液相色谱-基础
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液相色谱基础知识
电导检测器
原理： ☼ 原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电 导变化来测定电离物质含量。 导变化来测定电离物质含量。广泛应用于 离子色谱法。 离子色谱法。
☼ 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，
梯度洗脱。 梯度洗脱。 缺点：对温度变化敏感，每升高1℃, ℃,电导率增加 ☼ 缺点：对温度变化敏感，每升高 ℃,电导率增加 2%-2.5%。
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
☼鬼峰的出现
洗脱曲线
☺水/MeOH梯度 ODS ODS柱 1ml/min在 0~10Mins内 MeOH 0~100% 线性变化后 保持15Min
鬼峰
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
在微量分析和梯度洗脱时建议使用HPLC级溶剂和纯化水 级溶剂和纯化水 在微量分析和梯度洗脱时建议使用
0.001~9.999
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
柱塞和密封圈的关系
水 出口单 向阀 密封圈 吸液移动 柱塞杆 送液移动 入口单 向阀 泵头清洗流路 流动相
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
手动进样阀7725i原理
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
☺无在线脱气机应注意：
1 每天脱气 2 如使用氦脱气，对混合好的溶剂脱气时间不能过长。
液相色谱基础知识
梯度形式的选择
洗脱模式：高压梯度
低压梯度 用两台输液泵将两种流动相混合并进入系统 常压下用比例阀将流动相混合，单泵进入系统
☺线性梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成线性变化（增或减） ☺指数梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成指数关系（增或减） ☺折线梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间无规则变化
原理： ☼ 原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电 导变化来测定电离物质含量。 导变化来测定电离物质含量。广泛应用于 离子色谱法。 离子色谱法。
☼ 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，
梯度洗脱。 梯度洗脱。 缺点：对温度变化敏感，每升高1℃, ℃,电导率增加 ☼ 缺点：对温度变化敏感，每升高 ℃,电导率增加 2%-2.5%。
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
☼鬼峰的出现
洗脱曲线
☺水/MeOH梯度 ODS ODS柱 1ml/min在 0~10Mins内 MeOH 0~100% 线性变化后 保持15Min
鬼峰
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
在微量分析和梯度洗脱时建议使用HPLC级溶剂和纯化水 级溶剂和纯化水 在微量分析和梯度洗脱时建议使用
0.001~9.999
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
柱塞和密封圈的关系
水 出口单 向阀 密封圈 吸液移动 柱塞杆 送液移动 入口单 向阀 泵头清洗流路 流动相
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
手动进样阀7725i原理
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
☺无在线脱气机应注意：
1 每天脱气 2 如使用氦脱气，对混合好的溶剂脱气时间不能过长。
液相色谱基础知识
梯度形式的选择
洗脱模式：高压梯度
低压梯度 用两台输液泵将两种流动相混合并进入系统 常压下用比例阀将流动相混合，单泵进入系统
☺线性梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成线性变化（增或减） ☺指数梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成指数关系（增或减） ☺折线梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间无规则变化
液相色谱基础知识
液相色谱—视差折光检测器
检测器组成：光源——透镜——两 束平行光——样品池和参比池—— 光电二极管——比较两者信号差 值——输出信号 。
液相色谱—凝胶色谱
பைடு நூலகம்
凝胶渗透色谱仪（GPC仪）、体积 排阻色谱(Size Exclusion Chrom.) 。 分离原理：利用多孔物质做固定相， 按照待测组分分子尺寸大小进行分 离。测定相对分子量大小、分子量 分布。
环己烷
正丁醇 乙醇 水 异丙醇
乙酸正丙酯
丙酸甲酯 四氯化碳 N,N-二甲基 甲酰胺 苯
260
260 265 270 280
碘甲烷
二硫化碳 硝基甲烷 硝基乙烷 2-硝基丙烷
350
380 380 380 380
甲醇
甲苯
285
液相色谱—荧光检测器
荧光检测器：样品中物质分子能在 特定波长的光激发后跃迁到高能级 状态，在返回到基态的过程中，会 发出波长较长的光，称做荧光。 荧光强度F=I0Φabc I0——激发光强度 Φ——荧光量子产率
Refractive Index Detector
A valve is opened and pure solvent passes into one half of a cell. The eluate flows through the other half of the cell. The two halves are separated by a glass plate mounted at an angle such that bending of the incident beam occurs if the two solutions differ in refractive index.
