木质素(Lignin )含量试剂盒说明书
木质素染色液(甲基红法)
北京雷根生物技术有限公司
木质素染色液(甲基红法)
简介：
木质素是三种苯丙烷单元通过醚键和碳碳键相互连接形成的具有三维网状结构的生物高分子，存在于木质组织中，主要作用是通过形成交织网来硬化细胞壁，为次生壁主要成分。
Leagene 木质素染色液(甲基红法)利甲基红显色，染色后木质化的细胞壁呈黄色，该染色法是简便的检测植物细胞壁的木质素的显微化学法，但该染色会随着时间逐渐褪色，因此不适用于作永久制片。
该试剂仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。
组成：
自备材料：
1、载玻片、盖玻片
2、显微镜
操作步骤(仅供参考)：
1、将切好的切片材料置于载玻片上，滴加 50-100μl 木质素染色液(甲基红法)，稍放置浸透材料。
2、盖上盖玻片，显微镜下观察。
染色结果：木质化的细胞壁呈黄色。
注意事项：
1、 木质化程度越强，颜色越深。
2、冰冻切片和细胞染色，最好根据具体情况摸索实验条件。
3、染色会随着时间逐渐褪色，因此不适用于作永久制片。
有效期： 6个月有效。
编号 名称 DP0414 Storage 木质素染色液(甲基红法) 50ml RT 避光 使用说明书 1份。
木质素
木质素(Lignin)是构成植物细胞壁的成分之一，具有使细胞相连的作用。
木质素是一种含许多负电集团的多环高分子有机物。
木质素完全取材于植物，无任何化学添加剂。
对环境无任何副作用。
木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有使细胞相连的作用。
在植物组织中具有增强细胞壁及黏合纤维的作用。
其组成与性质比较复杂，并具有极强的活性。
不能被动物所消化，在土壤中能转化成腐殖质。
如果简单定义木质素的话，可以认为木质素是对羟基肉桂醇类的酶脱氢聚合物。
它含有一定量的甲氧基，并有某些特性反应。
1838年，法国化学家和植物学家A.Payen用硝酸和碱交替处理木材，并用酒精和乙醚洗涤，在分离出纤维素的同时得到了一种比纤维素含碳量更高的化合物，也就是最初级的木质素。
1857年，F.Schulze仔细分离出这种化合物，并称之为"lignin"。
Lignin是从木材的拉丁文"lignum"衍生而来，中文译为“木质素”，也叫“木素”。
木质素的分子结构因单由于木质素的结构复杂，目前完整的结论还没有最终得出，但对其基本的结构框架众多科研工作者已达成共识。
一般认为木质素是由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键连接而成的聚酚类三维网状高分子芳香族化合物，其中醚键约占60．75％，碳键约占25．30％。
在植物体内，苯丙烷单元先组装成三种基本结构一一愈创木基结构、紫丁香基结构和对羟苯基结构。
体不同，可将木质素分为3种类型：由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素（syringyl lignin，S-木质素），由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素（guajacyl lignin，G-木质素）和由对-羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对-羟基苯基木质素（hydroxy-phenyl lignin，H-木质素）；裸子植物主要为愈创木基木质素（G），双子叶植物主要含愈创木基-紫丁香基木质素（G-S），单子叶植物则为愈创木基-紫丁香基-对-羟基苯基木质素（G-S-H）。
总可溶性酚和木质素含量的测定
总可溶性酚和木质素含量的测定1. 试剂配制①80%甲醇：400 mL 甲醇，用蒸馏水定容至500 mL② 1 N Folin-酚试剂（Folin and Ciocalteau's Phenol reagent)③1 mol/L Na2CO3：称取105.99 g Na2CO3，蒸馏水溶解并定容至1000 mL④邻苯二酚⑤ 2 N HCl：83.3 mL浓HCl，蒸馏水定容至500 mL⑥ 1:10比例的巯基乙酸和2 N HCl混合液：30 mL巯基乙酸（硫代乙醇酸），溶于300 mL 2 N HCl⑦0.5 N NaOH：20.0 g NaOH，用蒸馏水溶解并定容至1000 mL⑧浓HCl（12 mol/L）2. 测定方法酚类物质含量测定：分别在接种前(0 h)和接种后的1、3、5、7 d采集水稻的第3、4片叶，在-80℃下保存备用，用以测定总可溶性酚和木质素的含量。
