＡＮａｎｄＭＥＧＡｓｏｆｔｗａｒｅ.ＡｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｔｈｅｔｗｏＣＢＬｇｅｎｅｓｉｎｔｉｓｓｕｅｓｏｆｆｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅａｎｄｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｎｉｔｒｏｇｅｎｆｏｒｍｓｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｑＲＴ￣ＰＣＲｍｅｔｈｏｄ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＣＢＬ１ａｎｄＣＢＬ９ｇｅｎｅｓｗｅｒｅｂｏｔｈ６４２ｂｐꎬｗｈｉｃｈｅｎｃｏｄｅｄ２１３ａｍｉｎｏａｃｉｄｓａｎｄｎａｍｅｄＢｃＣＢＬ１ａｎｄＢｃＣＢＬ９ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＢｏｔｈｔｈｅｔｗｏＣＢＬｇｅｎｅｓｐｏｓｓｅｓｓｅｄＥＦ￣ｈａｎｄｄｏｍａｉｎ(ＥＦｈ)ꎬｗｈｉｃｈｗａｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｆｏｒＣＢＬｐｒｏｔｅｉｎｔｏｂｉｎｄＣａ２＋.ＨｏｍｏｌｏｇｙａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｔｗｏＣＢＬｇｅｎｅｓｏｆｆｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅｗｉｔｈｔｈｏｓｅｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａａｎｄＢｒａｓｓｉｃａｒａｐａｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎ９５％.Ａｃ￣ｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓꎬｉｔｗａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔＢｃＣＢＬ１ａｎｄＢｃＣＢＬ９ｗｅｒｅｔｈｅｍｏｓｔｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈＢｒＣＢＬ１ａｎｄＢｒＣＢＬ９ｏｆＢ.ｒａｐａꎬａｎｄｃｌｕｓｔｅｒｅｄｉｎｔｏｔｈｅｓａｍｅｂｒａｎｃｈｗｉｔｈＡｔＣＢＬ１ａｎｄＡｔＣＢＬ９ｏｆＡ.ｔｈａｌｉａｎａꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｑＲＴ￣ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓꎬｉｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＢｃＣＢＬ１ａｎｄＢｃＣＢＬ９ｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆｆｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅꎬＢｃＣＢＬ１ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｈｉｇｈｅｒｉｎｌｅａｖｅｓａｎｄＢｃＣＢＬ９ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｈｉｇｈｅｒｉｎｐｏｄｓ.ＩｎａｄｄｉｔｉｏｎꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＢｃＣＢＬ１ａｎｄＢｃＣＢＬ９ｗｅｒｅａｆｆｅｃｔ￣ｅｄｂｙｔｈｅｆｏｒｍｓａｎｄｌｅｖｅｌｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎ.ＢｃＣＢＬ１ｗａｓｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄａｔｔｈｅｌｏｗｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＮＯ－３ｏｒＮＨ＋４ꎬｗｈｉｌｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢｃＣＢＬ９ｗａｓｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｏｆＮＨ＋４.Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｐｒｏ￣ｖｉｄｅｄｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｅｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＣＢＬ１ａｎｄＣＢＬ９ｏｆｆｌｏｗ￣ｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｕｐｔａｋｅａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＦｌｏｗｅｒｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅｃａｂｂａｇｅꎻＮｉｔｒｏｇｅｎｆｏｒｍｓꎻＣａｌｃｉｎｅｕｒｉｎＢ￣ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎꎻＧｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇꎻＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓꎻＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ㊀㊀钙作为第二信使在植物信号转导中具有重要调控作用[１ꎬ２]ꎮ钙调蛋白(ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎꎬＣａＭ)㊁类钙调蛋白(ＣａＭ－ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎꎬＣＭＬ)㊁类钙调磷酸酶Ｂ亚基蛋白(ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎＢ－ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎꎬＣＢＬ)和钙依赖型蛋白激酶(Ｃａ２＋－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅꎬＣＤ￣ＰＫ)是植物体内常见的钙感受器种类[３ꎬ４]ꎮ除ＣＤＰＫ中含有蛋白激酶结构域外ꎬ其他３个钙感受器都不含激酶结构域ꎬ必须与靶蛋白结合形成复合体才能传递钙信号[４ꎬ５]ꎮＣＢＬ起源于绿藻和苔藓ꎬ现广泛存在于被子植物和裸子植物中ꎬ是一种古老的钙感受器[６]ꎬ具有典型的结合Ｃａ２＋结构域 ＥＦ手臂(ＥＦ￣ｈａｎｄ)[１]ꎮ类钙调磷酸酶Ｂ亚基蛋白激酶(ＣＢＬｓ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓꎬＣＩＰＫ)是ＣＢＬ特异结合的蛋白激酶ꎬ通过形成ＣＢＬ－ＣＩＰＫ复合体参与调控植物生长发育和非生物胁迫响应[１ꎬ４ꎬ５]ꎮ不同植物ＣＢＬ成员数量不同ꎬ拟南芥[１ꎬ７]㊁烟草[８]㊁黄瓜[９]㊁大白菜[１０]中分别有１０㊁２０㊁６㊁１３个ＣＢＬｓ成员ꎮ植物ＣＢＬｓ参与种子发芽㊁花粉管萌发等生长发育过程[１ꎬ２]ꎬ也参与响应高盐㊁低温㊁干旱等逆境胁迫[１ꎬ４ꎬ１１－１３]ꎮＣＩＰＫ２３在调控矿质营养转运蛋白方面具有重要作用[１ꎬ４ꎬ１１－１４]ꎮ低钾胁迫下ꎬＡｔＣＢＬ１/ＡｔＣＢＬ９可将ＡｔＣＩＰＫ２３定位到质膜ꎬ使其通过磷酸化激活钾离子通道蛋白(ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＫ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１ꎬＡＫＴ１)ꎬ从而增加拟南芥细胞对Ｋ＋的吸收[１５]ꎮ近年来的研究表明ꎬ水稻早期氮响应因子在蛋白质磷酸化等方面富集[１６]ꎬ而氮转运蛋白活性也依赖于外界氮信号所触发的磷酸化[１７]ꎬ因此ꎬ蛋白磷酸化在氮信号传导㊁氮代谢方面发挥重要作用ꎮ如:ＣＢＬ－ＣＩＰＫ复合体通过调控氮转运蛋白磷酸化水平调控拟南芥氮信号通路[１８－２０]ꎻＡｔＣＢＬ１/９－ＡｔＣＩＰＫ２３通过磷酸化修饰ꎬ调控拟南芥硝态氮转运蛋白(ｎｉｔｒａｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１.１ꎬＮＲＴ１.１)亲和性的转变ꎬ以适应不同浓度硝酸盐(ＮＯ－３)条件下对ＮＯ－３的吸收[１８]ꎻ在高铵(ＮＨ＋４)胁迫下ꎬＡｔＣＢＬ１－ＡｔＣＩＰＫ２３可调控铵态氮转运蛋白(ａｍｍｏｎｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒꎬＡＭＴ)ＡＭＴ１.１和ＡＭＴ１.２的磷酸化ꎬ使其失去活性ꎬ避免吸收过量ＮＨ＋４[１９ꎬ２１]ꎮ我们最近研究发现ꎬ菜心铵转运蛋白ＢｃＡＭＴ１ｓ可与ＣＩＰＫ２３互作[２２]ꎬ菜心ＣＩＰＫ２３表达受氮素水平和氮素形态的影响(待发表)ꎮ不同ＣＢＬｓ可能参与同一种非生物胁迫ꎬ相同ＣＢＬ可能参与不同非生物胁迫响应[１]ꎮ为此ꎬ本文选择可与ＣＩＰＫ２３互作的ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９为研究对象ꎬ采用同源克隆法获得菜心ＣＢＬ１和ＣＢＬ９的全长序列ꎬ并分析其生物学特性㊁组织表达特性以及对不同氮素形态的响应ꎬ以期为提高菜心氮素吸收利用的作用机理研究提供一定的理论支撑ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料及样品处理供试菜心(ＢｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＬ.ｓｓｐ.ｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ.ｕｔｉｌｉｓＴｓｅｎｅｔＬｅｅ)品种为 油绿５０１ (由广州市农业科学研究院选育)ꎬ于２０２１年３ ５月在广东省韶关市韶关学院英东生物与农业学院生态园玻璃温室内培养ꎮ将菜心种子用７.５％的ＮａＣｌＯ消毒１０ｍｉｎꎬ用无菌水清洗４~５次ꎬ然后播种于海绵块上进行育苗ꎬ待幼苗长至三叶一心时移植到改良霍格兰营养液中进行培养ꎮ之后根据不同２㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀试验要求进行处理㊁取样ꎮ１.１.１㊀基因表达组织特异性分析的样品采集㊀菜心幼苗移栽后生长３０~４０ｄꎬ待角果结荚后ꎬ分别取根㊁茎㊁叶㊁花㊁叶柄㊁荚果㊁花蕾㊁薹茎等组织样品ꎬ用于基因表达的组织特异性分析ꎮ每个样品设３个生物学重复ꎬ每重复取４~６株ꎬ液氮速冻后保存在－８０ħ冰箱中备用ꎮ１.１.２㊀不同水平氮素处理试验的样品处理㊀菜心移苗后在１个剂量的改良霍格兰营养液中培养４ｄꎬ取出用蒸馏水冲洗根部ꎬ然后转移到缺氮营养液中再培养４ｄꎬ将菜心苗分苗移栽到１㊁４㊁８ｍｍｏｌ/ＬＮＨ４Ｃｌ/ＮａＮＯ３营养液中处理２ｈꎬ分别对叶片和根系进行取样ꎬ每个样品设３个生物学重复ꎬ每重复取４~６株ꎬ液氮速冻后置于－８０ħ冰箱保存备用ꎮ１.２㊀总ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ合成采用Ｅａｓｔｅｐ®Ｓｕｐｅｒ植物总ＲＮＡ提取试剂盒[普洛麦格(北京)生物技术有限公司]提取总ＲＮＡꎬ采用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴｒｅａｇｅｎｔＫｉｔｗｉｔｈｇＤＮＡＥｒａｓｅｒ试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]反转录合成ｃＤＮＡꎮ１.