CO-IP内源性试验
CO-IP后做质谱实验分组的设计
百泰派克生物科技CO-IP后做质谱实验分组的设计免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用固定在磁珠或琼脂糖树脂等基质上的特异性抗体对抗原进行小型亲和纯化的一种方法。
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种常用的鉴定蛋白-蛋白相互作用的方法，通过使用诱饵蛋白（IP中的抗原，bait protein）特异性抗体间接捕获与其结合的靶蛋白（prey protein）。
在免疫沉淀串联质谱（IP-MS）实验过程中，质谱检测环节对于实验组和对照组是一致的，其差异主要体现在IP实验环节，在进行Co-IP后做质谱实验分组的设计时，重点需要明确IP环节中的实验阳性对照和阴性对照。
对照组的设置是最关键的环节之一，控制变量是对照组设置的重要原则，在IP-MS实验设计中亦是如此。
阳性对照的目的是证实细胞裂解物中确实存在靶蛋白（IP）或者互作蛋白对（Co-IP，比如诱饵蛋白X和靶蛋白Y），即为常说的input。
可直接取抽好的蛋白溶液进行Western。
IP/Co-IP 后靶蛋白或者互作蛋白对都检测到了，为了排除假阳性的结果，还得做个阴性对照。
需要考虑到整个实验体系会出现beads、抗X抗体、诱饵蛋白X、靶蛋白Y（Co-IP）。
同时，为了避免单次实验的偶然误差，尽可能增加重复实验次数，这对于筛选出高可信度的相互作用蛋白尤为重要，并且会大大降低后期蛋白相互作用验证的工作量。
所以整体来看，增加了结果可靠性。
此外，内源性Co-IP实验分析如果最终结果为阳性，则可以证明两个蛋白之间存在相互作用；但是结果为阴性，是否两个蛋白就一定不发生相互作用了呢？也不一定。
有可能是两个蛋白是弱相互作用力，这时候可能需要交联剂协助，锁定强化弱互作蛋白；也有可能是内源蛋白表达量低，可先做过表达Co-IP作为对照。
百泰派克生物科技针对样品蛋白的提取、表达和纯化的优化方案可确保获得高质量的诱饵和猎物蛋白，为客户提供优质的免疫共沉淀法（CO-IP）结合质谱联用的蛋白互作分析服务。
解析免疫共沉淀(Co-IP)技术：深入了解蛋白质相互作用及生物药物领域的突破性进展
解析免疫共沉淀（Co-IP）技术：深入了解蛋白质相互作用及生物药物领域的突破性进展蛋白质是生物体内执行重要功能的基本分子。
它们通过相互作用形成复杂的网络，调控生物过程的发生与发展。
了解蛋白质相互作用对于揭示细胞的功能和疾病的机制至关重要。
免疫共沉淀（Co-IP）技术是一种常用的方法，通过该技术可以研究蛋白质之间的相互作用关系，并在生物药物领域取得了一系列突破性进展。
一、Co-IP技术的基本原理。
Co-IP技术基于免疫学原理，利用特异性抗体将目标蛋白质与其相互作用的伴侣蛋白质结合，并通过免疫沉淀的方式将复合物从细胞提取物中富集出来。
该技术的核心是选择合适的抗体，使其能够高效、特异性地结合目标蛋白质。
随后，通过洗涤去除非特异性结合的蛋白质，最终得到目标蛋白质及其相互作用伴侣的复合物。
二、质谱技术在蛋白质片段表征中的应用。
质谱技术在蛋白质片段的表征中具有广泛的应用，它可以帮助我们确定蛋白质的氨基酸序列，识别和定量翻译后修饰，确定蛋白质的三维结构等。
这些信息对于理解生物药物的作用机制，评估药物的有效性和安全性，以及优化药物设计都具有重要的价值。
三、突破性进展：揭示蛋白质相互作用及生物药物研发。
Co-IP技术在蛋白质相互作用研究和生物药物研发中取得了重要突破。
