真核生物之酵母表达系统共44页文档
酵母表达载体的构件
各个外显子
终止密码子
真核基因的一般结构
真核生物基因表达过程示意图
真核生物基因的结构特点
真核生物结构基因示意图
可见，真核生物基因的转录和翻译具有时间 和空间上的分隔。上述真核生物基因转录后 的剪切、拼接和转移等过程，都需要有调控 序列的调控，这种调控作用是原核生物所没 有的。
产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋
白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。因此大肠杆菌
是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。
真核基因在大肠杆菌中表达体系的不足：
1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。 细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含 有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基 因mRNA稳定性。 4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰 （正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞 中并不存在； 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分 子，并把它们降解掉。
统，需要构建不同的表达载体。克隆基因在不同的系
统中表达成功的把握性，取决于我们对这些系统中宿
主基因表达调控规律的认识程度。
人类对大肠杆菌经过长期的研究，对其特性和遗传背
景了解得最清楚，大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖
快、价格低廉，人们用大肠杆菌用外源基因的表达工
具已有二十多年的经验积累，大肠杆菌表达外源基因
第十一章
克隆基因在真核生物中的表达
真核表达系统是指利用真核生物细胞作为外源基因 表达宿主的一类基因表达系统，常用的真核系统包 括酵母、丝状真菌、昆虫类、植物和哺乳动物细胞 等表达系统。 本章主要是关于酵母表达系统。
真核细胞表达系统
利用PAXOI表达外源蛋白时,一般需很长时间才能达到峰值水平，而甲醇是高毒性、高危险性化工产品。使得实验操作过程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生产。因此那些不需要甲醇诱导的启动子受到青睐包括GAP、FLD1、PEX8、YPTI等多种。利用三磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子代替PAXOI，不需要甲醇诱导。培养过程中无需更换碳源，操作更为简便，可缩短外源蛋白到达峰值水平的时间。
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是：
①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制；
②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及；
③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。
关键词：细胞系统真核细胞表达系统酵母表达系统酵母虫细胞哺乳动物哺乳动物细胞
自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就 。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
酵母表达系统
Buffer B: 40% (w/v) Polyethylene glycol 1000 (Sigma), 0.2 M Bicine, pH 8.35
19
pAO815和pPIC9K 在
5 AOX1
Bgl II双切：
Bgl II
在5AOX1位点和
3AOX1双交换，替
换掉了宿主的AOX1
基因，
gene
转化后GS115产生
AOX1
His +/Muts
His4
3AOX1 His4
20
21
技术路线
选择合适的内切酶位点 将基因插入载体
注:pAO815 和pIC9K是穿梭载体, 可在 大肠杆菌中操作
grow at 30°C to an OD600 of 0.5 to 0.8. 4. 3000 x g 收集细胞， 用50 ml of Buffer A洗细胞，
室温. 5. 细胞悬浮在 4 ml of Buffer A 中，分装成0.2 ml于灭
菌的管中， 每管加 11 μl DMSO（-70度） ，混匀， 液氮快速冷冻， -70°C保存。
Alcohol oxidase ,醇氧化酶, 将甲醇氧化成甲醛 • 通过高表达来补偿酶活性不足,因此有强启动子
AOX1 是主要的酶 受甲醇严格控制 启动子用来驱动外源基因表达
AOX2 利用甲醇的能力低
生长慢
7
histidinol dehydrogenase gene (his4)
酵母表达系统2010
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
表达载体构建 大肠杆菌转化 重组表达载体的大量抽提及其线性化 酵母转化 转化子筛选 转化子表型鉴定 诱导表达 外源蛋白的分离纯化 外源蛋白的PAGE电泳、序列分析及活性检测
4.2乳酸克鲁维亚酵母表达系统
表达载体：整合体型载体 附加体型载体：1.胞质线性双股DNA杀伤粒 2.含有乳酸克鲁维亚酵母ARS序列 3.稳定高拷贝数 启动子：LAC4 乳糖作为唯一的能源和炭源
成功表达的外源蛋白实例：人血清蛋白和白细胞介 素1β
乳酸克鲁维亚酵母表达系统的独特优点：
4.不同酵母表达系统的特点
4.1酿酒酵母表达系统
表达载体：自主复制型和整合型 筛选标记: LEU2、URA3 启动子： PGK1、 PHO5、CUP1
成功表达的外源蛋白实例：人重组干扰素
一种常用的酿酒酵母表达载体结构图
酿酒酵母表达系统的主要不足：
A.分泌能力低 B.不能使异源蛋白正确糖基化 C.所表达的蛋白质的C-末端被截短
A.可以高密度发酵； B.不需要甲醇防爆装置； C.工业化生产时不降低生产率及酵母菌的再 繁殖能力。
4.3甲醇营养型酵母表达系统
甲醇作为唯一的能源和炭源 表达载体：整合体型载体 筛选标记：HIS4 启动子：AOXI 作为分泌型表达时，外 源基因需要接上一段信号 肽序列
我国酵母表达载体产品结构分析
酵母表达系统
陈茜 2012.12.16
Concept
1
酵母表达系统的产生
2
3 4 5
酵母表达系统的组成 主要酵母表达系统 不同酵母表达系统的特点
酵母表达系统的方法
1.酵母表达系统的产生
基因工程技术的发展为用微生物合成 和生产外源蛋白展示出广阔的前景。长期 以来，人们用大肠杆菌作为宿主表达了多 种蛋白。
酵母表达系统
酵母表达系统基因表达是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术制备各种目的基因的重组蛋白质，在分析基因的表达与调控、基因的结构与功能、基因治疗以及生物制药等领域均取得了令人振奋的成果。
其中，酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。
1、酵母表达系统的特点酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。
酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。
某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。
应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。