３㊀菜心ＣＢＬｓ基因克隆在ＮＣＢＩ数据库(ｈｔｔｐｓ://ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ)查找拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)ＡｔＣＢＬ１㊁ＡｔＣＢＬ９的基因序列ꎬ然后在大白菜(Ｂｒａｓ￣ｓｉｃａｒａｐａ)基因组进行ＢＬＡＳＴ比对ꎬ得到与其同源性最高的ＢｒＣＢＬ１(ＸＭ＿００９１３８６０７.３)㊁ＢｒＣＢＬ９(ＸＭ＿００９１３０６９０.３)基因序列ꎮ菜心是大白菜的一个变种ꎬ亲缘关系较近ꎬ因此根据大白菜ＢｒＣＢＬ１㊁ＢｒＣＢＬ９基因序列设计同源引物用于克隆菜心相应的基因ꎮ利用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５.０软件设计引物ꎬ引物序列见表１ꎮ设置２０μＬＰＣＲ反应体系:ＰｒｉｍｅｒｓｔａｒＭａｘｐｒｉｍｅｒ１０μＬꎬｃＤＮＡ模板链１μＬꎬ上下游引物各１μＬꎬ加ｄｄＨ２Ｏ补充至２０μＬꎮＰＣＲ反应程序:９８ħ预变性５ｍｉｎꎻ９８ħ２０ｓꎬ５８ħ２０ｓꎬ７２ħ１ｍｉｎꎬ３５个循环ꎻ７２ħ延伸１ｍｉｎꎮ回收扩增产物ꎬ连接到ｐＭＤ２０－Ｔ载体并转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞ꎬ将经ＰＣＲ鉴定的阳性克隆送广州擎科生物技术有限公司测序ꎮ１.４㊀生物信息学分析利用表２所列软件对菜心ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９基因编码蛋白及其氨基酸序列进行分析ꎮ㊀㊀表１㊀所用引物及其序列引物序列(５ᶄ－３ᶄ)用途ＣＢＬ１Ｆ:ＡＴＧＧＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＡＴＣＡＡＡＧＲ:ＴＣＡＴＧＴＧＡＣＡＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＢＬ９Ｆ:ＡＴＧＧＧＣＴＧＴＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡＣＲ:ＴＣＡＡＧＴＣＧＣＡＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＣ基因克隆ｑ－ＣＢＬ１Ｆ:ＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＣＧＡＴＴＴＴＧＲ:ＣＡＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＴＴＡＡＡＧＡＴｑ－ＣＢＬ９Ｆ:ＧＧＡＴＧＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＣＣＧＡＲ:ＴＧＧＡＡＡＣＧＴＧＧＴＣＧＴＴＡＴＧＴ荧光定量ＰＣＲＧＡＤＰＨＦ:ＣＡＧＧＴＴＴＧＧＡＡＴＴＧＴＣＧＡＧＧＲ:ＧＡＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＣＡＣＣＴＴＴＣＡｃｔｉｎ２Ｆ:ＧＡＣＴＡＣＧＡＧＣＡＮＧＡＧＮＴＮＧＡＧＡＣＲ:ＣＴＧＴＴＧＧＡＡＮＧＴＧＣＴＧＡＧＧＧＡ荧光定量ＰＣＲ内参㊀㊀表２㊀所用软件及其网址软件网址用途ＰｒｏｔＰａｒａｍｈｔｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｐａｒａｍ/蛋白质理化特性分析ＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＳｃａｌｅｈｔｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｓｃａ/蛋白疏水性分析Ｃｅｌｌ－Ｐｌｏｃ２.０ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｓｂｉｏ.ｓｊｔｕ.ｅｄｕ.ｃｎ/ｂｉｏｉｎｆ/Ｃｅｌｌ－ＰＬｏｃ－２/ＰｒｏｔＣｏｍｐｖ.９.０ｈｔｔｐ://ｌｉｎｕｘ１.ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ.ｃｏｍ/ｂｅｒｒｙ.ｐｈｔｍｌ?ｇｒｏｕｐ＝ｐｒｏｇｒａｍｓ＆ｓｕｂｇｒｏｕｐ＝ｐｒｏｌｏｃ＆ｔｏｐｉｃ＝ｐｒｏｔｃｏｍｐｐｌ蛋白亚细胞定位ＴＭＨＭＭＳｅｒｖｅｒ２.０ｈｔｔｐｓ://ｓｅｒｖｉｃｅｓ.ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅ.ｐｈｐ?ＴＭＨＭＭ－２.０蛋白质跨膜结构分析ＮｅｔＰｈｏｓ３.１ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ＮｅｔＰｈｏｓ/磷酸化位点分析ＳｉｇｎａｌＰ５.０ｈｔｔｐｓ://ｓｅｒｖｉｃｅｓ.ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅ.ｐｈｐ?ＳｉｇｎａｌＰ－５.０蛋白质信号肽预测Ｅｘｐａｓｙｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/蛋白质二级结构分析ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/蛋白质三维结构预测ＳＭＡＲＴｈｔｔｐ://ｓｍａｒｔ.ｅｍｂｌ－ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ.ｄｅ/保守结构域分析ＳＴＲＩＮＧｈｔｔｐｓ://ｓｔｒｉｎｇ－ｄｂ.ｏｒｇ/蛋白互作分析１.５㊀基因表达量的ｑＲＴ－ＰＣＲ分析按照１.２中的方法提取菜心样品的ＲＮＡ并反转录为ｃＤＮＡꎬｃＤＮＡ样品用ＲＮａｓｅ－ＦｒｅｅｄｄＨ２Ｏ稀释５倍后作为模板ꎬ利用ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ®ＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑＴＭ进行荧光定量ＰＣＲ分析ꎮ扩增体系:２ˑＳＹＢＲＧｒｅｅｎＴａｑＴＭ１０μＬꎬ１０μｍｏｌ/Ｌ上下游引物各０.４μＬꎬｃＤＮＡ模板２μＬꎬ用ＲＮａｓｅ￣ＦｒｅｅｄｄＨ２Ｏ补充到２０.０μＬꎮ扩增程序:９５ħ预变性３ｍｉｎꎬ９５ħ１０ｓꎬ６０ħ３０ｓꎬ循环４０次ꎮ以ＧＡＤＰＨ和Ａｃｔｉｎ２为内参基因ꎬ用２－ΔΔＣｔ计算基因相对表达量[２３]ꎮ１.