真核生物表达系统汇总
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哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区
BGH SV40 late
TK SV40 early Hep B
来
源
牛生长激素 猿猴病毒40晚期基因 单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
乙肝表面抗原
效率
3 2 1.5 1 1
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（3）选择标记
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b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。
c、博来霉素抗性基因：
d、HPH基因：该基因编码潮霉素B磷 酸转移酶
1、瞬时表达：转染的DNA未与宿主 染色体整合，不能随宿主基因组的复 制而扩增，只能在细胞内维持2~3天 2、稳定表达：转染的DNA与宿主染 色体整合，能随宿主基因组的复制转 录和翻译，并被稳定遗传。
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五、外源基因在真核细胞中表达产物 的鉴定和纯化
mRNA的鉴定
蛋白产物鉴定
1)药物选择标记基因
a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉
素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。
转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
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第一节 概述
在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质
往往只能在真核细胞表达系统中才 能获得有活性的表达产物。其原因
有：
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1、真核蛋白在原核宿主中不稳定
2、通过突变研究基因表达产物功能区 及关键位点
3、制备过量表达产物用于结构分析
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外源基因导入真核细胞的基本方法
病毒感染 化学法 转染
物理法
DEAE葡聚糖法 磷酸钙共沉淀法 脂质体介导法 醋酸锂法 电穿孔法
显微注射法
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三、外源基因在真核细胞中表达的主 要方式
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实例：组织血纤维蛋白溶酶原激活 因子(tPA)、红细胞生成素(EPO)、人 DNA酶。在大肠杆菌中表达tPA时， 产生错折叠和非糖基化，而在酵母 中表达tPA产生过糖基化，二者的产 物都没有生物活性。
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分泌型哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞表达系统可以通过设计，使外 源重组蛋白直接分泌到培养基中。这个重组表达 单位包括N末端的信号肽，其作用是起始新生肽 链插入到内质网中，此信号肽在分泌过程中被切
除，从而产生具正确N端的重组蛋白质。从内质 网到高尔基体再到细胞外空间的分泌过程产生糖 基化和防止蛋白被胞内蛋白酶水解。分泌过程也 使蛋白质二硫键正确配对和正确折叠。
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第二节外源基因在哺乳动物细胞中表达 一、哺乳动物细胞表达载体
（一）质粒型载体：通过对细菌质粒改造 获得。一般为在原质粒的基础上，插入了 一些病毒或其它一些物种及人的基因表达 调控序列。 1、哺乳动物细胞质粒表达载体的结构
猿猴病毒40早期基因 腺病毒主要晚期启动子 小鼠β－珠蛋白基因
强度
40～160 4 2 1.1 1 0.4
0.2
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（2）多聚腺苷酸化信号（加尾信号）：所 有真核细胞mRNA3ˊ末端都具有Poly(A)结构， 多腺苷酸化信号一般由位于多腺苷酸化位点 上游11～30核苷酸的保守序列AAUAAA和一 个下游的GU或U富含区组成，
0~60% ＋/－
－ ＋/－ ＋/－ － － －
0~10%
＋/－ ＋ ＋ ＋/－ ＋ ＋ －
0～30%
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
0~1%
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
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二、真核细胞表达外源基因的意义
研究基因表达产物的功能 生产有生物活性的蛋白质
1、将目的基因导入各种细胞中，观察 表达产物对细胞活动的影响从而推论其 功能特征