以下是几个关键应用领域的例子：1.研究蛋白质复合物及信号通路：Co-IP技术可以帮助鉴定蛋白质复合物中的成员和相互作用方式，从而揭示细胞内复杂的信号通路网络。
例如，通过Co-IP技术，科学家们发现了许多关键的细胞信号通路，如MAPK和PI3K/Akt通路等，为深入理解这些通路的功能和调控机制提供了重要线索。
2.鉴定潜在药物靶点：利用Co-IP技术，研究人员可以筛选和鉴定与疾病相关的蛋白质相互作用伴侣，从而发现潜在的药物靶点。
这种方法在药物研发中具有重要的意义，可以加速新药的发现和开发过程。
3.生物药物研发：Co-IP技术在生物药物研发中的应用也非常广泛。
co-ip原理
co-ip原理（一）Co-IP原理Co-IP（共份免疫沉淀）是一种分子生物学技术，可用于发现并分析蛋白质复合物的成分及其相互作用的研究。
该技术可利用抗体的特异性将目标蛋白以及其结合蛋白特异地沉淀出来，以期发现潜在的蛋白复合物和蛋白-DNA复合物。
Co-IP技术一般步骤如下：首先，研究对象物种细胞被称为特定细胞系。
根据此项实验的需要，将此特定细胞系与不同抗原复合，从而产生特异性抗体，其用于共份免疫沉淀；其次，在特定细胞系中提取出所需要分析的蛋白质组份，使用蛋白质粗提液。
其中，可根据不同的实验需要搭配合适的抗体，然后将上述蛋白质粗提液进行匹配；然后，使用车载法对所有混合的蛋白进行离散，后续可使用2D-PAGE、 Mass spectrometry等技术进行分析，在此过程中可将Co-IP实验分析出的有关不同蛋白质相互作用的信息保存；最后，将沉淀结果进行测序确定复合物成分，最终根据测序结果，能够确定不同蛋白质在体细胞中的亲缘关系，从而研究蛋白质复合物。
（二）应用Co-IP技术在蛋白质组学中有重要应用，主要用于研究蛋白复合物结构及其相互作用关系。
在此基础上，也在基因表达调控，神经元解剖结构，细胞枝法研究等生物学相关技术中获得良好的应用效果。
此外，在蛋白质组学研究方面，它可以揭示蛋白质功能以及其在相关疾病过程中的作用。
相较于抗原技术，Co-IP技术最大的优势在于，它可以检测出蛋白质相互作用的假想变化，或者检测蛋白质的更多的结构及其特定的功能，以及其在疾病发病过程中的表型变化。
此外，Co-IP技术也可以用于研究蛋白质复合物结构，和普通的蛋白质相互作用。
因此，与抗原技术相比，Co-IP技术可以检测出更多关于蛋白复合物的信息，具有更广阔的应用前景。
co-ip实验设计思路
co-ip实验设计思路
CO-IP（共免疫沉淀）是一种用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法。
在实验设计方面，以下是一些常见的CO-IP实验设计思路：
1. 选择合适的抗体：实验前需要选择适合的抗体，其中一个抗体用于沉淀目标蛋白，另一个抗体用于检测与目标蛋白相互作用的蛋白。
抗体的选择要基于其特异性和敏感性。
2. 细胞系选择：根据研究目的选择合适的细胞系。
细胞系应表达目标蛋白和可能与之相互作用的蛋白。
3. 细胞处理：细胞可以被处理以诱导或抑制蛋白的表达，或者通过转染外源基因来过表达目标蛋白。
细胞处理的方式取决于研究目的。
4. 细胞裂解：细胞应该被裂解以释放细胞内的蛋白质。
裂解可以通过低渗透压、超声波或化学物质等方法进行。
5. 免疫沉淀：使用特异性抗体将目标蛋白与其相互作用的蛋白沉淀下来。
这可以通过将细胞裂解物与抗体孵育，然后使用蛋白A/G琼脂糖或磁珠将抗体结合物沉淀下来。
6. 蛋白质检测：沉淀下来的蛋白质可以通过Western blotting或质谱分析等技术进行检测。
