10.《检验仪器维修与使用》流式细胞分析
流式细胞检测步骤
流式细胞检测步骤
流式细胞检测是一种常用的细胞分析方法，其步骤主要包括样品制备、细胞染色、细胞分析和数据分析等。
下面是流式细胞检测的一般步骤：
1. 样品制备：对待检测的细胞进行处理，如细胞培养、组织切片、外周血单个核细胞的分离等，得到单细胞悬浮液或细胞悬浊液。
2. 细胞染色：选择相应的细胞染色方法，如细胞膜荧光染色、核酸染色、细胞器标记等，以准确检测感兴趣的细胞亚群或分子表达。
3. 流式细胞仪设置：根据具体实验需求，设置流式细胞仪的参数，如激光波长、光源强度、挡光镜、滤光片等。
4. 样品注射：将细胞悬浮液或细胞悬浊液注入流式细胞仪，以逐个细胞通过检测通道。
5. 细胞分析：流式细胞仪以高速流体力学原理将细胞单个通过探测器，并同时记录细胞的光学参数，如细胞大小、形状、颜色等，以及某些特定标记的荧光信号。
6. 数据分析：根据实验需求，利用流式细胞仪软件或数据分析软件对收集的数据进行处理和分析，如细胞计数、亚群比例、荧光强度等。
7. 结果解读：根据数据分析的结果，进行相应的统计分析、结果解读和图形展示，得出实验结论。
需要注意的是，不同的实验目的和细胞类型可能需要略有差异的具体实验步骤和参数设置。
流式细胞仪检测原理
流式细胞仪检测原理流式细胞仪是一种通过激光散射和荧光检测技术，快速、精确地分析和计数细胞样本的仪器。
它在医学、生物学、生命科学等领域中广泛应用。
下面将详细介绍流式细胞仪的检测原理。
流式细胞仪的检测原理主要包括样本制备、样本注射、细胞分析、数据处理等过程。
样本制备在流式细胞仪前，我们需要对样本进行准备。
首先，我们需要用缓冲液将细胞样本稀释，避免样本过于浓缩而产生背景噪声。
其次，为了固定细胞并增强细胞荧光信号，需要对样本进行染色。
染色通常使用荧光染料，可以分别染色细胞表面和内部内容。
样本注射样本注射是指把制备好的样本注入到流式细胞仪中。
流式细胞仪中包含流动系统和光学系统。
样本通过流动系统，由注射针进入试管中，形成一条单个的细胞流，进入光学系统，待分析。
细胞分析细胞分析是利用激光散射和荧光检测技术对样本进行分析。
当激光照射到流经的细胞时，细胞散射光和荧光会激起探测器接收到的信号。
探测器可以测量散射光的强度和方向，以此确定细胞大小和形状等特征。
此外，探测器也可以检测细胞内荧光的强度和波长，以此确定细胞的荧光染色和荧光特性。
数据处理细胞分析结束后，得到的信号将被数字化并存储在计算机中，随后可以根据需要进行数据分析和统计。
流式细胞仪可以同时分析成千上万个细胞，这使得数据处理工作成为可能。
数据处理可以识别不同类型的细胞、计算每种细胞的数量、分析不同细胞的生物学特征等。
总之，流式细胞仪的检测原理是基于激光散射和荧光检测技术，通过对样本的制备、样本注射、细胞分析和数据处理等过程进行综合分析，从而精确、快速地定量和定性分析细胞样本。
实验七-流式细胞仪检测技术
实验七-流式细胞仪检测技术实验七流式细胞仪检测技术免疫细胞是一组不均一的细胞群体。
各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子，利用这些特异的表面标志，可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。
随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术（特别是荧光标记技术）的发展，以及计算机科学的应用，使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。
本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术，并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。
实验原理流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。
其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。
当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。
根据测得的散射光（scattered light ）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度(fluorescence emissions)则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。
在流式细胞仪分离装置中，返回到计算机的信号，可用来产生一种电荷，这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔，在与吸管孔的液体流相相遇时，可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。
临床医学检验技术(士)-流式细胞仪分析技术及应用(精选试题)