2、表达出来的蛋白质不能有效、正 确的折叠及二硫键配对错误
3、缺乏信号肽切除、糖基化、磷酸 化和羧化等翻译后修饰以及对原核 细胞有毒性。
2020年种类及优势
不同表达系统蛋白质表达及翻译后修饰情况的比较
产率 蛋白酶消化
糖基化 分泌 折叠
磷酸化 酰基化 酰胺化
大肠杆菌 酵母细胞 昆虫细胞 哺乳动物细胞
mRNA的鉴定：印迹杂交或反转录PCR
蛋白产物鉴定：免疫印迹或电泳
提取方法有：沉淀法、电泳法、层析法 等
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哺乳动物细胞表达系统
哺乳动物细胞表达系统是生产天然蛋白 的理想表达系统，是目前应用最广泛的动 物细胞表达系统。其优点和缺点都极其显 著。产物的抗原性、免疫原性和功能与天 然蛋白质最接近，糖基化等后加工最精确。 一般会产生正确加工的、有活性的蛋白。
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哺乳动物细胞表达体系的优点
• 哺乳动物细胞表达体系的种类和数目已经 发展很快。
• 哺乳动物细胞表达体系有很多其他体系不
能与之相比的优势。它具有复杂的翻译后
加工系统，糖基化以及二硫键在合成和分
泌过程中自然而然的正确形成。哺乳动物
细胞具有产生正确折叠和完全生物活性的
蛋白质。
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但该表达系统的表达水平较低、培养基 昂贵、生长缓慢、含有过敏物质等缺点在
实际应用过程中较难避免。哺乳动物细胞
表达系统通常用来生产用常规方法无法获 得的真核细胞蛋白。如EPO，TNF受体，
基因工程单抗等。
CHO（中国仓鼠卵巢）是目前重组糖蛋 白生产的首选体系。
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典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺
式作用元件：
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（1）启动子
常用的启动子种类及其各自的强度
启动子
来
源
EF －1 CMV
RSV SV40 later
SV40 early Adeno major late β－globin
人延长因子1基因 人巨细胞病毒立早基因
劳斯肉瘤病毒LTR 猿猴病毒40晚期基因
真核细胞表达系统(干货分享)
真核细胞表达系统自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。
并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。
随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现,其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段.在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。
该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体（一般为质粒)转化细菌（通常选用的是大肠杆菌）,通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白.其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉.但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是:①根据原核生物蛋白与靶DＮＡ间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制；...文档交流仅供参考...②能诱导基因高效表达,可达105倍，为其他系统所不及；③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关"，还可人为地调控基因表达量。
因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。
目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统....文档交流仅供参考...1、酵母表达系统最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母,后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。
真核细胞表达系统 (自动保存的)
4000字。
技术方法类（包括分析方法类）释文提纲：（1）定义及概述（不设标题）（2）技术或方法原理（及发展历史）（3）应用及注意事项意见：基本符合百科全书的要求。
真核细胞表达系统（Eukaryotic expression system）运用基因工程技术手段，在体外将外源基因分子插入病毒、质粒等载体分子，形成新的遗传物质组合，并导入真核细胞中实现外源基因蛋白表达的技术系统。
按照宿主细胞类型，真核细胞表达系统包括酵母表达系统、丝状真菌表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
真核细胞表达系统是重组蛋白表达的有利工具，在基础科学及医药领域发挥了重要作用。