这将确认与目标蛋白相互作用的蛋白质。
7. 阴性对照：进行阴性对照实验以验证CO-IP结果的特异性。
可以使用非特异性抗体或与目标蛋白不相互作用的蛋白作为阴性对照。
8. 数据分析：对实验结果进行定量和统计分析，以确定目标蛋白与其他蛋白的相互作用。
以上是CO-IP实验的一般设计思路，具体实验的细节和步骤可能会根据研究目的和样本类型的不同而有所不同。
co-ip实验设计思路
co-ip实验设计思路
针对co-ip实验的设计思路，我们需要考虑以下几个方面：
1. 实验目的，首先要明确co-ip实验的目的是什么。
是为了验证蛋白质间的相互作用，还是为了确定特定蛋白质的结合伙伴？不同的实验目的会影响实验设计的方向。
2. 样本准备，在进行co-ip实验之前，需要准备好足够的细胞或组织样本。
样本的来源和处理方法会影响到实验的结果，因此需要仔细选择合适的样本来源和提取方法。
3. 抗体选择，co-ip实验需要使用特定的抗体来沉淀目标蛋白及其结合伙伴。
因此，需要选择高质量、特异性好的抗体，并进行交叉反应验证，确保其适用于co-ip实验。
4. 实验条件优化，在进行co-ip实验时，需要优化实验条件，包括洗涤缓冲液的配制、沉淀条件的确定、洗涤和溶解的次数等。
这些条件的优化对于提高实验的特异性和灵敏度非常重要。
5. 阳性对照和验证，为了验证co-ip实验的准确性，需要设计
相应的阳性对照实验，确认目标蛋白及其结合伙伴的存在。
此外，还可以使用其他方法如免疫共沉淀、蛋白质质谱等进行验证。
6. 数据分析和解释，最后，在完成co-ip实验后，需要对实验结果进行系统的分析和解释。
这包括对沉淀蛋白的鉴定、结合伙伴的确认以及可能的功能意义等方面的分析。
综上所述，co-ip实验的设计思路需要考虑实验目的、样本准备、抗体选择、实验条件优化、阳性对照和验证以及数据分析和解释等多个方面，以确保实验的准确性和可靠性。
蛋白鉴定步骤指南：IP与CO-IP实验全面解析胶点鉴定
蛋白鉴定步骤指南：IP与CO-IP实验全面解析胶点鉴定蛋白质是生物体内重要的功能分子，对于研究生物学过程和疾病机制具有重要意义。
蛋白鉴定是研究蛋白质相互作用和功能的关键步骤之一。
本文将详细介绍蛋白鉴定的胶点鉴定方法，包括免疫沉淀（Immunoprecipitation，简称IP）和共免疫沉淀（Co-Immunoprecipitation，简称CO-IP）实验的步骤和原理。
胶点鉴定的原理胶点鉴定是一种通过免疫沉淀技术来鉴定蛋白质相互作用的方法。
该方法基于抗体与目标蛋白质的特异性结合，将目标蛋白质及其相互作用的蛋白质一起沉淀下来，然后通过蛋白质分离和检测技术来鉴定这些蛋白质。
IP实验步骤样品准备：收集细胞或组织样品，并进行细胞裂解或组织破碎，得到总蛋白提取物。
抗体结合：将目标蛋白的特异性抗体与蛋白A/G磁珠结合，形成抗体磁珠复合物。
免疫沉淀：将抗体磁珠复合物加入总蛋白提取物中，使抗体与目标蛋白结合，形成免疫复合物。
洗涤：用洗涤缓冲液洗涤免疫复合物，去除非特异性结合的蛋白质。
蛋白质分离：将洗涤后的免疫复合物进行蛋白质分离，可以使用SDS-PAGE或者液相色谱等技术。
蛋白质检测：通过Western blot等方法检测目标蛋白及其相互作用蛋白的存在与表达水平。
CO-IP实验步骤样品准备：收集细胞或组织样品，并进行细胞裂解或组织破碎，得到总蛋白提取物。
抗体结合：将目标蛋白的特异性抗体与蛋白A/G磁珠结合，形成抗体磁珠复合物。
免疫沉淀：将抗体磁珠复合物加入总蛋白提取物中，使抗体与目标蛋白结合，形成免疫复合物。
