真核表达系统的研究进展_高云
真核细胞诱导表达系统研究进展
真核细胞诱导表达系统研究进展主要内容一．选题背景二．原核生物表达真核蛋白的缺点三．常见的几种真核表达系统四．总结与展望一、选题背景•随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段，但由于通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，因此，组成型表达系统的应用受到一定限制。
•基因工程的发展使许多微量蛋白得以大量表，使许多难以制备的蛋白得以表达。
大肠杆菌Ecoli表达系统是目前为止最为有效的和方便的表达系统，可以进行许多异源蛋白的高效表达，但在进行一些蛋白的表达时，会产生许多困难。
二、原核生物表达真核蛋白的缺点1、外源蛋白在E.coli中的大量表达是以不溶性的包涵体的形式存在于细胞内，而包涵体的分离破碎通常会造成目的蛋白的失活；2、真核基因通常含有内含子，在E.coli中是不能进行正确的剪切和拼接的，因此必须表达它的cDNA序列；3、真核生物的许多蛋白都是糖蛋白，用E.coli作为表达宿主，不能对真核蛋白进行正确的糖基化等翻译后加工，很难得到有活性的真核表达系统。
三、常见的几种真核表达系统1、四环素诱导表达系统2、蜕皮激素诱导表达系统3、生物素诱导表达系统4、哺乳动物细胞表达系统1、四环素诱导表达系统此系统的作用依赖于四环素调控的反式作用因子(tTA/rtTA)和反式作用因子依赖的启动子两个成分。
四环素反式激活蛋白(tTA)是一个包含大肠杆菌TN10四环素耐药操纵子阻遏物和单纯疱疹病毒p16蛋白(VP16)C端部分的融合蛋白,tTA依赖启动子由融合有RNA聚合酶Ⅱ启动子的四环素操纵子(tet O)基因序列构成,这种融合使真核细胞中的tet阻遏物成为很强的翻译激活物。
作用机理：在缺乏四环素及其衍生物的条件下tTA与tetO序列结合，使tTA依赖启动子的转录过程被激活；而在存在四环素及其衍生物的条件下，tTA无法与其靶位点相互作用，转录也就无法进行。
重组蛋白真核表达系统构建流程
重组蛋白真核表达系统构建流程蛋白质是生物体内具有重要生物学功能的分子，它们由氨基酸组成，对细胞的结构和功能起着重要的调控作用。
在生物科学研究和生物制药工业中，重组蛋白质的生产和表达是一个重要的研究领域。
真核系统是重组蛋白质表达的一个重要平台，它具有许多优点，如能够实现复杂的蛋白修饰和折叠等。
因此，构建真核表达系统是生物科学研究和生物工程应用中的一个重要课题。
一、选取重组蛋白质的编码序列在构建真核表达系统之前，首先需要选取重组蛋白质的编码序列。
这一步骤通常是通过将目标蛋白质的编码基因进行克隆和序列分析来完成的。
在进行基因克隆过程中，需要选择适当的限制性内切酶和载体，构建一个含有目标基因的重组质粒。
同时，对目标基因的序列进行分析可以帮助确定转录和翻译起始位点、信号肽序列、保守结构域等信息，这些信息对于真核细胞的表达和翻译过程具有重要意义。
二、选择适当的真核表达宿主真核表达系统可以选择多种宿主来进行表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母等。
在选择表达宿主时，需要考虑到宿主细胞的生长特性、表达能力、蛋白修饰能力等因素。
不同的宿主对于重组蛋白质的表达和折叠能力有所差异，因此需要根据目标蛋白质的性质和需求来选择合适的宿主。
通常来说，哺乳动物细胞系统是真核表达系统中最常用的宿主之一，它具有较高的蛋白修饰和折叠能力，适合用于表达复杂的蛋白质。
三、构建真核表达载体在选择了合适的宿主后，需要构建一个含有目标基因的真核表达载体。
真核表达载体通常包括启动子、转录终止子、筛选标记基因等功能元件。
通过将目标基因插入到表达载体中，可以实现对目标基因的调控和表达。
同时，表达载体还可以包括一些辅助元件，如信号肽、翻译起始位点、融合标签等，以提高重组蛋白质的表达水平和纯度。
四、转染或转化真核细胞在构建了真核表达载体后，需要将其转染或转化到真核细胞中。
转染是指将外源DNA通过化学方法导入到细胞内，而转化则是通过质粒介导的方式将外源DNA导入到细胞内。
真核表达系统的选择和高效表达策略
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信号肽序列
• 可供毕赤酵母选择的信号肽有外源蛋白自 身的信号肽和酵母本身的信号肽. 有些蛋白 的自身信号肽不能被毕赤酵母有效利用,可 试用甲醇酵母信号肽。目前可供选择的酵