６㊀数据统计分析与作图用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１０整理数据ꎬ用ＳＰＳＳ１９.０进行统计分析ꎬ用Ｄｕｎｃａｎ ｓ法进行显著性分析ꎬ用ＳｉｇｍａＰｌｏｔ１１.０作图ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀菜心ＣＢＬ１、ＣＢＬ９基因的克隆以菜心叶片ｃＤＮＡ为模板ꎬ用ＣＢＬ１－Ｆ㊁ＣＢＬ１－３㊀第７期㊀㊀㊀朱云娜ꎬ等:两个菜心ＣＢＬ基因的克隆㊁生物信息学分析及其表达特性分析Ｒ和ＣＢＬ９－Ｆ㊁ＣＢＬ９－Ｒ引物进行ＰＣＲ扩增ꎬ均获得约６５０ｂｐ的基因片段(图１)ꎮ经测序ꎬ克隆得到的基因片段长度均为６４２ｂｐꎮ通过ＢＬＡＳＴ在线比对ꎬ菜心ＣＢＬ１基因片段与拟南芥的ＡｔＣＢＬ１(ＮＭ＿００１３４１２３８.１)㊁甘蓝型油菜(Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ)的ＢｎＣＢＬ１(ＸＭ＿０１３８８１８４６.３)㊁大白菜的ＢｒＣＢＬ１(ＸＭ＿００９１３８６０７.３)的核苷酸序列同源性分别为９１.１２％㊁９８.２９％㊁９８.４４％ꎻ而菜心ＣＢＬ９基因片段与ＡｔＣＢＬ９(ＮＭ＿１２４０８１.４)㊁ＢｎＣＢＬ９(ＸＭ＿０１３８４０９１２.３)㊁ＢｒＣＢＬ９(ＸＭ＿００９１３０６９０.３)的核苷酸序列同源性分别为９２.２１％㊁９９.６９％㊁９９.６９％ꎮ初步表明所克隆的两个基因片段分别为菜心ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９基因序列ꎮ将这两个基因分别命名为ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９ꎮＭ:ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１:ＢｃＣＢＬ１基因扩增条带ꎻ２:ＢｃＣＢＬ９基因扩增条带ꎮ图１㊀菜心ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９基因的ＰＣＲ扩增图谱２.２㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９的氨基酸序列分析利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ和ＥｘＰＡＳｙＰｒｏｔＳｃａｌｅ对Ｂｃ￣ＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９编码蛋白序列进行分析ꎬ结果显示ꎬＢｃＣＢＬ１编码２１３个氨基酸ꎬ分子量为２４.６０ｋＤꎬ原子组成为Ｃ１１０９Ｈ１７２５Ｎ２７７Ｏ３３６Ｓ９ꎬ理论等电点(ｐＩ)为４.６４ꎬ平均疏水率为－０.１７３ꎬ脂肪酸系数为８９.２０ꎬ不稳定系数为３６.３５ꎮＢｃＣＢＬ９编码２１３个氨基酸ꎬ分子量为２４.４１ｋＤꎬ原子组成为Ｃ１０９７Ｈ１７０３Ｎ２７５Ｏ３３８Ｓ８ꎬｐＩ为４.５８ꎬ平均疏水率为－０.１８５ꎬ脂肪酸系数为８８.３１ꎬ不稳定系数为３４.６９ꎮＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９均为可溶性亲水蛋白ꎮ通过ＳｉｇｎａｌＰ５.０预测分析发现二者均无信号肽序列ꎬ为非分泌型蛋白ꎮＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９均有多个丝氨酸磷酸位点(ｓｅｒ)和苏氨酸磷酸位点(Ｔｈｒ)ꎮ利用Ｃｅｌｌ－Ｐｌｏｃ２.０和ＰｒｏｔＣｏｍｐｖ.９.０预测ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９亚细胞定位ꎬ均定位于细胞膜上ꎻＴＭＨＭＭＳｅｒｖｅｒ２.０分析结果表明二者均无跨膜结构ꎮ２.３㊀ＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９的二㊁三级结构分析运用Ｅｘｐａｓｙ的ＳＯＰＭＡ对ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９蛋白的二级结构进行预测分析ꎬ结果(图２)显示ꎬＢｃＣＢＬ１蛋白含有α－螺旋(ａｌｐｈａｈｅｌｉｘ)５０.７０％㊁β－折叠延伸链(ｅｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄ)１１.７４％㊁β－转角(ｂｅ￣ｔａｔｕｒｎ)５.１６％㊁无规则卷曲(ｒａｎｄｏｍｃｏｉｌ)３２.３９％ꎬ而ＢｃＣＢＬ９蛋白的α－螺旋㊁β－折叠延伸链㊁β－转角㊁无规则卷曲分别为５２.１１％㊁７.９８％㊁６.５７％㊁３３.３３％ꎮ可见ꎬ两者的主要组成部分均为α－螺旋ꎬβ－折叠延伸链㊁β－转角㊁无规则卷曲则散布于蛋白结构中ꎮ三级结构预测结果与该结果一致ꎮ另外ꎬＢｃＣＢＬ１蛋白三级结构为单体结构ꎬ而ＢｃＣＢＬ９蛋白三级结构为二聚体结构(图３)ꎮ２.４㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９氨基酸序列同源性比对及系统进化分析将ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９与ＡｔＣＢＬ１(ＮＰ＿５６７５３３.１)㊁ＡｔＣＢＬ９(ＮＰ＿１９９５２１.１)㊁ＢｒＣＢＬ１(ＸＰ＿００９１３６８５５.１)㊁ＢｒＣＢＬ９(ＸＰ＿００９１２８９３８.１)进行氨基酸序列多重比对分析ꎬ结果(图４)显示ꎬＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９与两个物种ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９的氨基酸相似性介于９５.３１％~１００％ꎬ其中ꎬＢｃＣＢＬ１与ＢｒＣＢＬ１相似性高达１００％ꎬＢｃＣＢＬ９与ＢｒＣＢＬ９相似性为９９.