仪器表征 - 荧光测试
荧光检测器及检测方法
第五章荧光检测器及检测方法许多化合物有光致发光现象。
化合物受到入射光的照射后，吸收辐射能，发出比吸收波长长的特征辐射。
当入射光停止照射时，特征辐射也很快地消失，这种辐射光线就是荧光。
整个电磁波范围内都可能产生这种辐射。
液相色谱中的荧光检测器仅使用吸收紫外光或可见光而发射的荧光。
利用测量化合物荧光强度对化合物进行检测的液相色谱检测器就是荧光检测器（!"#）。
第一节工作原理和仪器结构一、工作原理（一）荧光的产生从电子跃迁的角度来讲，荧光是指某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光线以后，原子中的某些电子从基态中的最低振动能级跃迁到较高的某些振动能级。
图$%&%’光能的吸收、转移和发射示意图电子在同类分子或其它分子中撞击，消耗了相当的能量，从而下降到第一电子激发态中的最低振动能级，能量的这种转移形式称为无辐射跃迁。
由最低振动能级下降到基态中的某些不同能级，同时发出比原来吸收的频率低、波长长的一种光，就是荧光（图!"#"$）。
被化合物吸收的光称为激发光，产生的荧光称为发射光。
荧光的波长总要比分子吸收的紫外光波长长，通常在可见光范围内。
荧光的性质与分子结构有密切关系，不同结构的分子被激发后，并不是都能发射荧光。
（二）定量基础在光致发光中，发射出的辐射量总依赖于所吸收的辐射量。
由于一个受激分子回到基态时可能以无辐射跃迁的形式产生能量损失，因而发射辐射的光子数通常都少于吸收辐射的光子数，这里以量子效率!来表示：在固定的实验条件下，量子效率是个常数。
通常!小于$，对可用荧光检测的物质来说，!值一般在%&$’%&(之间。
荧光强度"与吸收光强度成正比：")!（#%"#）（!"#"$）其中，#%为入射光强度，#为透射光强度，#%"#即为吸收光强度。
透射光强度可由朗伯"比耳定律求得：$)!%&)*+#% ##)#%,"-&.%.!%&因此")!#%（$","-&.%.!%&）（!"#"-）当被分析物浓度足够低时（吸光度/%&%#），上式可简化为")-&.%.!#%!%&（!"#".）由于在实验室用仪器中，总发光量仅有某一确定的部分被检测器收集检测，当考虑了荧光收集效率’后：")-&.%.’!#%!%&（!"#"!）由上式可见，对于稀溶液，荧光强度与荧光物质溶液浓度、摩尔吸光系数、吸收池厚度、入射光强度、荧光的量子效率及荧光的收集效率等成正相关。
荧光检测实验报告
一、实验目的1. 掌握荧光检测的基本原理和实验方法。
2. 熟悉荧光光度计的操作步骤和注意事项。
3. 学习如何通过荧光光谱分析物质的性质和浓度。
4. 提高实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理荧光检测是利用物质在特定波长光照射下，吸收光能后发射出特定波长光的现象。
当分子吸收光子后，外层电子从基态跃迁到激发态，激发态的分子不稳定，会通过辐射跃迁的方式返回基态，同时发射出与激发光波长不同的光辐射，即荧光。
本实验采用荧光光度计对样品进行检测，通过测量激发光谱和发射光谱，可以确定样品的荧光特性，进而对样品进行定性和定量分析。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：荧光光度计、紫外-可见分光光度计、比色皿、移液器、烧杯、蒸馏水等。
2. 试剂：罗丹明B标准溶液、罗丹明B样品溶液、无水乙醇、氢氧化钠溶液等。
四、实验步骤1. 样品制备：将罗丹明B标准溶液和罗丹明B样品溶液分别用无水乙醇稀释至一定浓度，制备成待测溶液。
2. 激发光谱测定：a. 将待测溶液置于比色皿中，放入荧光光度计样品室。
b. 设置激发光谱扫描范围和步长，进行激发光谱扫描。
c. 记录激发光谱曲线。
3. 发射光谱测定：a. 将待测溶液置于比色皿中，放入荧光光度计样品室。
b. 设置发射光谱扫描范围和步长，进行发射光谱扫描。
c. 记录发射光谱曲线。