酵母表达系统的优点此外采用诱导表达启动子可以在时间上严格控制目的蛋白的表达如gal110半乳糖诱导ph05胞外无机磷诱导和hse37温度诱导生长繁殖迅速培养周期短工艺简单生产成酵母菌用于真核基因的表达分析既具有原核表达系统生长迅速操作简单价格便宜等优点具有类似哺乳动物细胞的翻译后修饰过程因而特别适用于大量生产真核重组蛋白正是由于有这些优点使酵母功能基因组的研究得以走在生物功能基因组研究的前列是应用最为普遍的真核表达系统之一
容易实现工业化,并且不存在酿酒酵母的过度糖基化问题, 也不易产生免疫原性问题。
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巴斯德毕赤酵母表达系统
• 巴斯德毕赤酵母菌株： • 一 般 用 于 外 源 基 因 表 达 的 Pichia pastoris 菌 株 有
Y211430 ,M2C10023 , GS115 , X-33，KM71 , SMD1168 等. 根据利用甲醇的能力, 可将巴斯德毕赤酵母分为3 型: ①Mut + 型为甲醇快利用型, 此型毕赤酵母具有完整的 AOX1 和AOX2 基因, 绝大多数毕赤酵母为Mut + 表型。 ② Muts 型,此型毕赤酵母菌(如KM71) 细胞AOX2 基因编码的 醇氧化酶可产生15%AOX活性,为甲醇慢利用型。③Mut型(如M2G10023) , 此型毕赤酵母AOX1 及AOX2 基因均 被敲除,为甲醇不利用型。研究发现, 蛋白酶缺陷型毕赤酵 母, 如SMD1163,SMD1165 和SMD1168 可有效降低外源 目的蛋白的酶解。 一般说来,蛋白胞内表达时,优先考虑用 Muts 表型,对于分泌表达,Mut+和Muts都可使用。甲醇慢 利用型有时比Mut+ 型菌株能够达到更高的表达量。
原核真核启动子及BL21相关知识
感受态BL21、BL21(DE3)及BL21(DE3)pLysSBL21没有T7 RNA聚合酶基因, 因此不能表达T7启动子控制的目的基因, 但是可以表达大肠杆菌启动子lac、tac、trc及trp控制的基因。
BL21(DE3)是λDE3溶原菌，带有T7 RNA聚合酶，可用于表达T7启动子控制的目的基因，也可以表达大肠杆菌启动子lac、tac、trc及trp控制的基因。
BL21（DE3）pLysS含有pLysS质粒，一种与pET共存的表达T7裂解酶的质粒，可以减少目的基因的本底表达，提供更严紧的控制。
真核原核启动子原核：几个常用的启动子和诱导调控表达系统1.最早应用于的表达系统的是Lac乳糖操纵子，由启动子lacP + 操纵基因lacO + 结构基因组成。
其转录受CAP正调控和lacI负调控。
cUV5突变能够在没有CAP的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上只受lacI 的调控，因而随后得到了更广泛采用。
lacI产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因lacO 上从而阻遏转录起始。
乳糖的类似物IPTG可以和lacI产物结合，使其构象改变离开lacO，从而激活转录。
这种可诱导的转录调控成为了大肠杆菌表达系统载体构建的常用元件。
3.tac启动子是trp启动子和lacUV5的拼接杂合启动子，且转录水平更高，比lacUV5更优越。
4.trc启动子是trp启动子和lac启动子的拼合启动子，同样具有比trp更高的转录效率和受lacI阻遏蛋白调控的强启动子特性。
5.在常规的大肠杆菌中，lacI阻遏蛋白表达量不高，仅能满足细胞自身的lac操纵子，无法应付多拷贝的质粒的需求，导致非诱导条件下较高地表达，为了让表达系统严谨调控产物表达，能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq 突变菌株常被选为Lac/Tac/trc表达系统的表达菌株。
现在的Lac/Tac/trc载体上通常还带有lacIq 基因，以表达更多lacI阻遏蛋白实现严谨的诱导调控。
真核表达
• 但与此同时原核表达系统还存在许多 难以克服的缺点：如通常使用的表达 系统无法对表达时间及表达水平进行 调控，有些基因的持续表达可能会对 宿主细胞产生毒害作用，过量表达可 能导致非生理反应，目的蛋白常以包 涵体形式表达，导致产物纯化困难； 而且原核表达系统翻译后加工修饰体 系不完善，表达产物的生物活性较低。
真核表达研究进展
2014 01 11
前言
• 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来， 基因表达技术已渗透到生命科学研究的各 个领域，随着人类基因组计划的完成，越 来越多的基因被发现，其中多数基因功能 不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表 达目的基因是研究基因功能及其相互作用 的重要手段。在各种表达系统中，最早被 采用进行研究的是原核表达系统，这也是 目前掌握最为成熟的表达系统。其优点在 于能够在较短时间内获得基因表达产物， 而且所需的成本相对比较低廉。