洗涤：用洗涤缓冲液洗涤免疫复合物，去除非特异性结合的蛋白质。
交联：使用交联剂将免疫复合物中的蛋白质交联在一起，增强相互作用的稳定性。
蛋白质分离：将洗涤后的免疫复合物进行蛋白质分离，可以使用SDS-PAGE或者液相色谱等技术。
蛋白质检测：通过Western blot等方法检测目标蛋白及其相互作用蛋白的存在与表达水平。
COIP免疫共沉淀实验原理
COIP免疫共沉淀实验原理COIP（Co-immunoprecipitation）又称为共沉淀法，是一种常用的蛋白质相互作用研究方法。
该方法通过特异性抗体结合可以与靶蛋白相互作用的蛋白进行共沉淀，进而检测目标蛋白与其相互作用蛋白的存在。
COIP 方法可以用于研究蛋白质相互作用的结构、功能和动力学等方面。
COIP方法的原理可以总结为以下几个步骤：1.细胞裂解：首先需要获取含有目标蛋白的样品，可以是细胞裂解液或组织提取物。
样品需要经过适当的处理，最常用的是利用磷酸缓冲液含有盐洗涤细胞，从而打破细胞膜，使蛋白质裂解。
2.共沉淀试剂的制备：共沉淀试剂通常由特异性抗体与载体蛋白（如蛋白A/G或青霉素酰胺等）结合而成。
特异性抗体用于识别目标蛋白，载体蛋白则用于固定和沉淀抗体-抗原复合物。
载体蛋白通常具有亲和力，能够与抗体结合形成稳定的复合物。
3.共沉淀试剂的结合：将共沉淀试剂加入细胞裂解液中，使其与目标蛋白结合形成复合物。
目标蛋白与抗体结合后，与载体蛋白的特异性结合使复合物能够稳定。
4.免疫共沉淀：此步骤是COIP方法的核心，其目的是将目标蛋白及其相关蛋白质结合的复合物从细胞裂解液中沉淀下来。
常用的方法有加入蛋白A/G琼脂糖磁珠或微珠，使其与抗体-抗原复合物相互结合形成稳定的复合物，然后通过磁力或离心沉淀下来。
此步骤通常需要进行数次洗涤以去除非特异性结合的蛋白质。
5. 分离和分析：最后将COIP得到的蛋白复合物溶解或电泳分离，然后通过Western blot等方法检测目标蛋白及其相互作用的蛋白质。
总的来说，COIP（共沉淀法）通过特异性抗体和载体蛋白的结合形成稳定的复合物，实现了目标蛋白及其相互作用蛋白的共沉淀。
通过COIP 方法可以探究蛋白质相互作用的结构、功能和动力学等方面的研究。
IP与CO-IP实验步骤指南：从样本处理到相互作用分析
IP与CO-IP实验步骤指南：从样本处理到相互作用分析生物药物研究中，了解蛋白质之间的相互作用对于理解细胞信号传导、疾病机制以及药物研发具有重要意义。
免疫沉淀（Immunoprecipitation，简称IP）和共免疫沉淀（Co-immunoprecipitation，简称CO-IP）是常用的实验技术，用于检测蛋白质间的相互作用关系。
本文将从样本处理到相互作用分析，为您详细介绍IP与CO-IP实验的步骤与原理。
1. 样本处理在进行IP与CO-IP实验之前，样本的处理是非常重要的。
样本可以是细胞提取物或组织提取物。
以下是样本处理的步骤：1.1 细胞培养与收集。
首先，将目标细胞培养在适当的培养基中，使其达到合适的生长状态。
然后，使用适当的方法（如洗涤、剥离或裂解）收集细胞。
1.2 细胞裂解。
将收集到的细胞进行裂解，以释放细胞内的蛋白质。
常用的裂解方法包括化学裂解、机械裂解和冻融裂解等。
1.3 蛋白质浓度测定。
使用蛋白质浓度测定方法，确定裂解后样本中的蛋白质浓度。
这可以帮助您确定用于后续实验的样本量。
2. 免疫沉淀（IP）实验步骤IP实验是通过特异性抗体与目标蛋白质结合，然后利用抗体的亲和力将目标蛋白质从混合物中沉淀下来。
以下是IP实验的步骤：图1。