５３％ꎮ蓝色代表α－螺旋ꎻ绿色代表β－转角ꎻ紫色代表β－折叠延伸链ꎻ红色代表无规则卷曲ꎮ图２㊀ＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９蛋白二级结构预测４㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀图３㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９蛋白三级结构预测图４㊀菜心㊁拟南芥㊁大白菜ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９氨基酸序列多重比对结果㊀㊀利用ＳＭＡＲＴ在线工具对两个菜心ＣＢＬ基因编码氨基酸进行保守结构域分析ꎬ结果(图５)表明ꎬＢｃ￣ＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９均具有ＣＢＬ蛋白结合Ｃａ２＋所必需的ＥＦ－ｈａｎｄ型结构域(ＥＦｈ)ꎬ保守结构域均为３个且位置相同ꎬ位于第７１~９９㊁１０８~１３６㊁１５２~１８０位氨基酸ꎬＦＡＮＲＩＦＤＭＦＤＶＫＲＫＧＶＩＤＦＧＤＦＶＲＳＬＮＶＦ(ＢｃＣＢＬ１)和ＦＡＮＲＩＦＤＬＦＤＶＫＲＫＧＶＩＤＦＧＤＦＶＲＳＬＮＶＦ(ＢｃＣＢＬ９)ꎬＫＩＤＦＴＦＲＬＹＤＭＤＣＴＧＦＩＥＲＱＥＶＫＱＭＬＩＡＬ(ＢｃＣＢＬ１)和ＫＴＤＦＴＦＲＬＹＤＭＤＣＴＧＦＩＥＲＱＥＶＫＱＭＬＩＡＬ(Ｂｃ￣ＣＢＬ９)ꎬＩＬＤＫＴＦＥＤＡＤＶＮＱＤＧＫＩＤＫＬＥＷＳＤＦＶＮＫＮ(ＢｃＣＢＬ１)和ＩＬＤＱＴＦＥＤＡＤＶＤＲＤＧＫＩＤＫＴＥＷＳＤ￣ＦＶＩＫＮ(ＢｃＣＢＬ９)ꎮ图５㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９保守结构域分析进化树分析结果(图６)表明ꎬＢｃＣＢＬ１与ＢｒＣＢＬ１图６㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９与拟南芥㊁大白菜ＣＢＬｓ的进化树分析５㊀第７期㊀㊀㊀朱云娜ꎬ等:两个菜心ＣＢＬ基因的克隆㊁生物信息学分析及其表达特性分析亲缘关系最近ꎬＢｃＣＢＬ９与ＢｒＣＢＬ９亲缘关系最近ꎬ其次分别为ＡｔＣＢＬ１和ＡｔＣＢＬ９ꎬ且菜心㊁大白菜㊁拟南芥的ＣＢＬ１与ＣＢＬ９同聚类在一个分支ꎬ而与拟南芥㊁大白菜的其他ＣＢＬ成员相距较远ꎮ进一步表明本研究分离得到的２个菜心ＣＢＬ基因属于植物ＣＢＬｓ基因家族成员ꎬ编码类钙调磷酸酶Ｂ亚基蛋白ꎮ２.５㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９在菜心不同器官中的表达分析由图７可知ꎬＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９在菜心根㊁茎㊁叶㊁叶柄㊁薹茎㊁花蕾㊁花㊁荚果中均有表达ꎮＢｃＣＢＬ１在菜心叶中表达量最高ꎬ显著高于其他器官ꎬ其次为根㊁茎ꎻ在叶柄㊁薹茎㊁花蕾㊁花㊁荚果中表达量相对较低ꎬ且器官间无显著差异ꎮＢｃＣＢＬ９在菜心荚果中表达量最高ꎬ其次为薹茎ꎬ两者间差异显著且均显著高于其他器官ꎻ在叶㊁叶柄㊁花㊁根㊁茎中表达量相对较低ꎬ在花蕾中的表达量最低ꎬ显著低于其他器官ꎬ仅为荚果中表达量的３.３３％ꎮ两个基因均以菜心根系中ＢｃＣＢＬ１的相对表达量为１进行比较分析ꎮ不同小写字母表示在Ｐ<０.０５水平上差异显著ꎬ下同ꎮ图７㊀ＢｃＣＢＬ１(Ａ)和ＢｃＣＢＬ９(Ｂ)在菜心不同器官中的表达分析２.６㊀ＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９对不同氮素形态的响应由图８可知ꎬＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９表达量受氮素形态及其水平影响ꎬ二者表现出不同的表达模式ꎮＢｃＣＢＬ１在低浓度氮条件表达量较高ꎬ表达量有随氮浓度增加而明显下降的趋势ꎻ在８ｍｍｏｌ/ＬＮＯ－３(或ＮＨ＋４)条件下ꎬ菜心根和叶中的ＢｃＣＢＬ１表达量也较高ꎬ为１ｍｍｏｌ/ＬＮＯ－３(或ＮＨ＋４)条件下的５.９２％~４１.４１％ꎮＢｃＣＢＬ１表达还受不同氮素形态影响ꎬ在相同浓度条件下ꎬＮＨ＋４处理的菜心根中ＢｃＣＢＬ１表达量最高ꎬＮＯ－３处理的次之ꎬＮＨ４ＮＯ３处理的最低(图８Ａ)ꎻ在菜心叶中ꎬＢｃＣＢＬ１表达也呈现出与根中类似的变化规律(图８Ｂ)ꎮ由图８Ｃ看出ꎬ在菜心根中ꎬＢｃＣＢＬ９表达量随着ＮＨ＋４浓度增加显著增加ꎬ８ｍｍｏｌ/ＬＮＨ＋４处理下最高ꎬ分别是中㊁低浓度ＮＨ＋４处理下的１.９６倍和４８.１６倍ꎻ而在ＮＯ－３和ＮＨ４ＮＯ３处理下ꎬ随其浓度增加ꎬＢｃＣＢＬ９表达量均呈现出先下降后上升的趋势ꎬ且不同浓度处理间差异显著ꎬ但表达量最高值分别出现在低浓度和高浓度处理时ꎮ在菜心叶中(图８Ｄ)ꎬＢｃＣＢＬ９表达水平随ＮＯ－３浓度增加而降低ꎬ中㊁高浓度处理间表达量差异不显著ꎬ但显著低于低浓度处理ꎻ在ＮＯ－３和ＮＨ４ＮＯ３处理下ꎬＢｃ￣ＣＢＬ９表达水平随浓度的变化趋势与根系中相似ꎬ但变化幅度略小ꎬ其中ꎬ中浓度与高浓度ＮＨ＋４处理间㊁低浓度与高浓度ＮＨ４ＮＯ３处理间差异不显著ꎮ此外ꎬ与ＢｃＣＢＬ１相比ꎬ无论在菜心根还是叶中ꎬＢｃＣＢＬ９均保持较高的表达水平ꎬ暗示两基因可能在氮素吸收利用方面发挥着不同作用ꎮ２.７㊀ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９蛋白互作关系在ＳＴＲＩＮＧ交互式数据库中输入ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９蛋白序列ꎬ选择 拟南芥 为所属物种ꎬ利用拟南芥蛋白构建互作关系网络ꎬ据此推测Ｂｃ￣ＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９的互作蛋白ꎮ由图９推测可知ꎬＢｃＣＢＬ１蛋白与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族(ＣＩＰＫ１㊁ＣＩＰＫ３㊁ＣＩＰＫ７㊁ＣＩＰＫ８㊁ＣＩＰＫ９㊁ＣＩＰＫ１５㊁ＣＩＰＫ２３㊁ＳＯＳ２㊁ＳＩＰ３)㊁钾离子通道蛋白ＡＫＴ１具有互作关系ꎻ而ＢｃＣＢＬ９蛋白也可与ＡＫＴ１和ＣＩＰＫ家族蛋白互作ꎬ但其互作网络中未包含ＣＩＰＫ７和ＣＩＰＫ１５ꎬ此外ꎬ菜心ＢｃＣＢＬ９还可与免疫亲和蛋白(ＦＫＢＰ１２)和ＡＴ２Ｇ２００５０蛋白互作ꎮ６㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀横坐标的Ｎ㊁Ａ㊁ＮＡ分别代表ＮＯ－３㊁ＮＨ＋４㊁ＮＨ４ＮＯ３ꎬ１㊁４㊁８分别指３种浓度处理ꎬ单位均为ｍｍｏｌ/Ｌꎮ两个基因均以１ｍｍｏｌ/ＬＮＯ－３处理的菜心根系ＢｃＣＢＬ１表达量为１进行比较分析ꎮ图８㊀ＢｃＣＢＬ１(Ａ㊁Ｂ)和ＢｃＣＢＬ９(Ｃ㊁Ｄ)对不同氮素形态的响应图９㊀ＢｃＣＢＬ１(Ａ)和ＢｃＣＢＬ９(Ｂ)蛋白的互作网络３㊀讨论与结论本研究从菜心中克隆到两个完整的ＣＢＬ基因 ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９ꎬ开放阅读框均为６４２ｂｐꎬ均编码２１３个氨基酸残基ꎻＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９蛋白均具有ＣＢＬ蛋白结合Ｃａ２＋所必需的ＥＦ－ｈａｎｄ结构域ꎻ与大白菜㊁拟南芥ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９的氨基酸序列同源性均在９５％以上ꎬ聚类于同一进化分支ꎬ但与其他ＣＢＬ成员的遗传距离较远ꎮＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９编码蛋白均为稳定性蛋白ꎬ具有较强的亲水性ꎬ定位于细胞质膜上ꎬ无跨膜结构ꎬ无信号肽ꎬ与拟南芥ＡｔＣＢＬ１㊁ＡｔＣＢＬ９[２４]和唐古特白刺Ｎｔ￣ＣＢＬ的定位结果一致[１１]ꎮＣＢＬ定位于质膜上表明其可能通过结合膜蛋白在细胞中发挥作用[１１]ꎮＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９蛋白结构的主要组成部分均为α－螺旋ꎬ散布β－折叠延伸链㊁β－转角㊁无规则７㊀第７期㊀㊀㊀朱云娜ꎬ等:两个菜心ＣＢＬ基因的克隆㊁生物信息学分析及其表达特性分析卷曲ꎻ然而ꎬＢｃＣＢＬ１为单体结构ꎬＢｃＣＢＬ９蛋白为二聚体结构ꎬ暗示两者可能发挥着不同的生物学功能ꎮ基因在不同组织中的表达特性可能暗示其在相应表达部位的生物学功能[２５]ꎮ在已研究的植物中ꎬ多数ＣＢＬ在各个组织或器官中具有不同程度表达ꎬ在某些组织中具有表达优势[８]ꎮ本研究结果表明ꎬＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９在菜心根㊁茎㊁叶㊁叶柄㊁薹茎㊁花蕾㊁花㊁荚果中均有表达ꎬ其中ꎬＢｃ￣ＣＢＬ１在叶中的表达量远高于在其他组织中ꎬ而ＢｃＣＢＬ９在荚果中的表达量显著高于在其他组织中ꎬ暗示两基因可能分别主要在菜心叶和荚果生长发育过程中发挥作用ꎮ研究报道ꎬＣＢＬ１/９可与ＣＩＰＫ２３形成ＣＢＬ－ＣＩＰＫ复合体参与拟南芥氮信号通路调控[１８ꎬ１９]ꎬ并可响应低温㊁高盐㊁干旱㊁低钾等多种逆境胁迫ꎬ在植物生长发育过程和非生物胁迫中具有重要作用[１３ꎬ２０]ꎮ本研究结果表明ꎬＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９确实可响应外界氮素变化ꎬ二者的表达水平不仅受不同氮素形态影响ꎬ也受氮素水平影响ꎬ但二者呈现出不同的变化趋势ꎮ其中ꎬＢｃＣＢＬ１在低浓度(１ｍｍｏｌ/Ｌ)单一氮源(ＮＯ－３或ＮＨ＋４)条件上调表达ꎬ而在中(４ｍｍｏｌ/Ｌ)㊁高浓度(８ｍｍｏｌ/Ｌ)或混合氮源(ＮＨ４ＮＯ３)条件下调表达ꎬ甚至不表达ꎻＢｃＣＢＬ９在低浓度ＮＨ＋４条件下表达量低ꎬ在中㊁高浓度ＮＨ＋４条件下表达量高ꎬ而在ＮＯ－３和ＮＨ４ＮＯ３处理时ꎬＢｃＣＢＬ９在低/高氮浓度下表达水平较高ꎬ在中等浓度下表达量较低ꎮ这与ＡｔＣＢＬ１/９受低浓度ＮＯ－３诱导上调表达而在高浓度ＮＯ－３时下调表达[１８]的结论一致ꎮＳｔｒａｕｂ[２４]报道ꎬ拟南芥ＡｔＣＢＬ１表达依赖于ＮＨ＋４ꎬ缺氮后恢复供２ｍｍｏｌ/ＬＮＨ＋４可诱导其表达ꎬ供ＮＨ＋４３０ｍｉｎ时ꎬＡｔＣＢＬ１表达量达到峰值ꎬ随后开始下降ꎻ而ＡｔＣＢＬ９表达量在供ＮＨ＋４３０ｍｉｎ后才开始增加ꎬ随后基本无明显变化ꎮ本研究主要对供不同浓度不同形态氮素２ｈ后ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９基因在菜心中的表达情况进行分析ꎬ并未比较不同供氮时间对二者表达量的影响ꎬ可在今后研究中增加该项目ꎮ通过ＳＴＲＩＮＧ交互式数据库ꎬ利用拟南芥ＣＢＬ１㊁ＣＢＬ９蛋白构建互作蛋白网络ꎬ据此推测菜心的ＢｃＣＢＬ１与ＣＩＰＫ１㊁ＣＩＰＫ３㊁ＣＩＰＫ７㊁ＣＩＰＫ８㊁ＣＩＰＫ９㊁ＣＩＰＫ１５㊁ＣＩＰＫ２３等ＣＩＰＫ家族成员及钾离子通道蛋白ＡＫＴ１互作ꎻ而ＢｃＣＢＬ９虽可与ＡＫＴ１㊁ＣＩＰＫｓ互作ꎬ但ＣＩＰＫ成员不包含ＣＩＰＫ７和ＣＩＰＫ１５ꎬ此外ꎬＢｃＣＢＬ９还可与ＦＫＢＰ１２和ＡＴ２Ｇ２００５０蛋白互作ꎮＳＴＲＩＮＧ数据库对ＡＴ２Ｇ２００５０蛋白注释为含有蛋白磷酸酶２Ｃ和环核苷酸结合/激酶结构域蛋白ꎬ参与调控蛋白质磷酸化ꎮＡｔＣＢＬ１/９受低浓度ＮＯ－３诱导表达ꎬ促进其与ＣＩＰＫ２３形成复合体以调控ＡｔＮＲＴ１.１磷酸化水平ꎬ从而促进ＮＯ－３运输[１８]ꎮ在拟南芥中ꎬＡｔＣＢＬ１与ＡｔＣＩＰＫ２３形成ＣＢＬ－ＣＩＰＫ复合体ꎬ参与调控ＡｔＡＭＴ１.１和ＡｔＡＭＴ１.２蛋白磷酸化水平ꎬ从而调控拟南芥根系对ＮＨ＋４的吸收ꎬ而ＡｔＣＢＬ９并未参与调控[１９ꎬ２１ꎬ２４]ꎮ本研究发现菜心ＢｃＣＢＬ１和ＢｃＣＢＬ９表达均受不同氮素形态和氮素水平影响ꎬ二者在不同氮素形态下如何调控氮素吸收利用ꎬ是否存在功能冗余现象ꎬ仍需进一步研究ꎮ综上ꎬ本研究分离得到的ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９基因属于菜心ＣＢＬ基因家族成员ꎬ具有组织表达特异性ꎬ受氮素不同形态不同水平影响ꎬ但两者表达模式不同ꎬ可能参与调控不同氮素条件下的氮吸收与利用过程ꎬ具体作用机制还需进一步探究ꎮ在今后研究中ꎬ可将氮素供应时间进一步细化ꎬ观察ＢｃＣＢＬ１㊁ＢｃＣＢＬ９基因在不同供氮时间下的表达模式ꎬ再利用ＶＩＧＳ对基因进行沉默ꎬ验证其功能ꎮ本研究结果可对进一步探究菜心氮素吸收利用分子机制提供一定的理论依据ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀张传鹏ꎬ戴绍军ꎬ魏建华ꎬ等.ＣＢＬ家族在植物逆境胁迫响应和生长发育中的作用[Ｊ].现代农业科技ꎬ２０１３ꎬ５:２３０－２３１ꎬ２３４.