参照Rodrigues等（2005）的方法。
0.1 g水稻叶片置于预冷研钵中，加入液氮研成粉末，转移到2 mL离心管中，加入1.5 mL的80%甲醇。
用锡纸包裹Eppendorf管，防止光氧化，在25℃下，用摇床150 rpm振荡过夜。
提取物在12000 rpm下离心10 min，上清液转移到1.5 mL离心管中，在-20℃下保存，用于总可溶性酚含量的测定。
沉淀在-20℃下保存，用于木质素含量的测定。
⑴总可溶性酚含量的测定参考Folin-Ciocaileu比色法①取上清液（甲醇提取物）150 μL，加入150 μL 1 N Folin-酚试剂（Folin and Ciocalteu's Phenol reagent)，摇匀，室温下保持5 min。
接着加入200 μL的1 mol/L Na2CO3溶液，摇匀，在室温下保持10 min。
向混合物加入1 mL双蒸水，摇匀，室温下（在暗处）保持1 h。
混合物在725 nm(或765 nm)下比色，测定吸光度。
第三章 木质素chapter 3 lignin
可合成500万亿ｔ木质素。
按热焓 enthalpy 容量计算，生物学上产生能量 40% 储存 在木质素中store in lignin，来源丰富、价格低廉的可再生植 物资源regenerated plant resource。 工业木质素industrial lignin：主要来源于造纸制浆蒸煮废水
2000～3000，木质素磺酸盐lignosulfonate一般为
20000～50000）
3.1 植物细胞壁的木质素化作用 lignification of plant cell wall
（3）碱木质素alkali lignin因分子上缺乏 be short of the hydrophilic and hydrophobic groups 亲油亲水性均较理 想的官能团，在有机相和水相中的溶解度 solubility均不高，溶于碱性介质； （4） 组成不稳定unstable，使产品性能波 动大。；
ห้องสมุดไป่ตู้
3.1 植物细胞壁的木质素化作用 lignification of plant cell wall
3.1.1 木质素（ lignin）资源
一、木质素资源lignin resource
地球上资源丰富的天然聚合物nature polymer，在植物中的 存在量仅次于纤维素second to cellulose。全球陆生植物每年
Formation of resonance-stabilized phenoxy radicals by the enzymic dehydrogenation of coniferyl alcohol. 松柏醇被过氧化酶和H2O2hydrogen peroxide 的脱氢dehydrogenation作用 p80
木质素木材抽提物 - 木质素木材抽提物
5.4 木质素
（5）木质素的化学性质
➢接枝共聚反应:木质素的酚羟基能与环氧烷烃或 氯乙醇反应，产物具有较高的胶合强度和优良的 耐水煮沸性能。
➢木质素与烯类单体在催化剂作用下发生接枝共聚 反应，已经研究了木质素或木质素磺酸盐与丙烯 酰胺、丙烯酸、苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯 睛的接枝共聚反应。
5.4 木质素
（2）木质素的分离
②木质素被溶出而分离的方法
➢采用有机溶剂和无机溶剂进行。 ➢用乙醇、醋酸、二氧六环和酚等有机溶剂在酸性条件
下分离木质素； ➢用氢氧化钠、硫化钠、亚硫酸钠等无机溶剂分离木质
素，典型例子是造纸的制浆过程。
5.4 木质素
（4）木质素的物理性质
➢颜色:原本白色或近无色；分离、制备过程呈现颜色， 通常浅黄褐色到深褐色
5.4 木质素
（5）木质素的化学性质
➢光降解反应:木材表面的光降解引起木材品质的 劣化。当用波长小于385nm的光线照射时，木 质素的颜色会变深。木材随时间而颜色变深，主 要是木质素造成的。
5.4 木质素
（5）木质素的化学性质
➢氯化反应:氯易与木质素反应，木质素氯化后， 易溶于碱液中。生产中用氯化法生产纸浆和氯 化漂白纸浆，在实验室可制备综纤维素。