临床医学检验技术（士）-流式细胞仪分析技术及应用1、流式细胞仪技术中，表示细胞内颗粒复杂程度的指标是A.前向角散射光信号B.侧向角散射光信号C.自发荧光信号D.激发荧光信号E.特异荧光信号2、流式细胞仪技术中，表示细胞体积大小的指标是A.前向角散射光信号B.侧向角散射光信号C.自发荧光信号D.激发荧光信号E.特异荧光信号3、荧光染料应有较高的A.量子产额和消光系数B.吸收C.波长差D.标记染色E.荧光信号4、发射光波长与激发光波间有较大的A.量子产额和消光系数B.吸收C.波长差D.标记染色E.荧光信号5、荧光染料对488nm激发光波长有强的A.量子产额和消光系数B.吸收C.波长差D.标记染色E.荧光信号6、多参数定量测定和分选的技术称A.荧光免疫分析B.酶联免疫分析C.流式细胞免疫分析D.化学发光免疫分析E.放射免疫分析7、流式细胞仪采集的荧光信号反映A.细胞的大小B.细胞的寿命C.细胞内部结构的复杂程度D.细胞表面的光滑程度E.被染成荧光部分细胞数量的多少8、关于液流系统的鞘液，下述哪项是不正确的A.鞘液是辅助样本被正常检测的基质液B.鞘液是用来与样本作对比的C.鞘液包裹在样本流周围D.使样本保持处于喷嘴中心位置，保证检测精确性E.防止样本流细胞靠近喷孔而形成堵塞9、分选速度与细胞悬液中分选细胞的下述哪项直接相关A.细胞含量B.细胞性质C.细胞大小D.有否胞膜E.单核或多核10、流式细胞术细胞分选的技术要求包括A.分选速度B.分选纯度C.分选收获率D.分选得率E.以上均是11、AIDS免疫功能的检测最重要的检测手段是A.流式细胞术B.抗体检测C.抗原检测D.病毒学检测E.细胞数量的检测12、正常人外周血中成熟的NK细胞占A.5%B.10%C.15%D.20%E.30%13、在流式细胞仪的分选方面，以下与细胞收获率存在负相关的是A.细胞纯度B.细胞大小C.细胞自发荧光D.细胞颗粒大小E.细胞表面分化抗原14、流式细胞仪的主要组成不包括A.液流系统B.光路系统C.抗原抗体系统D.信号测量E.细胞分选15、流式细胞仪的技术特点不包括A.采用鞘流原理B.以激光做激发光源C.使用散射光检测D.检测荧光信号E.采用电阻抗及化学染色原理16、流式细胞术荧光标记不包括A.标记第一抗体B.直接免疫荧光标记法C.标记第二抗体D.间接免疫荧光标记法E.标记游离的抗原或抗体17、流式细胞术的临床应用不包括A.T淋巴细胞亚群测定B.白血病免疫分型C.弓形虫病的诊断D.原虫的研究E.细菌的检测研究。
流式细胞仪分析技术及应用
流式细胞仪分析技术及应用流式细胞术（FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。
概述流式细胞仪由液流系统、光学与信号转换测试系统和信号处理及放大的计算机系统三大基本结构组成，可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析。
一、工作原理（了解）基本组成结构1.液流系统由样本和鞘液组成。
待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的单克隆抗体染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流；鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液，其主要的作用是包裹在样本流的周围，使其保持处于喷嘴中心位置以保证检测的精确性，同时又防止样本流中细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。
2.光学系统由激光光源、分光镜、光束成形器、透镜组和光电倍增管组成。
（1）激光光源：现代流式细胞仪采用的多为气冷式氢离子激光器，常用激光束波长为488nm，15mW。
（2）分光镜：作用是反射较长波长的光，通过较短波长的光。
（3）光束成形器：由两个十字交叉放置的圆柱形透镜组成。
（4）透镜组：有3个透镜，作用是将激光和荧光变成平行光，同时除去离散的室内光。
（5）滤片：长通滤片，允许长于设定波长的光通过；短通滤片，允许短于设定波长的光通过；带通滤片，允许一定带宽的波长通过，其他波长的光不能通过。
（6）光电倍增管（PMT）：主要作用是检测散射光和荧光，同时将光学信号转换成电脉冲（数字数据）信号。
3.数据处理系统主要由计算机及其软件组成，进行实验数据的分析、存储、显示，是流式细胞仪组成部件中的重要环节。
二、散射光的测定散射光信号的产生是细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，散射光的强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的方向也有关。
流式细胞分析技术
ü 光电倍增管（PMT）：
检测散射光和荧光；同时将光学信号转换成 电脉 冲信号。
14
滤光片
分色反光镜
15
PMT 滤光片
荧光和散射光检 测系统
分色反光镜
激发光
激光聚光系统
16
数据处理系统
• 计算机及其软件组成 • 进行实验数据的分析、存储、显示
Photons/Detector (V)
光信号转化为电脉冲信号
特点：单细胞、快速、高通量、多参数、准确、灵敏
经典流式细胞仪（分析型和分选型） 量化成像分析流式细胞仪 质谱流式细胞仪
单激发光；4个 荧光检测通道
经典流式细胞仪
双激发光；6个 荧光检测通道
Coulter EPICS XL
6
量化成像分析流式细胞仪
美国merck millipore公司
质谱流式细胞仪
11
经典流式细胞仪
液流系统-液流聚焦原理
喷 嘴
鞘液(Sheath）
喷嘴
荧光信号或 侧向散射光
样本流
前向散射光 单个细胞流
12
液流系统形成单 个细胞流示意图
13
光路系统
ü 激发光：
常用的是空冷式的氩离子激光光源（488nm）；氦氖 激光光源（633nm)；紫外光源
ü 各种光学镜片：
分色反光镜 光束成形器；透镜 滤光片：长通滤片；短通滤片；带通滤片
(一）标本采集、运输、保存和操作 l标本来源
l几乎所有组织细胞均可用于FCM检测 l免疫标本主要来源于外周血、骨髓、 淋巴器官或组织等
l抗凝剂选择
l肝素钠(首选) lEDTA-Na2
l标本保存
标本制备
ü 外周血或骨髓样本
流式细胞术实验报告
一、实验目的本实验旨在通过流式细胞术技术，对细胞群体进行快速、精确的分析和定量测定，研究细胞的物理与化学性质，并对细胞进行分类和分选。
通过本次实验，掌握流式细胞仪的工作原理，了解其在细胞生物学研究中的应用。