[２]㊀ＭäｈｓＡꎬＳｔｅｉｎｈｏｒｓｔＬꎬＨａｎＪＰꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎＢ￣ｌｉｋｅＣａ２＋ｓｅｎｓｏｒｓＣＢＬ１ａｎｄＣＢＬ９ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｐｏｌｌｅｎｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｐｏｌｌｅｎｔｕｂｅｇｒｏｗｔｈｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔꎬ２０１３ꎬ６(４):１１４９－１１６２.[３]㊀曾后清ꎬ张夏俊ꎬ张亚仙ꎬ等.植物类钙调素生理功能的研究进展[Ｊ].中国科学:生命科学ꎬ２０１６ꎬ４６(６):７０５－７１５. [４]㊀马瑞ꎬ李世贵ꎬ刘维刚ꎬ等.植物ＣＢＬ－ＣＩＰＫ信号系统的功能及其响应非生物胁迫作用机制研究进展[Ｊ].植物生理学报ꎬ２０２１ꎬ５７(３):５２１－５３０.[５]㊀王海波ꎬ李芙蓉ꎬ杨金翠ꎬ等.ＣＢＬ－ＣＩＰＫ信号系统参与小桐子抗冷性形成的生物信息学分析[Ｊ].广西植物ꎬ２０２２ꎬ４２(６):９９６－１００７.[６]㊀ＷｅｉｎｌＳꎬＫｕｄｌａＪ.ＴｈｅＣＢＬ￣ＣＩＰＫＣａ２＋￣ｄｅｃｏｄｉｎｇｓｉｇｎａｌｉｎｇｎｅｔ￣８㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀ｗｏｒｋ:ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ[Ｊ].ＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２００９ꎬ１８４(３):５１７－５２８.[７]㊀ＫｏｌｕｋｉｓａｏｇｌｕＵꎬＷｅｉｎｌＳꎬＢｌａｚｅｖｉｃＤꎬｅｔａｌ.Ｃａｌｃｉｕｍｓｅｎｓｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ:ｇｅｎｏｍｉｃｓｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐ￣ｓｉｓａｎｄｒｉｃｅＣＢＬ￣ＣＩＰＫｓｉｇｎａｌｉｎｇｎｅｔｗｏｒｋｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏ￣ｇｙꎬ２００４ꎬ１３４(１):４３－５８.[８]㊀曾文艺ꎬ周思如ꎬ左同鸿ꎬ等.普通烟草ＣＢＬ基因家族全基因组鉴定与分析[Ｊ/ＯＬ].分子植物育种ꎬ２０２２－０１－１０.ＤＯＩ:２０２２.４６.１０６８.Ｓ.２０２２０１１０.１３１７.０１０.[９]㊀曹齐卫ꎬ刘明毓ꎬ陈伟ꎬ等.黄瓜ＣＢＬ基因的鉴定和特征分析[Ｊ].核农学报ꎬ２０１６ꎬ３０(１１):２１２７－２１３２. [１０]李利斌ꎬ王殿峰ꎬ刘立锋ꎬ等.大白菜ＣＢＬ家族基因的鉴定和遗传进化分析[Ｊ].山东农业科学ꎬ２００９ꎬ５:４－７ꎬ１１. 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[１９]ＳｔｒａｕｂＴꎬＬｕｄｅｗｉｇＵꎬＮｅｕｈäｕｓｅｒＢ.ＴｈｅｋｉｎａｓｅＣＩＰＫ２３ｉｎｈｉｂ￣ｉｔｓａｍｍｏｎｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２０１７ꎬ２９(２):４０９－４２２.[２０]ＴａｎｇＲＪꎬＷａｎｇＣꎬＬｉＫＬꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＣＢＬ￣ＣＩＰＫｃａｌｃｉｕｍｓｉｇ￣ｎａｌｉｎｇｎｅｔｗｏｒｋ:ｕｎｉｆｉｅｄｐａｒａｄｉｇｍｆｒｏｍ２０ｙｅａｒｓｏｆｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２０ꎬ２５(６):６０４－６１７. [２１]ＨａｏＤＬꎬＺｈｏｕＪＹꎬＹａｎｇＳＹꎬｅｔａｌ.Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｍｍｏｎｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２０ꎬ２１(１０):３５５７.[２２]朱云娜.菜心ＢｃＡＭＴ１ｓ在铵硝营中调控铵吸收的作用机理研究[Ｄ].广州:华南农业大学ꎬ２０１８.[２３]ＬｉｖａｋＫＪꎬＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎＴＤ.Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄａｔａｕｓｉｎｇｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎｄｔｈｅ２－ΔΔＣＴｍｅｔｈｏｄ[Ｊ].Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ２００１ꎬ２５(４):４０２－４０８.[２４]ＳｔｒａｕｂＴ.Ｐｌａｎｔａｍｍｏｎｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ(ＡＭＴ)ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｉｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｎｅｔｗｏｒｋｓ[Ｄ].Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ:ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＨｏｈｅｎｈｅｉｍꎬ２０１６.[２５]翟莹ꎬ邱爽ꎬ张军ꎬ等.大豆中３个Ｄｏｆ转录因子的生物信息学及表达分析[Ｊ].华北农学报ꎬ２０１９ꎬ３４(６):１４－１９.９㊀第７期㊀㊀㊀朱云娜ꎬ等:两个菜心ＣＢＬ基因的克隆㊁生物信息学分析及其表达特性分析。
二色补血草海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因的克隆及分析