技术或方法原理（及发展历史）酵母表达系统酵母是低等的单细胞真核模式生物，已完成基因组测序，遗传背景清晰，具有生长繁殖快，成本低，易于实现高密度培养和大规模发酵的优点。
目前发展成熟的酵母表达系统主要包括酿酒酵母表达系统和毕赤酵母表达系统。
酿酒酵母在食品工业领域的使用已有数千年历史，被美国FDA确认为安全性生物。
1981年，Hitzeman等将成功将人干扰素基因导入酿酒酵母细胞，揭开了酿酒酵母表达系统的研究和应用历史，迄今已有多种外源蛋白在酿酒酵母中获得表达。
然而酿酒酵母表达系统存在缺乏强启动子，质粒易丢失，分泌效率低，且富含高甘露糖型超糖基化等不足，导致表达产物存在过度糖基化的局限性，而逐渐被巴斯德毕赤酵母等甲醇营养型酵母表达系统所取代。
巴斯德毕赤酵母来源于野生型石油酵母NRRL-Y11430，为子囊菌类单倍体酵母，富含甲醇代谢必须的醇氧化酶、过氧化氢酶、二羟丙酮合成酶的过氧化物酶系，能在以甲醇为唯一碳源的简单培养基上快速生长，属于甲醇营养型酵母的一种。
基因工程常用的毕赤酵母菌株主要包括GS115（Mut+His—）、X-33（Mut+His+）、KM71（Muts His—）、SMD1168（his4 pep4）等。
目前毕赤酵母表达系统的启动子有醇氧化酶AOX1启动子(Ellis et al., 1985)及三磷酸甘油醛脱氢酶GAP启动子，外源基因通过同源重组整合到酵母染色体基因组上,外源蛋白表达水平受甲醇或葡萄糖的严格调控。
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体真核细胞，表达载体1、pCMVp-NEO—BAN载体特点：该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对,主要由CMVp启动子、兔β—球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.更重要的是,由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选,可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点.注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector）特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白,在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外, 载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子，Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点：pEGFP—Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV 启动子驱动下,在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.此外, 载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
真核生物基因表达
真核生物的基因表达调控染色质基因激活转录和转录后加工翻译和翻译后加工一、染色质水平基因表达调控（一）染色质结构与功能：常染色质（euchromatin）：，对DNase I敏感，DNA可降解为约200 bp 或其倍数的片断；基因表达处于活性状态。
异染色质（heterochromatin）：结构高度致密处于凝聚状态的染色质，对DNase I不敏感。
基因表达活性处于阻遏状态。
组成性异染色质：所有细胞，整个细胞周期都存在的异染色质。
其DNA不含基因，因而一直保持凝聚状态。
兼性异染色质（facultative heterochromatin）：在特定细胞，生长发育的特定阶段，由常染色质凝聚转变成的异染色质。
（二）染色质重塑：染色质重塑（chromatin remodeling）：与转录相关的染色质局部结构的改变称之。
主要有：核小体重塑、DNA甲基化、组蛋白共价修饰。
1、核小体重塑：（nucleosome remodeling）核小体重塑：ATP依赖性酶蛋白复合体参与的核小体的移位、替换和去组装改变。
核小体重塑过程：基因活化蛋白结合；ATP依赖性酶蛋白复合体结合转录活性区；ATP依赖性酶水解A TP，提供能量；移去或替换核小体。
2、DNA的甲基化：常见真核生物DNA5’-CpG-3’序列，即CpG岛(CpG-rich islands)胞嘧啶第5位C被甲基化。
甲基化程度使DNA结构稳定。
甲基化程度与基因表达活性呈反比关系。
3、组蛋白共价修饰:使组蛋白与DNA双链的亲和力改变，染色质的局部结构改变。
共价修饰方式：乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。
最常见：乙酰化和甲基化。
3、组蛋白共价修饰:使组蛋白与DNA双链的亲和力改变，染色质的局部结构改变。
共价修饰方式：乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。
最常见：乙酰化和甲基化。
组蛋白的乙酰化与去乙酰化酶：组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyl transferases HATs ) 组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase HDAC）修饰位点：核心组蛋白外周结构域，氨基末端Lys残基的NH3。