4. 数据分析：a. 利用Origin软件对激发光谱和发射光谱进行拟合处理，得到最佳激发波长和发射波长。
b. 根据罗丹明B标准溶液的浓度和荧光强度，绘制标准曲线。
c. 利用标准曲线对罗丹明B样品溶液进行定量分析。
五、实验结果与讨论1. 激发光谱和发射光谱：通过实验得到罗丹明B标准溶液和样品溶液的激发光谱和发射光谱。
激发光谱表明，罗丹明B在530 nm左右有较强的激发峰；发射光谱表明，罗丹明B在590 nm左右有较强的发射峰。
2. 标准曲线：根据罗丹明B标准溶液的浓度和荧光强度，绘制标准曲线。
线性回归分析结果显示，罗丹明B的浓度与荧光强度呈线性关系，相关系数R²为0.998。
多功能酶标仪中荧光检测技术介绍
荧光分析技术是一种强大的分析手段，广泛地应用在临床检验、生物学研究、农业科学、食品和环境科学中，是多功能酶标仪的重要应用，如TECAN(M1000、M200等)，Thmeral(Varioskan Flash)，Bio-tek（Synergy 4等），MD（M2、M5）都可以应用于荧光检测。
1.概述室温下，大多数分子处于基态的最低振动能级，处于基态的分子吸收能量（光能、化学能、电能或热能）后跃迁至激发态，激发态不稳定，将很快衰变到基态，以光的形式放出能量，这种现象称为“发光现象”。
分子发光包括荧光，磷光，化学发光，生物发光等。
受到光照时发光，光照切断时发光立即消失的叫荧光，光照切断时，发光逐渐变弱以致消失的叫磷光，吸收化学反应的化学能量而发光叫化学发光，由生物能转变为光辐射的称作生物发光。
由于发光物质不同荧光有分子荧光和原子荧光之分，分子荧光为带光谱，原子荧光为线光谱，通常所说的荧光为分子荧光。
通过测定所发射荧光的特性和强度，可以对物质进行定性、定量分析。
2.荧光检测技术2.1荧光强度(FI)荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这是荧光分析法是量分析的依据。
在生物学上的应用非常广泛，可以进行生物大分子定量，酶活性分析，荧光免疫分析，细胞学分析（细胞增殖，细胞毒理，细胞吸附等）和分子间相互作用。
2.1.1细胞凋亡检测Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。
Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。
但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
设计出荧光物质偶联的短肽Z-DEVD-AMC。
在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光（图1）。
荧光法测定
荧光法测定（Fluorescence Assay）荧光法测定是一种常用的分析方法，基于物质在受激发光后发射荧光的原理进行测定。
相比于其他分析方法，荧光法测定具有高灵敏度、高选择性和广泛的应用范围等优点。
本文将介绍荧光法测定的原理、仪器设备以及实验步骤。
原理荧光法测定基于物质在受激发光后发射荧光的特性，通过测量荧光的强度来确定样品中目标分析物的含量。
荧光法测定使用荧光团或荧光染料作为标记物，通过与目标分析物结合形成复合物或发生反应，从而使荧光团或荧光染料发出荧光。
荧光的强度与目标分析物的浓度成正比，因此可以通过测量荧光的强度来确定目标分析物的含量。
仪器设备进行荧光法测定通常需要以下仪器设备： 1. 荧光分光光度计：用于测量样品发射的荧光强度。
2. 激发光源：提供特定波长的激发光，使样品受激发光。
3. 荧光样品池：用于容纳荧光样品，通常是一个带有光学窗口的玻璃池。
4. 仪器控制系统：用于操控仪器设备、采集光谱数据等。
实验步骤进行荧光法测定的基本实验步骤如下： 1. 样品制备：根据需要测定的目标分析物，选择合适的样品，例如荧光标记的生物分子或荧光染料溶液。
2. 设定荧光分光光度计：将荧光分光光度计设置为适当的激发波长和发射波长。
激发波长为使样品发射荧光的波长，发射波长为测量荧光强度的波长。