• 为此，Gossen等构建了受四环素负调节的Tet-on 基因表达系统，该系统由调节质粒和反应质粒组 成。调节质粒中具有编码转录激活因子(fIA)的序 列，在没有四环素或强力毒素存在的情况下 tTA 可引起下游目的基因表达。随后Gossen等又对 tTA的氨基酸序列进行了改造，构建了受四环素正 调节的Tet-on基因表达系统，该系统在没有四环 素的情况下启动子不被激活，而在加入四环素或 强力毒素后目的基因高效表达。四环素诱导的基 因表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱 导表达系统，该系统具有严密、高效可控制性强 的优点。
• 由于腺病毒易于培养、纯化，宿主范围广，故采 用该类病毒构建的载体被广泛应用。但是哺乳动 物细胞内的这种同源重组效率很低，利用细菌内 同源重组法构建重组体效率会大大提高，即将外 源基因插入到腺病毒穿梭质粒中，形成转移质粒， 将其线性化后与腺病毒包装质粒共转化大肠埃希 菌。最近，人们在杆状病毒中插入巨细胞病毒的 启动子建立了高效的基因转移载体。由于杆状病 毒是昆虫病毒，在哺乳动物细胞中不会引起病毒 基因的表达，而且载体的构建容易，因而利用杆 状病毒进行基因转移为我们提供了很好的途径。
真核细胞表达系统 (自动保存的)
4000字。
技术方法类（包括分析方法类）释文提纲：（1）定义及概述（不设标题）（2）技术或方法原理（及发展历史）（3）应用及注意事项意见：基本符合百科全书的要求。
真核细胞表达系统（Eukaryotic expression system）运用基因工程技术手段，在体外将外源基因分子插入病毒、质粒等载体分子，形成新的遗传物质组合，并导入真核细胞中实现外源基因蛋白表达的技术系统。
按照宿主细胞类型，真核细胞表达系统包括酵母表达系统、丝状真菌表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
真核细胞表达系统是重组蛋白表达的有利工具，在基础科学及医药领域发挥了重要作用。
技术或方法原理（及发展历史）酵母表达系统酵母是低等的单细胞真核模式生物，已完成基因组测序，遗传背景清晰，具有生长繁殖快，成本低，易于实现高密度培养和大规模发酵的优点。
目前发展成熟的酵母表达系统主要包括酿酒酵母表达系统和毕赤酵母表达系统。
酿酒酵母在食品工业领域的使用已有数千年历史，被美国FDA确认为安全性生物。
1981年，Hitzeman等将成功将人干扰素基因导入酿酒酵母细胞，揭开了酿酒酵母表达系统的研究和应用历史，迄今已有多种外源蛋白在酿酒酵母中获得表达。
然而酿酒酵母表达系统存在缺乏强启动子，质粒易丢失，分泌效率低，且富含高甘露糖型超糖基化等不足，导致表达产物存在过度糖基化的局限性，而逐渐被巴斯德毕赤酵母等甲醇营养型酵母表达系统所取代。
巴斯德毕赤酵母来源于野生型石油酵母NRRL-Y11430，为子囊菌类单倍体酵母，富含甲醇代谢必须的醇氧化酶、过氧化氢酶、二羟丙酮合成酶的过氧化物酶系，能在以甲醇为唯一碳源的简单培养基上快速生长，属于甲醇营养型酵母的一种。
基因工程常用的毕赤酵母菌株主要包括GS115（Mut+His—）、X-33（Mut+His+）、KM71（Muts His—）、SMD1168（his4 pep4）等。
目前毕赤酵母表达系统的启动子有醇氧化酶AOX1启动子(Ellis et al., 1985)及三磷酸甘油醛脱氢酶GAP启动子，外源基因通过同源重组整合到酵母染色体基因组上,外源蛋白表达水平受甲醇或葡萄糖的严格调控。
真核表达系统
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真核表达载体
➢质粒：真核表达元件、真核抗性 ➢病毒载体：改建后
➢ SV40病毒 ➢ 腺病毒 ➢ 反转录病毒 ➢ 痘苗病毒
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病毒基因组的结构特点
➢ 病毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒 的基因组很小
➢ 病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成
TATA box TATAAAA
TBP 30,000 ~ 10bp
GC box GGGCGG
SP-1 105,000 ~ 20bp
CAAT box GGCCAATCT CTF/NF1 60,000 ~ 22bp