➢软化→热磨纤维分离、木材弯曲和人造板胶合
5.4 木质素
（5）木质素的化学性质
➢显色反应:发色基团(与苯环共轭的羰基、羧基和烯) 助色基团(酚羟基和醇羟基)
❖颜色反应可作为鉴定木材组织中或机械纸浆中有无木质 素存在的依据。
❖用摩尔氏反应来区别针、阔叶树材：1%高锰酸钾溶液 处理5min，水洗后3%盐酸处理，再水洗，最后放入浓 氨溶液中观察，针叶树材显黄色，阔叶树材显红色。
木质素含量的测定
试剂 蒸馏水
-2-
邮箱：bestbio@
电话：021-33921235
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
高氯酸，浓硫酸
产品说明书
使用方法：
使用注意事项： 试剂 A 有毒性，请操作时做好防护措施，加热前必须用封口膜密封，以防气体溢出。 加热过程中有剧烈反应，震荡时轻摇，以免压力过大喷出造成人生伤害。 试剂 C 具有强刺激性，建议操作过程全部在通风橱子操作。 正式测定之前可选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。
注意事项： 1. 正式实验前请选取几个样本做预实验，以优化实验条件，取得最佳实验效果。 2. 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，
避免开盖时试剂损失。 3. 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。 4. 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。 5. 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并
三、 Lignin 含量计算公式 标准曲线：y = 0.02776x+0.0068，R2=0.9889 Lignin（mg/g 干重）= (ΔA-0.0068)÷0.02776×V 反总×10-3÷W×T
= 0.0735×(ΔA-0.0068) ÷W×T
2、 按下表加样。加样表（以 1000ul 体系为例）
单位：
空白管
测定管
样本（mg）
5
试剂 A（ul）
1000
1000
高氯酸（ul）
40
40
于 10mL 玻璃试管中，用封口膜密封，充分混匀，80℃水浴 40min，每
木质素纤维素测定方法
木质素测定方法（熊素敏等浓硫酸法）反应原理木质素在醋酸的作用下,易溶于乙醇和乙醚的混合液,在硫酸介质中用重铬酸钾氧化为二氧化碳和水,反应方程式如下：C6H10O5+ 4K2Cr2O7+ 16H2SO4=4Cr2(SO4)3+ 4K2SO4+ 6CO2+ 21H2O过量的重铬酸钾用硫代硫酸钠回滴,淀粉KI溶液为指示剂。
其中加氯化钡溶液的作用是让溶出的木质素和硫酸钡一起沉淀。
0.05g干样（过40目筛）10ml①↓离心15min沉淀5ml①↓离心15min沉淀3-4ml乙醇和乙醚混合液（1:1）↓浸泡3min（浸洗3次）沉淀↓沸水浴蒸干3ml质量分数72%硫酸玻棒搅匀↓室温静置16h+10ml蒸馏水↓沸水浴5min冷却↓5ml蒸馏水和0.5ml②，摇匀离心沉淀↓蒸馏水冲洗2次后加入10ml③和④沸水浴15min，不断搅拌↓冷却↓所有物质转入烧杯中作滴定15-20ml蒸馏水洗涤残余部分↓5ml⑤和1ml⑥硫代硫酸钠滴定对照：滴定加入了5ml质量分数25%硫酸和0.05mol/L的重铬酸钾溶液作为空白样木质素含量按下式计算: X=K(a-b) /(n×48)式中,“48”为1molC11H12O4相当于硫代硫酸钠的当量数;K为硫代硫酸钠浓度,mol/L;a为空白滴定所耗硫代硫酸钠体积,ml；b为滴定溶液所耗硫代硫酸钠体积,ml；n为干样质量, g。
①质量分数1%醋酸：②质量分数10%氯化钡：③质量分数25%的硫酸：④0.05mol/L重铬酸钾溶液：14.7g重铬酸钾定容至1000ml⑤质量分数30% KI溶液⑥质量分数0.5%淀粉液用0.05mol/L重铬酸钾和0.2mol/L硫代硫酸钠滴定纤维素测定（72%浓硫酸水解法）0.05g干样（过百目筛）↓5 ml醋酸和硝酸混合液,盖上球形玻盖↓置沸水浴中加热25 min,并不断搅拌冷却离心15min↓沉淀↓蒸馏水冲洗3次沉淀↓10ml①和10ml②摇匀沸水浴中10min↓倒入三角瓶适量蒸馏水冲洗试管3次，一并倒入三角瓶↓冷却5 ml质量分数20% KI溶液和1ml质量分数0.5%的淀粉溶液（上清液）↓0.2mol/L硫代硫酸钠滴定对照：滴定入加入了5ml质量分数25%硫酸的0.1 mol/L的重铬酸钾溶液作为空白样。