二色补血草海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因的克隆及分析马辉;刘桂丰;徐晨曦;王玉成;杨传平【期刊名称】《东北林业大学学报》【年(卷),期】2008(036)008【摘要】以二色补血草叶片组织为材料构建了cDNA文库,文库的初始滴度为2.0×106pfu,重组率为95%,平均插入片段为0.8 kb,扩增后文库的滴度为4.0×109 pfu·mL-1.通过随机测序从文库中获得的海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP)基因的全长cDNA序列,该序列长1 986 bp,其中5'非翻译区163 bp,3'非翻译区680 bp,开放读码框长1 143 bp,编码380个氨基酸,蛋白分子质量为42 KD,理论等电点为6.68.海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶在海藻糖合成过程中起关键作用,该基因的克隆为研究海藻糖在二色补血草中的合成奠定了基础.【总页数】4页(P1-3,7)【作者】马辉;刘桂丰;徐晨曦;王玉成;杨传平【作者单位】林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040;林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室(东北林业大学),哈尔滨,150040【正文语种】中文【中图分类】Q789【相关文献】1.碱茅6-磷酸海藻糖合成酶基因的克隆及其耐逆性分析 [J], 李莹;柳参奎2.坛紫菜6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)家族基因的克隆及表达特征分析 [J], 史健志;徐燕;纪德华;陈昌生;谢潮添3.木薯海藻糖-6-磷酸酯酶MeTPP6基因克隆及其表达分析 [J], 丁泽红;吴春来;颜彦;付莉莉;胡伟4.矮牵牛海藻糖-6-磷酸合酶基因PhTPS6的克隆与表达分析 [J], 王琦;刘同瑞;刘娜;熊枫;张水明;董丽丽5.香蕉海藻糖-6-磷酸合成酶基因MaTPS2克隆及表达特性分析 [J], 王安邦;吴琼;舒海燕;许桂莺;苗红霞;柯建浩;贾彩虹;邢文婷;许奕因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
陆地棉光合系统ⅡPsbR基因的克隆与表达分析
陆地棉光合系统ⅡPsbR基因的克隆与表达分析摘要：陆地棉（Gossypium hirsutum）是一种重要的经济作物，其光合系统的正常功能对植物的生长与发育至关重要。
本研究旨在克隆并分析陆地棉光合系统Ⅱ中的PsbR基因，探究其在植物生理过程中的作用。
通过PCR技术克隆并测序得到陆地棉PsbR基因的全长序列，并利用组织特异性表达分析了该基因在不同组织中的表达情况。
结果显示，陆地棉PsbR基因的开放阅读框（ORF）长约489 bp，编码一个约162个氨基酸的蛋白质。
系统发育树分析表明，陆地棉PsbR基因与其他植物的PsbR基因高度保守。
实时荧光定量PCR结果显示，在陆地棉的根、茎、叶、花中，PsbR基因均有表达，其中以叶中表达量最高。
利用融合表达系统成功表达了PsbR蛋白，并进行了纯化和功能鉴定。
关键词：陆地棉；光合系统Ⅱ；PsbR基因；克隆；表达引言陆地棉是一种重要的经济作物，广泛种植于全球多个地区。
作为一种C3植物，陆地棉的光合系统起着至关重要的作用，是植物进行光合作用和生物质合成的基础。
光合系统Ⅱ是光合电子转运链中的一个重要组成部分，参与光合作用产生的ATP和NADPH的合成。
PsbR基因是光合系统Ⅱ中的重要组成部分，其编码的蛋白质在光合系统的正常功能中发挥重要的作用。
虽然陆地棉的光合系统已有详细研究，但对其中PsbR基因的研究尚非常有限。
因此，本研究旨在克隆并表达陆地棉光合系统ⅡPsbR基因，进一步了解其在陆地棉生理过程中的作用。
材料与方法1. 材料本研究使用陆地棉（Gossypium hirsutum）品种作为实验材料。
植物根、茎、叶片和花朵分别采集自生长良好的陆地棉植株。
2. 克隆与序列分析根据已知的PsbR基因序列，设计引物并进行PCR扩增反应。
将扩增产物进行电泳检测后，纯化并进行测序。
通过比对分析确定克隆得到的PsbR基因序列。
3. 组织特异性表达分析采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，分别在根、茎、叶和花中检测PsbR基因的表达情况。
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关键 词：二色 ３ 血 草；金 属硫 蛋 白；实时定量 Ｐ Ｒ；原核 表达 １ 、 Ｃ
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研究报告
一
个新 的二色补血 草金属硫蛋 白基 因 Ｌ ＭＴ ｂ ２的克隆及
其表达 分析
班巧英 ， 桂 丰， 刘 王玉成 ， 大伟 ， 丽丽 张 蒋
东 北林 业 大 学 ，哈 尔滨 １ ０ ４ ５００
摘要 ：从 二色３ 血 草 ｃ ＮＡ 中分 离 出一个新 的金 属硫蛋 白基 因 Ｌ ＭＴ 长 ｃ ＮＡ序 列。 １ 、 Ｄ ｂ ２全 Ｄ 该基 因全 长 ５ ８ｂ ， １ ｐ
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Ｄｏ Ｉ １ ．７ ４Ｓ ． １ ０ ．０ ８０ ０ ５ ： ０ ３ ２ ／ ＰＪ．０ ５２ ０ ．１ ７
其 中 ５ 翻译 区（ Ｔ ）４ ｂ ， 啡 翻译 区 ２ ５ ｂ ，开放 阅读框（ Ｆ ２ ９ ｂ ，编码 由 ８ 啡 Ｕ Ｒ６ ｐ ３ ０ ｐ ＯＲ ）４ ｐ ２个 氨基酸 组成 的蛋 白质，
编码 蛋 白的分子量 为 ８１ ｋ ａ ． Ｄ ，理论 等 电点（Ｉ为 ４７ 。利 用实 时定量 Ｐ Ｒ 方法研 究 了二色 ３ 血草 在 Ｃｕ Ｏ４ ｐ） ． ２ Ｃ １ 、 Ｓ 、 Ｃ Ｃ１、Ｎａ １ ｄ ２ Ｃ 、低温 和 Ｐ Ｇ胁迫 下不 同时间该基 因 的表 达模 式。结果 表 明， ｕ Ｏ 、Ｃ Ｃ ２ Ｅ Ｃ Ｓ ４ ｄ １、Ｎａ 和低 温处理均 Ｃ１ 能诱 导 Ｌ ＭＴ ｂ ２基 因在二色 ３ 血草 的根和 叶 中的表 达，而 Ｐ Ｇ 处理则 抑制 了 Ｌ ＭＴ １ 、 Ｅ ｂ ２在根 和 叶 中的表 达。构建