3. 校正荧光分光光度计：进行背景校正，即使用无荧光样品（例如溶剂）进行测量，以消除仪器自身的荧光信号。
4. 放入荧光样品：将样品溶液放入荧光样品池中，确保样品池中的样品与光路对齐，避免样品混浊或气泡存在。
5. 测量荧光强度：逐步增加激发光的强度，记录相应的发射光强度数据。
绘制荧光光谱图。
6. 分析数据：根据实验需要，使用合适的方法对荧光光谱图进行分析，确定目标分析物的浓度或其他相关参数。
应用领域荧光法测定在生命科学、环境监测、医药研发等领域具有广泛的应用： - 生物学研究：荧光法测定在蛋白质定量、酶活性检测、细胞内钙离子浓度等方面有着重要的应用。
荧光光谱仪使用方法
荧光光谱仪使用方法
荧光光谱仪是一种用于测量物质荧光光谱的仪器。
以下是一般荧光光谱仪的使用方法：
1. 开机准备：打开仪器电源，预热一段时间，确保仪器稳定。
2. 样品准备：根据实验需求，将待测样品制备成适当的形态（如溶液、固体等）。
3. 仪器设置：选择合适的激发光波长和荧光发射波长范围，并设置合适的狭缝宽度、扫描速度等参数。
4. 样品测量：将样品放入荧光光谱仪的样品池中，确保样品与激发光充分接触。
启动测量程序，记录荧光光谱数据。
5. 数据分析：根据测量得到的荧光光谱数据，进行数据处理和分析，如峰值波长、荧光强度等。
6. 关机：测量完成后，关闭仪器电源，清理样品池和仪器。
具体的使用方法可能因仪器型号和实验要求而有所不同。
在使用荧光光谱仪之前，建议仔细阅读仪器的使用手册，并接受相关培训。
光催化常用表征与测试
光催化常用表征与测试光催化是一种利用光照激发催化剂表面电子的能力来促进化学反应的技术。
在光催化反应中，催化剂吸收光能，产生电子激发态，从而参与反应过程。
光催化反应具有高效、环境友好等优点，在环境净化、能源转化等领域具有广泛应用前景。
要了解光催化反应的性能和机制，需要对催化剂进行表征和测试。
下面将介绍光催化常用的表征与测试方法。
1.吸收光谱分析：吸收光谱分析是评估催化剂对不同波长光的吸收能力的方法。
通过测量催化剂在可见光或紫外光区域的吸收光谱，可以获得有关催化剂电子能级结构和光敏性能的信息。
常用的仪器有紫外可见分光光度计和光电子能谱仪。
2.表面形貌观察：催化剂的表面形貌对光催化反应活性有重要影响。
扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)可以用于观察催化剂的形貌和粒径分布。
此外，原子力显微镜(AFM)可以提供更高分辨率的表面形貌信息。
3.表面化学组成分析：催化剂的表面化学组成对其光催化性能具有重要影响。
X射线光电子能谱(XPS)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)是常用的技术，可以定量分析催化剂表面的元素组成和化学键信息。
4.光电化学测试：光电化学测试是评估光催化剂光电转换性能的关键方法。
光电池测试可以测量光催化剂的光电流和光电压，评估其光电转换效率。
这些测试可以通过改变光照强度、波长和电势等参数，来研究催化剂的光电特性。
5.动力学研究：动力学研究是评估光催化反应速率和机理的重要手段。
常用的动力学测试方法包括时间分辨吸收光谱、荧光光谱、电化学阻抗谱等。
通过对反应速率和中间产物的监测，可以揭示光催化反应的机理和动力学过程。
6.稳定性测试：稳定性测试是评估光催化剂长期运行性能的重要手段。
常用的稳定性测试方法包括循环光电流测试和长时间连续光照测试。
这些测试可以评估催化剂在长期光照条件下的稳定性和寿命。
在光催化表征与测试中，需要注意以下几点：1.样品的制备要严格控制，避免杂质对测试结果的影响。
2.测试条件的选择要合理，光照强度、波长、温度等参数需要根据具体实验要求进行优化。
pl荧光测试原理
pl荧光测试原理PL荧光测试原理一、引言PL荧光测试是一种常用的光谱分析技术，广泛应用于材料科学、生物医学、环境监测等领域。
本文将从PL荧光测试的原理出发，介绍其基本概念、仪器设备以及应用。