2.1 抗体固定。
将特异性抗体固定在适当的固相载体上，如蛋白A/G琼脂糖或磁珠。
这些抗体将与目标蛋白质结合。
2.2 样本孵育。
将裂解后的样本与固定的抗体孵育，使目标蛋白质与抗体结合。
2.3 免疫沉淀。
通过离心或磁力分离的方法，将与抗体结合的目标蛋白质沉淀下来。
这一步骤可以去除其他非特异性结合的蛋白质。
2.4 洗涤。
洗涤沉淀后的蛋白质，以去除非特异性结合的蛋白质和其他杂质。
2.5 蛋白质析出。
将洗涤后的蛋白质从固相载体上析出，以获得纯化的目标蛋白质。
3. 共免疫沉淀（CO-IP）实验步骤CO-IP实验是在IP的基础上，通过特异性抗体结合的目标蛋白质来寻找与其相互作用的蛋白质。
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准备：培养基，胰酶，PBS
铺A549细胞：
1.提前半小时照紫外，预热DMEM培养基。
2.准备3个小试管和3个玻璃吸管，待用。
从左至右：吸培养基，吹打细胞，吸培养基。
3.从37℃培养基中取出A549细胞，弃培养基，先用适量PBS洗两遍，以去掉血清（血清
会抑制胰酶反应）。
4.洗完后去掉PBS，加入预先从-20℃分装保存于4℃的胰酶，小培养基和小培养皿加入
1ml，大的加入3ml，让胰酶覆盖，立即放入37℃培养箱，消化1min（RAW消化4min，其他都1min）。
5.消化完后，立即加入2-3ml培养基终止消化，用玻璃吸管细胞吹打下来，去掉气泡，镜
下观察消化情况。
若不均匀，继续吹打。
6.把细胞吸到15ml离心管中，剩余的传代。
7.拿出EP管，吸90ul培养基+10ul细胞液，混匀（稀释10倍）。
8.计数，计算。
CO-IP: 12孔板2.5X105/ 孔，终体积1ml；6：孔板7.5X105/孔，2ml。
9.吸细胞的MIX到各个孔中，在水平台面摇动，使细胞铺匀。
镜下观察。
10.放入37℃培养箱中，15min后再次观察。
共摇四次，知道铺匀。
24h后转染：
准备：打冰，测质粒浓度，预热Opti-MED培养基。
1.标记好管子，将lip-2000一滴滴加入到（50ul/100ul,12孔板/6孔板）的Opti-MED中，
可制备mix，温浴5min；
2.质粒分别加到不同管子中的Opti-MED。
3.20min后将1分别一滴滴加入到2中。
观察铺的细胞，选择好的标记组别；弃旧培养基，用Opti-MED洗两遍。
Ctl补Opti-MED （400ul/12孔板），实验组先加200ul Opti-MED，再加混合液。
4.4-6h后换液，换成2ml DMEM(6孔板)的培养基。
次日（转染24小时后）观察细胞状态，收蛋白,每孔加60-80ul裂解液（12
孔板,120-150ul24孔板，250ul 6cm dish）
RIPA Buffer（CO-IP）：必须先配现用（半小时内）
1.基础液1ml
2.1% PIC 10ul
3.1mM PMSF（蛋白酶抑制剂）10ul
Na3VO4 10ul , NaF （磷酸酶抑制剂）2ul===1% PDIC 10ul（可加可不加）
普通lysis还需加
1mM DTT 1ul（二硫苏糖醇，破坏二硫键，所以CO-IP不加）
若为pi化蛋白还需加：
Na3VO4 10ul , NaF （磷酸酶抑制剂）2ul===1% PDIC 10ul
收蛋白：（在冰上进行）蛋白总量大于500ug才可
1.拿出培养板，观察细胞状态（预冷离心机）
2.弃培养基，用预冷的PBS（cell）洗两遍
3.加入新配的裂解液，吹下细胞。