Octamer ATTTGCAT
Oct-1 76,000 ~ 20bp
Oct-2 53,000 ~ 23bp
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启动子
➢ 真核启动子：RNA聚合酶（Ⅱ）结合并起动转录的 DNA序列
➢ 一般包括转录起始点及其上游约100-200bp序列，包 含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件 约长7-30bp
➢ 核心启动子元件：RNA聚合酶起始转录所必需的最 小DNA序列，包括转录起始点及其上游-25/-30bp处 的TATA盒。单独起作用时只能确定转录起始位点和 产生基础水平的转录
➢ 与其序列的正反方向无关
➢ 要有启动子才能发挥作用。但增强子对启动子没 有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型 启动子的转录
➢ 增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式 调控元件一样，必须与特定的蛋白质因子结合后 才能发挥增强转录的作用
➢ 增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子 只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞 或组织中具有特异性蛋白质因子所决定的
基因表达系统研究进展
括： 大肠杆 菌 、 草 芽孢 杆 菌 、 霉菌 、 枯 链 酵母 、 乳 动 物细 胞 、 哺
昆虫杆状 病 毒 、 物乳 腺 生物 反 应器 及植 物 表达 系统 等 。 动 这 些 外源 基 因 表 达 系统 在 基 因 表达 量 、 达 产物 的分 离 纯 化 表 及 活性 、 成本 等方 面 各有 优缺 点 。
与 蛋 白之间 的相 互 作用 。 进入 后基 因时代 之 后 ， 大肠 杆 菌 首
诱 导表达 、 纯化 获得所 需 的 目的 蛋 白。 由 于细 菌 培 养操 作 简 单 、 生长 繁 殖 快 、 格 低 廉 ， 源 价 外
基 因 表达 产 物 的水 平 高 （ 大肠 杆 菌 中 目的 蛋 白 的表 达 量 如
克隆 基 因的 表达 对研 究其 所 编码 蛋 白质 的结构 与 功 能
及其 实际 应 用都 是 十 分 重 要 的 。 隆 基 因 可以 放 在 不 同的 克 宿 主细胞 中表达 ， 包括 大肠 杆 菌 、 草芽 孢杆 菌 、 枯 酵母 、 昆虫
细胞 、 培养 的哺 乳 类动 物细 胞 。 以至 整体 动 、 物 。 植 能否 使 目
了表 达 。 不容 忽 视 的是 大肠 杆 菌也 并 不是 万能 的 宿主 ． 但 有 些 蛋 白质 必 须 经 过 翻 译 后修 饰 （ 糖 基 化 、 定 位 点 的切 如 特 割 ） 能具 有 完全 的生 物活 性 ， 才 表达 这 些蛋 白质 时最 好选 择
真 核细 胞 作为 宿主 。 大 肠 杆 菌 表达 体 系 与其 他 表 达 体 系 相 比 。 有 一些 缺 具
先被 选 作研 究 蛋 白组学 、 因功 能 、 白质 网络 等 新课 题 的 基 蛋 模 型 ， 示 了 很 多基 因表 达 的未 知领 域 ， 揭 同时提 供 了更 多发
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第8卷 第4期中 华 男 科 学Vol.8 No.4 2002年8月N ational Journal of Andrology Aug.2002·综述·真核表达系统的研究进展高 云 综述;黄宇烽 审校(南京军区南京总医院生殖遗传研究室,江苏南京210002)摘要:真核表达系统具有翻译后的加工修饰体系,表达的外源蛋白更接近于天然蛋白质。
基因工程中常用的真核表达系统有:酵母表达系统、昆虫细胞表达系统及哺乳动物细胞表达系统。
甲醇酵母主要利用醇氧化酶的基因启动子在甲醇诱导下表达外源蛋白,而三磷酸甘油脱氢酶启动不需甲醇诱导,可缩短到达峰值表达的时间。
杆状病毒是昆虫细胞表达系统中最常用的表达载体,利用转座原理构建重组杆状病毒是一种有效的构建重组体的方法;杆状病毒-S2系统是最近构建的一种不裂解宿主细胞的新型昆虫细胞表达系统。
哺乳动物细胞表达系统中,腺病毒是常用的表达载体,通过细菌内同源重组和Cre/loxp系统构建重组体,可提高重组效率;利用杆状病毒将外源基因导入哺乳动物细胞,不会引起病毒基因的表达;四环素诱导表达系统是目前应用最广泛的哺乳动物细胞诱导表达系统,该系统具有严密、高效、可控性强的特点。