解决内部降解的方法有三：一是在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物，通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用；二是将培养基的pH值调成酸性(酵母可在pH3.0~8.0的范围内生长)，以抑制中性蛋白酶的活性；三是利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。
另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。
因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。
2、常用酵母表达系统(宿主-载体系统)（1）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。
因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。
酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。
真核表达系统
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真核表达载体
➢质粒：真核表达元件、真核抗性 ➢病毒载体：改建后
➢ SV40病毒 ➢ 腺病毒 ➢ 反转录病毒 ➢ 痘苗病毒
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病毒基因组的结构特点
➢ 病毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒 的基因组很小
➢ 病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成
TATA box TATAAAA
TBP 30,000 ~ 10bp
GC box GGGCGG
SP-1 105,000 ~ 20bp
CAAT box GGCCAATCT CTF/NF1 60,000 ~ 22bp
Octamer ATTTGCAT
Oct-1 76,000 ~ 20bp
Oct-2 53,000 ~ 23bp
11
启动子
➢ 真核启动子：RNA聚合酶（Ⅱ）结合并起动转录的 DNA序列
➢ 一般包括转录起始点及其上游约100-200bp序列，包 含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件 约长7-30bp
➢ 核心启动子元件：RNA聚合酶起始转录所必需的最 小DNA序列，包括转录起始点及其上游-25/-30bp处 的TATA盒。单独起作用时只能确定转录起始位点和 产生基础水平的转录
➢ 与其序列的正反方向无关
➢ 要有启动子才能发挥作用。但增强子对启动子没 有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型 启动子的转录
➢ 增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式 调控元件一样，必须与特定的蛋白质因子结合后 才能发挥增强转录的作用
➢ 增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子 只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞 或组织中具有特异性蛋白质因子所决定的
真核细胞表达系统
真核细胞表达系统常用的真核表达系统有酵母、杆状病毒／昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。
简而言之，酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，生产成本低，但加工修饰体系与哺乳动物细胞不完全相同；哺乳动物细胞产生的蛋白质更接近于天然蛋白质，但其表达量低、操作烦琐。
1.酵母表达系统最早应用于蛋白表达的酵母是酿酒酵母，后来相继出现其他种类酵母，其中甲醇酵母表达系统应用最广泛。
甲醇酵母的表达载体含有大肠杆菌复制起点和筛选标志，可在大肠杆菌大量扩增。
甲醇酵母表达载体中含有与酵母染色体中同源的序列，容易整合入酵母染色体中。
大部分甲醇酵母的表达载体中都含有醇氧化酶基因-1(AOX1)，在强启动子作用下，以甲醇为唯一碳源的条件下诱导外源基因表达。
甲醇酵母表达蛋白一般需很长时问才能达到峰值水平，实验操作过程中有甲醇毒性和一定安全风险。
2.昆虫细胞表达系统杆状病毒载体广泛应用于培养的昆虫细胞中指导外源基因的表达，其中大多含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)中的多角体启动子。
杆状病毒系统蛋白表达量很高，而且大部分蛋白质能保持可溶性。
杆状病毒基因组较大(130kb)，可容纳大的外源DNA片段；杆状病毒启动子在哺乳动物细胞中没有活性，安全性较高。
目前常用的是以位点特异性转位至大肠杆菌中增殖的杆状病毒穿梭载体，能快速有效地产生重组杆状病毒。
与通过外源基因重组在昆虫细胞中产生杆状病毒重组体相比，大大简化了操作步骤，缩短了鉴定重组病毒的时间，适于表达蛋白突变体以进行结构或功能的研究。
3.哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞能够指导蛋白质的正确折叠，它所表达的真核蛋白通常能被正确修饰，在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质，几乎都能在细胞内准确定位，在医学研究中得到广泛应用。
虽然哺乳动物细胞表达比大肠杆菌表达难度大，更耗时，成本更高，但是对于熟悉细胞培养的研究人员表达小到中等量的蛋白非常实用。
哺乳动物细胞表达载体包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等。
真核生物之酵母表达系统
3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达
甲醇酵母系统宿主
二大宿主系统主要特点
项目 最适温度 最适pH值 甘油阻遏 毕赤酵母 30℃ 4.5 是 汉森酵母 37℃ 4.5 否
糖基化
高密度发酵
部分过度
100g/L
较正常
100g/L
甲醇酵母系统宿主
二大宿主系统主要选择标记
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL10 Promoter
GAL80
GAL4
UAS
GAL1
GAL7
GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
3）pho4TS-PHO5启动子
低温诱导、磷酸盐抑制 A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录
宿主株:GS115、KM71
可插入位点： 5’AOX1 3’AOX1
TT
转化子： GS115:His+Mut+
KM71:His+Muts
4） 基因取代（GS115，AOX1+）
转化子：His4+Muts
汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体
高拷贝整合元件： A、高度重复序列：rDNA
提供多个整合位点
3、酿酒酵母糖基化系统
糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）
N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖
基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。
O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化
酿酒酵母糖基化特点
* 过糖基化（超糖基化修饰）：