农业废料中木质素含量的快速测定法
0 前言
在水泥工业尝试使用替代燃料的实践过程中， 我们发现一些农业废料（农作物残余）具有降低生料 磨电耗也就是助磨的功能。为了进一步筛选具有助 磨功能的物质，我们需要测定不同农业废料中木质 素 的 含 量 。 本 文 对 熊 素 敏 等 的 浓 硫 酸 法[1]进 行 改 进，改进后的方法步骤少，操作简便，耗时大幅缩短， 对实验室设备和条件要求较低，为分析测定秸秆废 料中木质素含量提供参考。
（1）将 待 检 测 的 秸 秆 进 行 预 处 理 ：先 将 秸 秆 样 品去除灰尘和泥土，水洗，放入 40～50 ℃的鼓风烘 箱中烘干，再将秸秆样品粉碎至粒度<80 μm，然后 放入 100～110 ℃的鼓风烘箱中烘干至恒重。
（2）取 步 骤（1）中 样 品 准 确 称 取 0.10 g 左 右 于 500mL 离心管中，重量记为 m，加入 1% 醋酸溶液 10 mL，酸解 10～15 min，放入离心机中 7 000 r/min 离心 80min，弃上清液。再重复酸解 2 次。向酸解沉淀加 入 3～5 mL 乙醚萃取脱脂，浸泡 3～5 min 后离心，共 浸泡离心 3 次。将装有沉淀的离心管放置于 40 ℃水 浴中，缓慢升温至 80 ℃，期间用玻棒小心搅拌并小 心蒸干得到粉末状的酸性沉淀。
hydroxy-phenyl lignin，H 型木质素），由愈创木基丙
烷 结 构 单 体 聚 合 而 成 的 愈 创 木 基 木 质 素（guaiacyl
lignin，G 型木质素）和由紫丁香基丙烷结构单体聚
合而成的紫丁香基木质素（syringyl lignin，S 型木质
素），单体结构见下图 1。
1 木质素化学结构及含量测定
从化学结构看，木质素是由四种醇单体（对香豆
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货号: MS2636 规格：100管/96样木质素（Lignin ）含量试剂盒说明书
紫外分光光度法
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
木质素是构成植物细胞壁的成分之一，是由聚合的芳香醇构成的一类物质，存在于木质组织中，主要作用是通过形成交织网来硬化细胞壁。
木质素主要位于纤维素纤维之间，起抗压作用。
测定原理:
木质素中的酚羟基发生乙酰化后在280nm处有特征吸收峰，280nm的吸光值高低与木质素含量正相关。
自备实验用品及仪器：
天平、40目筛，玻璃试管、烧杯、离心机，恒温水浴锅、封口膜、烘箱、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、高氯酸，浓硫酸。
试剂组成和配制：
试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体100mL×1瓶，4℃保存。
样品处理：
样品80℃烘干至恒重，粉碎，过40目筛，称取约2mg（记为W）于10mL玻璃试管中（务必用玻璃试管，不可用Ep管）
计算公式：
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标准曲线：y = 0.0347x+0.0068，R2=0.9889
Lignin（mg/g干重）= (ΔA-0.0068)÷0.0347×V反总×10-3÷W×T=0.0294×(ΔA-0.0068) ÷0.002×50
V反总：反应总体积：1.02mL；W：样本质量，g；T：稀释倍数
注意事项：
1.试剂一有毒性，请操作时做好防护措施，加热前必须用封口膜密封，以防气体溢出。
2.加热过程中有剧烈反应，震荡时轻摇，以免压力过大喷出造成人身伤害。
3.试剂三具有强刺激性，建议操作过程全部在通风橱子操作。
4.取上清加试剂三步骤根据自己样品乙酰化程度，试剂三的用量可调整，保证吸光值在0.1-0.8之间即可，并在公式中参与计算。
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