二、PL荧光测试的基本概念PL荧光测试是一种利用物质吸收能量后发出的荧光信号进行分析的方法。
当物质受到激发光照射后，部分激发能量被吸收，使物质内部的电子从基态跃迁到激发态。
随后，这些激发态电子会自发地跃迁回基态，释放出能量。
这种从激发态返回基态的过程就是发射光谱的基础。
三、PL荧光测试的原理1. 激发源：PL荧光测试常用的激发源包括激光器、LED等。
激发源的选择要根据被测试样品的特性和所需的测试参数来确定。
2. 激发光：激发源发出的光经过适当的光学系统聚焦到样品上。
激发光的波长和强度对荧光测试结果有重要影响，需要根据被测试样品的荧光特性进行选择。
3. 荧光信号收集：被激发后的样品会发出荧光信号，这些信号可以通过适当的光学系统收集起来。
荧光信号的收集效率对测试结果的准确性有着重要影响。
4. 荧光信号分析：荧光信号收集后，需要进行光谱分析。
这一步骤可以通过光谱仪等仪器设备实现。
光谱分析可以得到荧光信号的波长分布、强度等信息。
四、PL荧光测试的仪器设备PL荧光测试所需的仪器设备包括激发光源、样品支撑平台、光学系统和光谱分析仪等。
这些设备的选择要根据测试需求和被测试样品的特性来确定。
1. 激发光源：激发光源的选择要考虑到波长范围、输出功率、稳定性等因素。
2. 样品支撑平台：样品支撑平台要能够保持样品的稳定性，并且能够适应不同形态的样品。
3. 光学系统：光学系统包括聚焦系统、收集系统等。
聚焦系统要能够将激发光聚焦到样品上，收集系统要能够高效地收集荧光信号。
4. 光谱分析仪：光谱分析仪可以将荧光信号转化为光谱图，并提供荧光强度、波长等参数。
五、PL荧光测试的应用PL荧光测试在材料科学、生物医学、环境监测等领域有着广泛的应用。
利用荧光光谱仪进行材料表征的方法
利用荧光光谱仪进行材料表征的方法材料表征是材料科学领域中非常重要的研究方法之一。
而荧光光谱仪作为一种常用的分析仪器，可以广泛应用于材料表征的研究中。
本文将介绍利用荧光光谱仪进行材料表征的方法及其在材料科学研究中的应用。
一、荧光光谱仪的工作原理荧光光谱仪是一种基于荧光现象的分析仪器，它利用物质在受激发后发射出的荧光进行分析。
其工作原理可以简单概括为：将样品暴露在特定波长的激发光源下，样品吸收激发光能量后，部分能量被转化为荧光能量并发射出来。
荧光光谱仪通过检测样品发射的荧光光信号的强度和波长分布来分析样品的性质。
二、荧光光谱仪的材料表征方法1. 荧光光谱分析荧光光谱分析是利用荧光光谱仪测量样品的荧光光谱，通过分析荧光光谱的峰位、峰形和强度等参数，可以获取样品的结构、组成和性质信息。
例如，有机分子的荧光光谱可以用来研究分子结构、溶液浓度和化学反应等。
2. 荧光寿命测量荧光寿命是指荧光物质从受激发到发射完全衰减所经历的时间。
利用荧光光谱仪可以测量样品的荧光寿命，通过分析荧光寿命的长短和衰减过程，可以了解样品的激发态寿命、能级结构和光物理性质等。
荧光寿命测量在材料表征中广泛应用于荧光探针、生物传感器和能源材料等领域。
3. 荧光猝灭分析荧光猝灭是指荧光物质在特定条件下失去发射荧光的现象。
利用荧光光谱仪可以研究荧光猝灭现象，通过测量荧光强度的变化，可以分析样品中存在的猝灭物质、猝灭机制和猝灭效应等。
荧光猝灭分析在材料科学研究中常用于分析样品中的杂质、缺陷和表面反应等。
三、荧光光谱仪在材料科学研究中的应用1. 光电材料研究荧光光谱仪可以用于光电材料的研究，例如太阳能电池、发光二极管和光电探测器等。
通过测量材料的荧光光谱和荧光寿命，可以评估材料的光电转换效率、载流子寿命和能带结构等。
2. 生物医学研究荧光光谱仪在生物医学研究中也有广泛应用。
例如，通过荧光光谱分析可以研究生物分子的结构和功能，如蛋白质折叠和荧光探针的荧光强度变化等。
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For the peaks at 1.475 eV
(circles) and 1.496 eV (squares)
k=0.9 and 0.6.
