第二节 基因工程的酶学基础
1 基因工程的酶学基础
④ DNA模板
dNTPs 5’ 3’
-OH
（3）用DNA聚合酶I 制备探针
① 核酸探针（probe） 能够同某种被研究的核酸序列特异 性结合的，带有标记的寡聚核酸分 子。
三、DNA聚合酶在基因工程中的用途 1. 大肠杆菌DNA聚合酶 DNA聚合酶I (PolI) DNA聚合酶II (PolII) DNA聚合酶 III (PolIII) 参与DNA 的复制 参与DNA 的修复
大肠杆菌DNA聚合酶 I 主要用来制备带放射性标记的DNA探针。
（1）大肠杆菌DNA聚合酶I的性质
2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。 如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如 EcoRI）。
3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同 的限制与修复系统，用罗马字母表示。 如EcoR I，EcoR V。
四、影响限制性内切酶活性的因素
1. DNA的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙 醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。 如何解决？ ①纯化DNA ②加大酶的用量 ③延长保温时间 ④ 扩大反应体积（ >20l）
与DNA的来源无关。
（2）切割位点 识别位点处。 切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：
EcoR I 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’ EcoR V 5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’ 产生平齐末端
加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM
第三节 DNA聚合酶
一、基因工程中常用的DNA聚合酶 1.大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T4 DNA聚合酶 4. T7 DNA聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶
基因工程的酶学基础
② 3’端凸出（如Pst I切点）
5’3’-
CTGCA G GGACGT
-3’ -5’
5’3’-
CTGCA-3’ 5’-G G-5’ 3’-ACGTC
-3’ -5’
（4）粘性末端的意义
1）连接便利 ①不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 比连接两个平齐末端容易的多。 ②同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。
产生blunt end
（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends） 含有几个核苷酸单链的末端。 分两种类型： ① 5’端凸出（如EcoR I切点）
5’3’5’3’GAATTC CTTAAG G-3’ 5’-AATTC CTTAA-5’ 3’-G -3’ -5’ -3’ -5’
第二章 基因工程的酶学基础
Enzymes
限制性核酸内切酶
单链核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 核酸外切酶
第一节 限制性核酸内切酶 一、限制性核酸内切酶 （Restriction endonuclease）
是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定 核苷酸序列（4—8 bp），并由此处切割DNA 双链的核酸内切酶。
1. I型限制性内切酶
首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆
菌 B株和 K株分离的。
如 EcoB 和 EcoK。 （1）识别位点序列 未甲基化修饰的特异序列。 EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC
（2）切割位点
在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随
XmaI
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’
《酶学基础》PPT课件 (2)
（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是 形成具有平末端的DNA片段。
c.产生的末端特征：
Ⅱ类限制性内切酶的切割产物有平末端和粘性末端 (cohesive end)。
类似于Ⅰ类酶, 作用方式基本同Ⅱ类酶。如EcoPI是由两个亚基组成：一
个亚基(M亚基)负责位点识别和修饰，另一个亚基(R亚基)具有核酸酶的活 性(图3-5)。切割DNA时需要ATP,Mg2+,也能被SAM激活，但并非必需。
Ⅱ类限制性核酸内切酶
这类酶的分子量较小. 一般在2-4万道尔顿, 通常由2-4个相同的 亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA, 极少数Ⅱ类酶也可作用于单链 DNA, 或DNA/RNA杂种双链。这类酶的专一性强, 它不仅对酶切点邻近的两 个碱基有严格要求, 而且对更远的碱基也有要求, 因此, Ⅱ类酶既具有切 割位点的专一性, 也具有识别位点的专一性, 一般在识别序列内切割。切 割的方式有平切和交错切, 产生平末端的DNA片段或具有突出粘性末端的 DNA片段(5‘或3’粘性末端)。作用时需要Mg2+作辅助因子, 但不需要ATP 和SAM。Ⅱ类酶与对应的甲基化酶在蛋白亚基上尚未发现有什么关系, 第
用放射性同位素标记的噬菌体进行的实验结果表明， 在受感染的宿主细胞中，噬菌体生长的限制伴有噬菌体DNA的 迅速降解；然而，用作繁殖噬菌体的感染宿主菌株并不导致类 似的噬菌体DNA的降解。如果某一细菌细胞具有一种能选择性 降解来自侵染病毒(或其他来源)DNA的核酸酶，那么，它必须 能将这种外来DNA同它自己的DNA区分开来，之所以能够如此， 乃是通过称为宿主控制的修饰作用(host-controlled modification)。
[医学保健]基因工程的酶学基础
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碱性磷酸酶:
来自于大肠杆菌(bacterial alkaline phosphatase BAP)或小牛肠(calf intestinal alkaline phosphatase CIP),该酶用于脱去 DNA(RNA)5’末端的磷酸根,使5’-P成为5’-OH,该 过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同位 素标记或为了避免DNA片段自身连接(或环化)时 可进行脱磷酸反应。
该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase),它是从小牛胸腺中 纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质,在二甲胂 酸缓冲液中,能催化5’脱氧核苷三磷酸进行5’－3’ 方向的聚合作用,逐个地将脱氧核苷酸分子加到线 性DNA分子的3’-OH末端。
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上个世纪末,本世纪初，1996年,清华学界 对中医 气本质 ，经络 实质， 阴阳， 五行， 藏象， 中医哲 学观等 都有了 新的全 面整体 创造性 的认识 和解说 。如， 邓宇等 发现的 :气是 流动着 的‘信 息－能 量－物 质’的 混合统 一体； 分形分 维的经 络解剖 结构； 数理阴 阳；中 医分形 集：分 形阴阳 集－阴 阳集的 分形分 维数， 五行分 形集－ 五行集 的分维 数；分 形藏象 五系统 －暨心 系统、 肝系统 、脾系 统、肺 系统、 肾系统 ；中医 三个哲 学观－ 新提出 的第三 哲学观 ：相似 观－分 形论等 。
3’CTTAAG 5’
平末端
两条链上的断裂位置是处在一个 对称结构的中心这样形式的断裂是 形成具有平末端的DNA片断。不易 重新环化。