真核表达系统
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真核表达载体
➢质粒：真核表达元件、真核抗性 ➢病毒载体：改建后
➢ SV40病毒 ➢ 腺病毒 ➢ 反转录病毒 ➢ 痘苗病毒
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病毒基因组的结构特点
➢ 病毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒 的基因组很小
➢ 病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成
TATA box TATAAAA
TBP 30,000 ~ 10bp
GC box GGGCGG
SP-1 105,000 ~ 20bp
CAAT box GGCCAATCT CTF/NF1 60,000 ~ 22bp
Octamer ATTTGCAT
Oct-1 76,000 ~ 20bp
Oct-2 53,000 ~ 23bp
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启动子
➢ 真核启动子：RNA聚合酶（Ⅱ）结合并起动转录的 DNA序列
➢ 一般包括转录起始点及其上游约100-200bp序列，包 含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件 约长7-30bp
➢ 核心启动子元件：RNA聚合酶起始转录所必需的最 小DNA序列，包括转录起始点及其上游-25/-30bp处 的TATA盒。单独起作用时只能确定转录起始位点和 产生基础水平的转录
➢ 与其序列的正反方向无关
➢ 要有启动子才能发挥作用。但增强子对启动子没 有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型 启动子的转录
➢ 增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式 调控元件一样，必须与特定的蛋白质因子结合后 才能发挥增强转录的作用
➢ 增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子 只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞 或组织中具有特异性蛋白质因子所决定的
真核细胞表达系统
真核细胞表达系统常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。
简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。
1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。
甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。
甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。
大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。
甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。
2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。
杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。
杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。
目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。
与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。
虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。
哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。
真核表达系统与原核表达系统比较
系统又分为毕赤酵母表达和酿酒酵母表达。针对真核表达系统来说，哺乳动物细胞和酵母表达较为常用。
针对其各自的优缺点，如下：
真核系统和原核系统各自优缺点：
表达系统
系统优缺点
系统蛋白表达方式 优点
缺点
表达的蛋白活性高， 瞬时转染
能够快速灵活的制 蛋白表达量低，大
能够表达多复杂修饰
备活性蛋白
量生产成本极高
哺乳动
的蛋白；
稳定细胞系构建 筛选出的细胞株能 细胞株筛选困难且
真 核 表 达 物细胞
需要细胞房，无菌，
够实验蛋白的大量 时间长，投入大
系统
成本投入高
生产
重组抗体表达
比普通单抗生产量 需筛选细胞株，需
有保证
耗时耗力
酵母表
与哺乳动物相比只能 毕赤酵母表达
甲醇诱导操作方面 需要时间
达系统
表达简单修饰的蛋白 酿酒酵母表达
更多蛋白表达系统比较，原理与常见问题解决和标准试验操作资料，请见： /topics/dan-bai-biao-da.html 我们会不断更新补充，欢迎收藏！