Both exponents are below k=1, which lead us to conclude that the peaks are associated with defect related transitions.
12
K. H¨ones, E. Zscherpel, J. Scragg , S. Siebentritt, Physica B 404 (2009) 4949–4952
1.509, 1.496 and 1.475 eV and one broad peak at 1.33 eV
因为
I PL
I
K EX
Can extrapolate to determine a room-temperature bandgap value of 1.43 eV
16
二、
Raman and PL
coexistence of kesterite and disordered kesterite phases in CZTS
（ T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程： S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间窜跃→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-4～10 s ，即光照停止后，可持 S0 续一段时间。（ S0 → T1禁阻跃迁）
荧光谱在CZTS中的应用
spatially fluctuating potentials
Weekly update
王亮
1
荧光分析法
Fluorescence Analysis
第一节
分子荧光原理
Principle of Fluorescence
一、分子荧光的产生过程 二、荧光的产生与分子结构的关系
第二节 荧光谱在czts中的应用
一、荧光的产生过程
Luminescence Process of Molecular Fluorescence
l 2 l 2
蒽—乙醇溶液的吸收光谱与荧光光 谱
8
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级
至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。
内转换：同多重态电子能级中,不同能级间的无辐射能级交换
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激 发单重态的最低振动能级。
18
the observed acceptor defect with the ionization energy around 280 meV could be CuSn , ZnSn , VZn , or VSn .
19
The PL band at 1.35 eV
the kesterite CZTS
compensation of donors and acceptors
band bending
a wide range of transition energies between the defects
broad asymmetric peaks narrow peaks
asymmetric broadening of the PL peaks
1. 分子能级与跃迁
* 分子能级比原子能级复杂，分子所具有的能级数目远多 于原子能级数目。在每个分子的电子能级上，都存在振动、转 动能级；
* 基态→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一 次到位；
* 激发态→基态：弛豫过程，多种途径和方式；速度最快 、激发态寿命最短的途径占优势；
2.电子激发态的多重度
14
B
I (T )
a e( E1 / kBt ) 1
a e(E2 / kBt) 2
It results in a phonon temperature of
about 1202 K which corresponds to phonon energies of E~10 meV.
Can calculate an average optical phonon energy around 40 meV
defects of CZTS
17
Raman spectrum:
the 334.3 1/cm peak the 338.6 1/cm peak the 347.4.6 1/cm peak
disorder kesterite kesterite stanite
The PL spectrum
The PL spectrum consists of two bands at 1.27 eV and 1.35 eV.
For the third peak at 1.509 eV we observe a k value of 1.3.
A k value between 1 and 2 is typical of an excitonic transition,
at 1.509 eV to an excitonic transition
外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转
移能量的非辐射跃迁；
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间窜跃：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。
辐射能量传递过程
荧光发射：第一激发单重态的最低振动能级→基态
（ S1→ S0跃迁） 10-7～10 -9s
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态
* 大多数有机分子的基态处于单重态； * 电子激发态有单重态与三重态之分（取决于电子的自旋方向
M=2S+1，S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； * 根据洪特规则，平行自旋（三重态）比成对自旋（单重态）
稳定，因此，三重态能级比相应单重态能级低；
S0→T1 属于禁阻 跃迁，需要通过其 他途径进入，而且 进入的几率小；
3.激发态→基态的能量传递途 径
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光
磷光
系间窜越 内转换 外转换 振动弛豫
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间窜跃
S1
能
T1 T2
量
吸 收
发
射
外转换荧光Fra bibliotek发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l3
l1