二、实验原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。
其基本原理是将经过荧光标记的细胞或微粒，在流动系统中以高速通过，同时利用激光束照射细胞，通过光散射和荧光信号来获取细胞的大小、形态、表面标记物等信息。
最后，通过数据分析和可视化展示，对细胞进行计数、分类和分析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细胞样本：小鼠脾细胞、Jurkat细胞- 荧光标记抗体：CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC- 溶液：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、荧光染料（如PI）2. 实验仪器：- 流式细胞仪（如BD FACS Calibur）- 离心机- 恒温培养箱- 移液器四、实验步骤1. 细胞制备：- 收集小鼠脾细胞或Jurkat细胞，用PBS洗涤后，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
- 加入荧光标记抗体，室温下孵育30分钟。
- 用PBS洗涤细胞两次，去除未结合的抗体。
2. 流式细胞术分析：- 将处理好的细胞加入流式细胞仪，设置合适的参数进行检测。
- 收集数据，进行细胞分类和分析。
3. 数据分析：- 利用流式细胞术分析软件（如CellQuest、FlowJo）对数据进行分析，包括细胞计数、分类、DNA含量分析等。
五、实验结果与分析1. 细胞分类：- 通过流式细胞术，成功将小鼠脾细胞和Jurkat细胞分为不同的亚群，如T细胞、B细胞等。
2. DNA含量分析：- 通过PI染色，检测细胞的DNA含量，发现小鼠脾细胞和Jurkat细胞均处于G0/G1期。
3. 表面标记物分析：- 通过CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC抗体检测，发现Jurkat细胞为T细胞，小鼠脾细胞中含有B细胞和T细胞。
流式细胞仪(检验仪器)
流式细胞仪flow cytometer;FCM定义：将流体喷射技术、激光技术、空气技术、γ射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非常先进的检测仪器。
通过测量细胞及其他生物颗粒的散射光和标记荧光强度，来快速分析颗粒的物理或化学性质，并可以对细胞进行分类收集，可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行定性或定量分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点。
流式细胞仪流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。
它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。
多数流式细胞计是一种零分辨率的仪器，它只能测量一个细胞的诸如总核酸量，总蛋白量等指标，而不能鉴别和测出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。
也就是说，它的细节分辨率为零。
•查看精彩图册组成流式细胞仪主要由四部分组成。
它们是：流动室和液流系统；激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统。
上图为其结构示意图。
流动室和液流系统流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成，常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。
设计和制作均很精细，是液流系统的心脏。
样品管贮放样品，单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出；鞘液由鞘液管从四周流向喷孔，包围在样品外周后从喷嘴射出。
为了保证液流是稳液，一般限制液流速度υ<10m/s。
由于鞘液的作用，被检测细胞被限制在液流的轴线上。
流动室上装有压电晶体，受到振荡信号可发生振动。
激光源和光学系统经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。
常用的光源有弧光灯和激光；激光器又以氩离子激光器为普遍，也有配和氪离子激光器或染料激光器。
光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。
汞灯是最常用的弧光灯，其发射光谱大部分集中于300～400nm，很适合需要用紫外光激发的场合。
氩离子激光器的发射光谱中，绿光514nm和蓝光488nm的谱线最强，约占总光强的80%；氪离子激光器光谱多集中在可见光部分，以647nm较强。
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1934年：Moldavan 1965年：Kamentsky 1967年：Van Dilla 和Los Alamos 1969年：Fulwyler利用Sweet 80年代 90年代
•
1934年Moldavan 使悬浮的血红细
胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通
过的细胞可被一个光电装置记录下来，
这可谓流式细胞仪的最初模型。
染料和细胞标记物的出现，流式细胞
仪的应用范围逐渐扩大。
•
进入90年代，标本制备仪和自动 进样器的问世，以及适合临床应用的 单克隆抗体的增加，使流式细胞仪不
仅出现在大专院校和科研单位，它也