关键词:真核表达系统;酵母;昆虫细胞;哺乳动物细胞中图分类号:Q813 文献标识码:A 文章编号:1009-3591(2002)04-0292-03Advances in Eukaryotic Expression SystemsYun GAO,Yu-Feng HUANG(Laboratory of Reproduction&Genetics,Nanjing General Hospital of Nanjing Com mand,PLA,Nanjing,J iangsu210002,China)A bstract:The increasing popularity of eukaryotic ex pressio n systems can be attributed to their capability of perfo rming many post-transla tio nal modifications.A t present,T here mainly are three expression systems including yeast ex pressio n sy stem,insect cell ex-pression system and mammalian cell expression system.T he methylotropic yeast Pichia Pastoris usually utilizes alcohol ox idase pro-moter to drive the expression of foreign g ene.Recently,a continous fermentation has been developed in Pichia Pastoris with the glyc-eraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GA P)pro mo ter.T he baculovirus-mediated insect cell expression sy stem is considered to be safe,powerful,but cell-lytic.Baculovirus-S2system uses the popular and genetically w ell understood Drosphila S2cells which do no t appear to be lysed after infectio n.I n mammlian cell expression sy stem,recombinant adeno virus are attracting a g reat deal of attention as a hig hly efficient gene transfer vehicle.T he frequency of Ad vector rescue by homologous recombination in E.coli and Cre-medi-ated site-specific recombination is s ignificantl y higher than by homologous recombination in vivo.Tetracycline-regulatable system is a widel y us ed mammal ian cell inducible express ion system due to its high efficiency and stringency. Natl J Androl,2002,8(4):292～294Key words:Eukaryo tic expression system;Yeast;I nsect cell;M ammalian cell 自70年代基因工程技术诞生以来,基因表达技术已渗透到工业、农业及生命科学等领域,并已取得令人瞩目的成绩。
虽然原核表达技术已十分成熟,但还存在许多难以克服的缺点,如细菌产生的致热原致使表达产物难以应用于临床;目的蛋白常以包涵体形式表达,致产物纯化困难;原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性较低。
鉴于此,利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。
目前,基因工程中常用的真核表达系统有:酵母表·292·收稿日期:2001-07-06;修回日期:2001-10-13作者简介:高 云(1970-),女,江苏兴化市人,硕士研究生,从事生殖免疫学专业。
达系统、哺乳动物细胞表达系统及昆虫细胞表达系统。