同裂酶(isoschizomers)
指来源不同但识别相同靶序列的核酸内 切酶。同裂酶进行同样的切割,产生同样的 末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性 不同。 Example: 限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶 (CCGG) , 当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行 切割,而MspⅠ可以。
基因工程的酶学基础PowerPoint演示文稿[1]
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核酸内切酶作用后的断裂方式
粘性末端 ：两条链上的断裂位置是交错地、但又是 围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形 成具有粘性末端的DNA片断。
具有3’-OH（ Pst1 ），或5’-OH(EcoR1)的粘性末 端。
Pst1
EcoR1
5’CTGCAG 3’
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同尾酶（isocaudamer）
指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的 粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割 位点的选择余地更大。
杂种位点（hybrid site）：由一对同尾酶分别产 生的粘性末端共价结合形成的位点。
一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。
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• R/M体系： 寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶
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E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶
• 根据酶的功能、大小和反应条件，及切 割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶 分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶
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Ⅰ型酶：
1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和 E.coliK中分离出的核酸内切酶。
分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫 氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别 位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机 的，所以在基因工程中应用不大。
第二章基因工程的酶学基础精品文档29页
幻灯片1第二章基因工程的酶学基础Enzymes幻灯片2第一节限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
幻灯片31.来源原核生物。
2. 性质内切酶。
即在核酸分子链的内部制造切口的酶。
3.功能自我保护作用。
细菌的限制和修饰系统（R/M体系）幻灯片4（1）限制（R e s t r i c t i o n）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。
幻灯片5（2）修饰（M o d i f i c a t i o n）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。
① Dam甲基化酶GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基② Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基幻灯片6幻灯片7二、限制性内切酶的类型目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。
I 型限制性内切酶I I类限制性内切酶I I I类限制性内切酶幻灯片81.I型限制性内切酶首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。
如 EcoB和 EcoK。
（1）识别位点序列未甲基化修饰的特异序列。
EcoB： TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC幻灯片9（2）切割位点在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开一条单链。
Recognize sitecut1-1.5kb（3）作用机理需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
幻灯片102.I I类限制性内切酶首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。
分离的第一个酶是Hind Ⅱ（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。
与DNA的来源无关。
幻灯片11（2）切割位点识别位点处。
限制性核酸内切酶的命名和类型
限制性核酸内切酶的命名和类型第二章基因工程的酶学基础第一节限制性内切酶第二节DNA 连接酶第三节DNA聚合酶和反转录酶第四节DNA修饰酶第五节外切核酸酶第六节单链内切核酸酶第七节RNA酶核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。
基本概念及其生物功能特异水解断裂RNA分子核糖核酸酶（RNase）特异水解断裂DNA分子脱氧核糖核酸酶（DNase）非专一性酶底物或者为DNA或者为RNA从核酸分子末端逐个降解核苷酸叫外切核酸酶从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段叫内切核酸酶按水解断裂核酸分子的方式:根据作用的核酸底物不同:*基因工程的操作是在分子水平上的操作是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶连接酶DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割拼接和扩增等操作。
所以把这些酶称之为“工具酶”。
工具酶、限制修饰系统、限制性核酸内切酶的命名和类型、II型限制性核酸内切酶的基本特性、影响限制性内切酶活性的因素、限制性内切酶对DNA的消化作用第一节限制性核酸内切酶限制性内切核酸酶(Restrictionendonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(bp)并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
限制性核酸内切酶概念性质内切酶主要来源于原核生物即在核酸分子链的内部制造切口的酶。
形成’P和’OH末端自我保护作用功能细菌的限制和修饰系统（RM体系）来源任何一种生物体都存在防御外界物质进入的机制大肠杆菌B大肠杆菌Kphageλ(B)EOP=（限制作用）EOP=（限制作用）EOP=（修饰作用）修饰的phageλ(K)人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。
即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（RM体系）。
细菌的RM体系类似于免疫系统能辨别自身的DNA与外来的DNA并能使后者降解掉。
寄主的限制与修饰现象EOP成斑率efficiencyofplatingEOP=限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解切成小片断。