收集到1.5ML的EP管中，静置30min（使其充分裂解）
4.12000g，15min，4℃离心3，取上清（Input：总蛋白，管底为细胞碎片）
A．洗珠子（洗两组珠子）：装珠子的管子为无RNase的，标记珠子标签，样品名称，日期
B无论什么孔板，每个样品用20ulHA/30ulFlag珠子拉。
取珠子剪枪头3000g，4℃离心30s，将珠子溶解液放回原瓶。
C.用RIPA wash buffer 400ul，重悬（弹几下），3000g4℃离心30s，再去上清；洗三遍。
（3000g不会破坏珠子）
其中一组珠子加入剩余蛋白上清共孵育1h，去掉非特异性结合的蛋白。
3000g离心2min。
另一组珠子加入蛋白抗体（按照500ug蛋白/1ug抗体（200ng/ul））的比例加入一抗（或者Igg）
1h后将离心得到的蛋白加入到用抗体预处理过的珠子中。
5.蛋白定量：
A．用单蒸水稀释4X马斯亮蓝为1X；BSA原液10ug/ul用双蒸水稀释10倍
B．取X+6个0.5ml的EP管，标记，每管加入300ul卡马斯。
C．对应管加入BSA 0-5ul，待测样品1ul，立即混匀，再加200ul到96孔板中
D．酶标仪检测：
仪器先预热10min，密码4个0，放孔板（去盖）。
编板点9格框：标准#，1,2,3 S1，S2
读板：step，595，mix5s，endpoint，start read
结果16格子
Report得结果
关闭读板结果，Yes，编名，保存结果。
终止关开关即可。
6.电源，风机，照明
7.Input变性30ug（量依据所做蛋白的丰度，30ul=V蛋白+Vlysis+Vloading；4Xloading用
lysis稀释；Vloading1X：V巯基乙醇=9:1），剩余蛋白加入珠子中用于CO-IP,将蛋白用lysis加至200ul（体积可摇起即可），4℃摇床过夜，使蛋白和珠子充分结合。
洗珠子，去掉未结合蛋白（预冷离心机，准备3d水）
8.次日4℃，3000g离心2min，收集上清备用（正常情况下上清不含目的蛋白）。
9.用3d水洗微量进样器，用进样器尽量除去上清，加入400ulRIPA wash buffer，放在
冰盒摇5min，弃上清，4℃，3000g离心30s，再洗，每次用新水，针不能混用。
重复三次。
10.变性30ul=Vlysis+V loading；4Xloading用lysis稀释；Vloading1X：V巯基乙醇=9:1
（与普通电泳一样）.在摇床上摇5min，在变性。
1000转，离心1min。
电泳：（1.5cm，15孔梳，若两个分子量近，则需两份）
Transfer：100 Transfer+200甲醇+单蒸水
Running：1:9 run：水
1.配胶分子量小，用12%，转膜用PVDF膜（先用甲醇浸泡），70V，3h。
2.转膜顺序自下而上:滤纸，再细滤纸，胶，膜，滤纸。
3.大分子量用10%，NC膜，转膜100V，1h。
（RHA100V1.5h。
小分子100V1h或者70v，3h）
4.电泳：上层胶 80V/块，下层120V/块 45min。
5.上样要记顺序
孵抗体：膜剪角，以便知道正反
封闭液：5%（5g：100ml 0.1最好，0.5和1的也可以）BSA
3%BSA+抗体：标记好比例，日期，名称
封闭1h（摇床常温）→孵一抗过夜（可回收利用）→洗ＰＢＳＴ（０.５％）３次，ＰＢＳ３次→二抗孵育１－１.５ｈ→洗ＰＢＳＴ（０.５％）３次，ＰＢＳ３次
化学发光
物品：篮子，大枪，剪刀，胶片，盒子，镊子，发光液，滤纸（洗膜上的ＰＢＳ）
ＣＯ－ＩＰ可压过夜。