逐渐进入医院的中心实验室和检验科。
流式细胞的样本制备技术
• 关键是制备：单细胞悬液。
流式细胞的检测步骤
• • • • • 1、单细胞悬液 2、对测量细胞间隙荧光标记染色 3、流式细胞测量 4、对测量结果进行定量分析 5、对测量结果进行生物医学意义解释
– 横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度， 单位是道数，可以是线性或对数坐标。 – 纵坐标一般是细胞数。
散点图
• 散点图(Dot Plot)
– X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细 胞另一参数的含量，可以将细胞亚群ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ开。
第三节 流式细胞分析应用
一、淋巴细胞亚群分析 二、DNA分析 三、白血病免疫分型和残余白血病检测 四、网织红细胞分析 五、造血干细胞检测 六、器官移植的配型和免疫状态的监控 七、染色体核型分析
• 激光光源：气冷式氩离子激光器 • 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长 波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光
（三）光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和 小孔组成。 滤光片主要分为： 1.长通滤光片 长通滤光片使特定波长以 上的光通过。 2.短通滤光片 特定波长以下的光通过。 3.带通滤光片 带通滤光片允许一定波长 范围内的光通过
• 散射光信号波长与激光相同。
2.荧光信号 当激光光束与细胞正交 时，一般会产生两种荧光信号。一种是细 胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号， 称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧 光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光 信号，通过对这类荧光信号的检测和定量 分析能了解所研究细胞的性质和数量。
前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细 胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
FCM的应用——血液病学
• • • • • • 白血病和淋巴瘤免疫分型 残留白血病 造血干细胞计数 PNH诊断 网织红细胞分析 血小板分析
–血小板膜糖蛋白分子的表达 –血小板活化 –网织血小板分析
第四节 流式细胞分析仪的 常见故障及维护
• • • • • • 仪器的维护 1.激光电源的波动范围应小于±10%。 2.室温在18℃～24℃，相对湿度小于85%。 3.安装单独的可靠的地线。 4.仪器操作必须有经过培训的人员操作。 5.样品和鞘液管道每周应用漂白粉液清洗。
狭缝扫描流式细胞仪
被检细胞直径 大于激光光斑直径， 细胞通过光束时各 部分被依次扫描。
流式细胞仪的结构可分为流动室及液流 驱动系统；激光光源及光束成形系统；光学 系统；信号检测与存贮、显示、分析系统； 细胞分选系统等五个部分。
• 一、流动室与液流驱动系统
• 流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一 个孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心， 流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。 • 样品流在鞘流的环包下形成聚焦，保证每个细胞 通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细 胞荧光信息。
第十章 流式细胞分析
主讲：周振华
第一节 流式细胞分析理论知识
• 流式细胞术的定义：是一种对处在快 速直线流动状态中的细胞或生物颗粒
进行多参数的快速定量分析和分选的 技术。
• 流式细胞仪的定义：是以激光为光源，
集流体力学技术、电子物理技术、光 电测量技术、计算机技术以及细胞荧
光化学技术、单克隆抗体技术为一体
常用荧光染料
• 目前台式机FCM配置 – 488nm激光管常用染料有 • PI (Propidium Iodide)碘化丙啶 • PE (Phycorey- thrin)藻红蛋白 • FITC (Fluorescein Isothiocyanate)异硫氰酸 荧光素 • PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein)叶绿 素蛋白 • PE-CY5化青素
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
（二）激光光源与光束成形系统 激光是一种相干光源，它能提供单波 长、高强度及稳定性高的光照。由于细胞 的快速流动，每个细胞经过光照区的时间 仅为1μ s左右，且细胞所携带荧光物质被 激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间 和激发光的强度有关，因此细胞必须达到 足够的光照强度。
影响因素
• • • • 1、荧光染色 2、激光光源的稳定性 3、细胞流速的稳定性 4、细胞悬液样品的影响
第二节 仪器检测原理
• 分类： • 流式细胞仪根据功能不同可分为临床型和 科研型。 • 临床型只有分析功能，没有分选功能，操 作简便，易学易掌握。 • 科研型既有分析功能又有分选功能，可快 速将所感兴趣的细胞分选出来。