1 酵母表达系统最早用于基因工程的酵母是酿酒酵母。
后来,人们又相继开发了裂殖酵母表达系统、克鲁维酸酵母表达系统、甲醇酵母表达系统等。
目前,甲醇酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统。
甲醇酵母主要有H.polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris3种,其中Pichia Pastoris应用最多。
甲醇酵母一般先在甘油中生长,培养至高密度,再以甲醇为碳源,诱导表达外源蛋白,这样可提高表达产量。
利用甲醇酵母表达外源性蛋白质,其产量较高,可达至克级。
与酿酒酵母相比,其翻译后的加工更接近于哺乳动物细胞,不会发生超糖基化[1]。
但与酿酒酵母一样,其糖基化也为高甘露糖型。
甲醇酵母的表达载体为整合型质粒。
质粒载体与酵母染色体具有同源序列,因而可整合到酵母染色体上。
在甲醇酵母醇氧化酶基因-1(AOX1)的启动子(P AOX1)作用下,外源基因得以表达。
P AOX1是一个强启动子,在以葡萄糖或甘油为碳源时,甲醇酵母中AOX1基因的表达受到抑制;而在以甲醇为惟一碳源时,P AOX1可被诱导激活,因而外源基因可在它的控制下表达。
利用P AOX1表达外源蛋白时,需很长时间才能达到峰值水平,且甲醇是化工产品,不利于表达产物应用于人体。
利用三磷酸甘油醛脱氢酶(GA P)启动子替代P AOX1,不失为一个很好的方法[2]。
GA P启动子不需甲醇诱导,且可缩短外源蛋白到达峰值水平的时间。
将目的基因多拷贝整合入甲醇酵母染色体,可提高外源蛋白的表达水平。
目前,将质粒载体转入酵母菌的方法有原生质体转化法、电击法及氯化锂法等,而原生质体转化法有利于目的基因多拷贝整合到染色体中。
Scorer等[3]介绍了一种利用G418筛选多拷贝整合重组子的方法。
他们将插入neo基因的表达载体转化入酵母菌,只有多拷贝整合的转化酵母菌才能在高浓度的G418培养基上生长。
在甲醇酵母表达载体中引入核糖体DNA重复序列,亦可构建多拷贝整合型载体[4]。
外源蛋白分泌到胞外,一方面有利于产物的提取,另一方面可减轻宿主细胞的代谢负荷。
为了提高外源蛋白的分泌水平,可在表达载体中加入分泌信号序列。
分泌信号可以是外源蛋白质本身的信号序列,也可为酵母菌的同源信号序列。
因甲醇酵母只能识别很少的外源蛋白信号序列,所以更多的是利用酵母的同源信号序列,如来自Pichia Pastoris的酸性磷酸酶信号序列(PHO1)和酿酒酵母的α交配因子信号序列[5]。
为了减少宿主细胞对外源蛋白的水解作用,一般用水解酶缺陷型受体菌。
2 昆虫细胞表达系统杆状病毒表达系统是最常用的昆虫细胞表达系统,该系统通常以苜蓿银纹夜蛾杆状病毒(AcN PV)作为表达载体。
A cN PV感染昆虫细胞后,在感染的晚期,核多角体基因可编码产生多角体蛋白,多角体蛋白包裹病毒颗粒可形成包涵体。
多角体基因启动子具有极强的启动蛋白表达能力,常被用来构建杆状病毒转递质粒。
基本方法是:将多角体基因的启动子组装入质粒,在其下游插入多角体基因的两端侧翼序列,再在侧翼的中间加入多克隆位点。
克隆入外源基因的转递质粒与野生型AcNPV共转染昆虫细胞后,可发生同源重组,外源基因插入到野生型病毒的相应位置。
重组杆状病毒多角体基因被破坏后,在感染细胞中不能形成包涵体,利用这一特点,可挑选出含重组杆状病毒的昆虫细胞。
通过这种方法获得重组体的概率仅为0.1%～1.0%,且载体构建时间长,一般需要4～6周。
Luckow等[6]利用转座原理构建重组杆状病毒,可提高重组率。
这种构建方法需Bacmid、供体质粒和辅助质粒参与。
Bacmid是一种杆状病毒穿梭载体,包括卡那霉素抗性基因(Kan r)和复制子(mimi-F),复制子能使Bacmid在大肠埃希菌中低拷贝地复制和稳定分离。
它还包括来源于puc质粒的LacZα肽段编码基因,在LacZα的N端是转座子T n7的靶位点att-T n7。
供体质粒组装有T n7的左右两臂序列,两臂之间为多角体蛋白基因的启动子,启动子下游插入外源基因,供体质粒还带有庆大霉素抗性基因(tet r)。
辅助质粒携有四环素抗性基因和编码转座酶的基因。
将供体质粒、Bacmid和辅助质粒共转染大肠埃希菌,供体质粒中的外源基因在辅助质粒编码的转座酶作用下,通过转座作用插入到Bacmid的att-Tn7的位点区,从而得到重组Bacmid。
当含有外源基因的Bacmid转染昆虫细胞后,外源基因得以表达。
通过转座作用构建重组体,时间缩短为7～10d,由于转座过程和重组体的筛选均是在大肠埃希菌中进行,所以操作简便。
杆状病毒表达系统的外源蛋白只有少部分是分泌性的,而大部分是非分泌性的。