Tel: (025) 5889- 4959
Order@
不常用Biblioteka 不常用昆虫表不常用
达系统
原 核 蛋 白 大 肠 杆 菌 操作简单。表达量高；
表达系统 表达
易形成包涵体，蛋白活性物保证
Tel: (025) 5889- 4959
Order@
枯 草 芽 孢 不常用
杆菌表达
链霉菌
不常用
活性蛋白整体方案
Active Protein Solutions
活性蛋白整体方案
Active Protein Solutions
真核表达系统
充足的营养和氧源，加抗氧化剂，抗细胞凋亡基因
4. 提高表达蛋白糖基化水平
Thank You
可以保证质粒载体平均肥培到子细胞，稳定性强 拷贝数低
二、酵母表达系统
酵母人工染色体
染色体自主复制序列 着丝粒 端粒
装载片段大 稳定性差
二、酵母表达系统
在酵母中高效表达外源基因的策略
选择合适的受体细胞 提高表达载体在细胞中的拷贝数 选择强启动子 提高翻译产物的稳定性
外源基因的原核表达系统
生物与食品工程学院
外源基因的原核表达系统
一、真核细胞表达体系的特点
二、酵母表达系统
三、昆虫表达系统
四、哺乳动物细胞表达系统
一、真核细胞表达体系的特点
优点： 1. 具有翻译后加工修饰系统
二硫键、糖基化、磷酸化、
2. 可以识别内含子
3. 蛋白质折叠
氨基酸序列
哺乳动物细胞基因表达系统元件
1. 启动子
由核心启动子和上游启动子组成
2. 终止信号和 poly ( A ) 3. 剪切信号 4. 选择标记基因
四、哺乳动物细胞表达系统
提高哺乳动物基因表达效率的措施
1. 改进表达载体
启动子
2. 宿主细胞的特性 3. 抑制细胞凋亡，延长细胞周期
具有三级结构的蛋白质
一、真核细胞表达体系的特点
缺点：
1. 外源基因导入效率偏低
2. 无法有效控制外源基因整合位置和拷贝数
生物制药技术中的真核细胞表达系统介绍
生物制药技术中的真核细胞表达系统介绍真核细胞是一类具有细胞核的生物细胞，可以分为植物细胞和动物细胞。
在生物制药技术中，真核细胞表达系统被广泛应用于生产重组蛋白和制造药物。
真核细胞表达系统是指利用真核细胞作为宿主细胞的技术平台，通过转染或转化等方式将外源基因导入真核细胞，使其在真核细胞内表达特定的目标蛋白。
这种技术具有许多优势，包括蛋白质修饰、折叠和活性组装等方面的能力，能够确保生产的蛋白质具有更高的完整性和生物活性。
在真核细胞表达系统中，植物细胞和动物细胞被广泛用于生产不同类型的蛋白质药物。
植物细胞表达系统具有成本低、易于大规模培养和改造灵活等优势。
植物细胞能够进行正确的蛋白质修饰，如糖基化、磷酸化和亚硫酸酯化等，同时它们不含病原微生物，减少了潜在的传染风险。
相比之下，动物细胞表达系统则更适用于生产复杂蛋白质，如单克隆抗体和重组血液因子。
动物细胞能够进行更为复杂的蛋白质修饰，如甘露糖、胆固醇和酰基化等，从而更好地模拟人体内的蛋白质合成过程。
在真核细胞表达系统中，转染或转化是将外源基因导入宿主细胞的关键步骤。
转染是指将外源DNA通过化学物质或物理方法直接导入细胞，如利用电穿孔技术、离子复合物、脂质体或聚乙烯亚胺等。
而转化则是指通过细菌质粒或病毒载体将外源基因导入宿主细胞。
转化技术包括病毒载体介导转化、细菌质粒介导转化和转座子系统介导转化等。
一旦外源基因成功导入宿主细胞，其表达需要依赖于启动子、增强子、转录因子和调控序列等元件。
一般而言，真核细胞表达系统中最常用的启动子是多聚腺苷酸酸（polyadenylation signal）和转录因子结合位点（transcription factor binding sites）。
增强子（enhancer）可以增强启动子的活性，从而提高外源基因的表达水平。
除了基因导入和表达的技术要求，真核细胞表达系统还需要注重生物反应器的选择和细胞培养条件的优化。
对于植物细胞表达系统，传统的反应器选择包括大型容器培养（如发酵罐）和搅拌型生物反应器。
克隆表达-真核表达系统-2002
真核基因表达系统
一、概述 （一）原核表达系统的缺点 1、没有转录后加工系统，不能识别、 剪除内含子 2、缺乏翻译后加工系统，不能对翻译 的蛋白质进一步修饰加工
（二）真核表达系统的必要性及优势
1. 具转录后加工系统
2. 具翻译后修饰系统 3. 可实现真正的分泌表达
4.基因治疗
二、真核基因结构及表达调控特点
YAC:利用酵母的TEL、ARS及CEN构建的人工 染色体
结构：左臂：TEL、选择标记、ARS 、CEN、 右臂：TEL、选择标记
特点：容量大（50-1000kb），减少克隆数
稳定性差，不易分析
（二）受体细胞
1、啤酒酵母：较早使用，了解清楚
表达量较低
过量糖基化
转化子不稳定
2、毕赤酵母：新发展的酵母受体细胞
转录水平调控
• 顺式调控因子(cis-acting factor)：结构基因 周围能与特异转录因子结合而影响转录的 DNA序列，主要包括启动子、增强子、沉寂 子
• 反式作用因子(trans-acting factor):由位于不 同或相同染色体上相距较远的基因所编码的 蛋白质因子，通过与顺式调控元件和RNA 聚合酶的相互作用而调节基因转录活性。
• 酵母着丝粒区段 (cEN) ：增加转化子稳定 性
3、类型
• 酵母克隆载体：YIP、YRP、YEP
• 酵母表达载体：含酵母启动子 • YAC
酵母克隆载体的构建
酵母表达载体
含酵母启动子 穿梭载体(shuttle
vector)： 既可以携 带外源基因在原核细胞中复制，又 可以使其在真核细胞中表达的载体。 种类：啤酒酵母表达载体 毕赤酵母表达载体
（四）重组载体导入细胞的方法---转染