中性粒细胞 单核细胞
此为血细胞分类 的基本原理，但不能 分析表面分子。
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
荧光信号
激光的作用原理
• 当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激 发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的 光信号分别到达不同的光电倍增管，光电 倍增管将光信号转换成电信号。电信号输 入到放大器放大，放大器分两类：线性放 大和对数放大。
可测量的参数
• 分为：结构参数和功能参数 • 1、结构参数：细胞大小、形态、细胞核与 细胞质的比值，色素颗粒，亚细胞形态， DNA，RNA，蛋白质含量，细胞表面抗原， 碱性蛋白，染色体结构。 • 2、功能参数：氧化还原酶状态，表面电荷， pH值，膜电位，酶活性，DNA合成能力， 膜的流动性，细胞受体，线粒体膜电位， 细胞浆和膜的钙离子活性。
流式细胞仪，成为目前各种流式细胞
测量仪的基础。
•
1969年Fulwyler利用Sweet的静电 墨水喷射液滴偏转技术，建立了流式 细胞分选术。Ehrlich和Wheeless利用
飞点扫描技术和缝扫描技术使零分辨
率的流式细胞仪变成了低分辨率的流
式细胞仪。
•
80年代以来，流式细胞仪的数据 采集、存储、显示、分析日趋完善， 随着样品制备方法的增多，新的荧光
流式细胞仪的分类
• 流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细 胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。
• 前者的光斑直径大于被检细胞体积，只能提供细 胞内某种生物化学成分的参数。 • 狭缝扫描流式细胞仪被检细胞直径大于激光光斑 直径，可计算出细胞直径大小、核直径大小、核 浆比例等一系列的形态学信息的定量资料。
•
1965年Kamentsky用紫外吸收和可
见光散射两个参数同时测量未染色的
细胞，给出了细胞中核酸的含量和细
胞大小，奠定了多参数流式细胞测量
的基础。
•
1967年Van Dilla 和Los Alamos 采用了Crosland-Taylor设计的层流流 动室和氩离子激光器开发出了液流束、
照明光轴，检测系统三者互相垂直的
• 由样本和鞘液组成 • 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光 染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压 力 从样品管进入流动室形成样本流
• 鞘液作用：辅助样本流被正常检测 的基质液。主要作用是包裹样本流 的周围，保持样本流中细胞处于喷 嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻 塞喷孔。
液流系统示意图
喷嘴 鞘液
Fluorescence signals
的细胞分析仪器。
什么是流式细胞仪
●
流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
•
生物学颗粒包括：大的免疫复合物、 DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、 细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、 杂交细胞、聚集细胞等。所检测的生物颗 粒的理化性质包括细胞大小、细胞形态、 胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白质含量、 细胞膜完整性和酶活性等。
免疫系统疾病 免疫缺陷病，AIDS 移植病人排斥反应或移植物抗宿主反应的检测 肿瘤病人化疗后免疫力检测
淋巴细胞亚群分析
• 根据功能，淋巴细胞主要分为
• B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 • T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关
• 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫 性疾病
• NK细胞（CD3- CD16+ 56+），行使免疫监 控功能，能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感 染细胞的细胞毒性作用。
淋巴细胞亚群分析
• 使用特异的单克隆抗体，进行多色分析， 同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可 以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析 • 各淋巴细胞亚群的百分含量 • 淋巴细胞亚群的绝对计数
临床意义
• • • •
• • • •
了解在不同情况下体内免疫功能状态 辅助临床疾病的诊断 探索疾病的发病机理、病程、预后 监测、指导临床治疗方案
流动室振动 液流断裂成液滴
空白液滴 不充电 弃去
含细胞的液滴 充电 偏转落入收集器
二、散射光信号和荧光信号的检测
• 散射光信号不依赖任何样品的制备技术 （如染色），因此称为细胞的物理参数。
– 前向散射角(Forward Scatter，FSC)：与细胞 的大小有关，在FCM应用中，常取FSC作阈值， 来排除样品中的各种碎片。 – 侧向散射角(Side Scatter，SSC)：与激光束正 交90度的散射光信号，与细胞粒度及复杂程度 正相关。