液相色谱基础理论知识
一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（T swett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。
也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压—压力可达150~300Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速—流速为0.1~10.0 ml/min。
高效—可达5000塔板每米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度—紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快—通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高—可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
灵敏度高—紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。
液相色谱教程-液相色谱基础知识2
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YOU
拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰
鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰
色谱图名词术语
基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号 – 基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓慢变化 – 基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的基线波动 – 谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽 度增加的现象
-25%
液相色谱的应用
目的:得到数据-定性及定量分析
– 灵敏度的要求 – 样品的复杂性 – 样品量的要求 – 精度及准确度的要求 – 容易使用
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液相色谱的应用
制备型液相色谱 目的:得到纯品-分离及纯化 • – 化合物的稳定性 • – 样品的复杂性 • – 制备量的要求 • – 纯度的要求，及纯度的鉴定 • – 方法的安全性
半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通 过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两 侧相交两点之间的距离
色谱图名词术语
– 峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差(σ)(Standard Error):0.607倍峰高对应峰宽的一 半
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色谱图名词术语
死时间(t0)(Dead time):不被固定相滞留 的组分,从进样到出现峰最大值所需的时 间 – 保留时间(tR)(Retention time):组分从 进样到出现峰最大值所需的时间
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拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰
鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰
色谱图名词术语
基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号 – 基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓慢变化 – 基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的基线波动 – 谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽 度增加的现象
-25%
液相色谱的应用
目的:得到数据-定性及定量分析
– 灵敏度的要求 – 样品的复杂性 – 样品量的要求 – 精度及准确度的要求 – 容易使用
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液相色谱的应用
制备型液相色谱 目的:得到纯品-分离及纯化 • – 化合物的稳定性 • – 样品的复杂性 • – 制备量的要求 • – 纯度的要求，及纯度的鉴定 • – 方法的安全性
半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通 过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两 侧相交两点之间的距离
色谱图名词术语
– 峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差(σ)(Standard Error):0.607倍峰高对应峰宽的一 半
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色谱图名词术语
死时间(t0)(Dead time):不被固定相滞留 的组分,从进样到出现峰最大值所需的时 间 – 保留时间(tR)(Retention time):组分从 进样到出现峰最大值所需的时间
液相色谱基础
：加温操作; HPLC：室温；高压 （液体粘度大）较低的温度，一般有利于 色谱分离条件的选择。 • 4、分析速度和分析最低限差别 • GC：最低限达10-7~10-14g • HPLC：最低限达10-6~10-8g
高效液相色谱仪
高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、 分离系统、检测系统、记录系统 等五大部分组成。
• 分子筛：属于合成硅铝酸钠盐或钙盐，它具有均匀 孔隙结构和大的表面积，分离基于分子筛的极性。 一般用来分离永久性气体和无机气体。但要注意， 分子筛在常温下对CO2发生不可逆吸附，因而不能 用来分离CO2，分子筛在使用前在400~550℃活化2 小时，但很容易吸水失活，在使用过程中要注意防 止水气进入色谱柱内。
色谱条件的选择
分离条件(色谱柱)的选择 1. 固定相的选择；2. 柱长的选择
（1）气固色谱固定相： a. 种类：活性炭、活性氧化铝、硅胶、分子筛、高分子多孔
微球（GDX系列）等
b. 特点：
（1）性能与制备和活化条件有很大关系； （2）同一种固定相，不同厂家或不同活化条件，分离效果差 异较大； （3）种类有限，能分离的对象不多； （4）使用方便，常用于分离常温下的气体及气态烃类等。
高压输液泵
用于输送流动相，由于色谱柱很细、为了获得高柱效而使用 粒度很小的固定相（<10μm）、流动液的扩散系数远小于气体， 故液体的流动相高速通过时，液体流动时阻力很大，必须要有 很高的柱前压力。 3、高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一， 其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送 入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。 压力：150～350×105 Pa，高压、高速是高效液相色谱的特 点之一。 流量稳定（影响重现性及分析精度）、流速可调 应具有压力平稳、脉冲小、耐腐蚀等特性
高效液相色谱仪
高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、 分离系统、检测系统、记录系统 等五大部分组成。
• 分子筛：属于合成硅铝酸钠盐或钙盐，它具有均匀 孔隙结构和大的表面积，分离基于分子筛的极性。 一般用来分离永久性气体和无机气体。但要注意， 分子筛在常温下对CO2发生不可逆吸附，因而不能 用来分离CO2，分子筛在使用前在400~550℃活化2 小时，但很容易吸水失活，在使用过程中要注意防 止水气进入色谱柱内。
色谱条件的选择
分离条件(色谱柱)的选择 1. 固定相的选择；2. 柱长的选择
（1）气固色谱固定相： a. 种类：活性炭、活性氧化铝、硅胶、分子筛、高分子多孔
微球（GDX系列）等
b. 特点：
（1）性能与制备和活化条件有很大关系； （2）同一种固定相，不同厂家或不同活化条件，分离效果差 异较大； （3）种类有限，能分离的对象不多； （4）使用方便，常用于分离常温下的气体及气态烃类等。
高压输液泵
用于输送流动相，由于色谱柱很细、为了获得高柱效而使用 粒度很小的固定相（<10μm）、流动液的扩散系数远小于气体， 故液体的流动相高速通过时，液体流动时阻力很大，必须要有 很高的柱前压力。 3、高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一， 其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送 入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。 压力：150～350×105 Pa，高压、高速是高效液相色谱的特 点之一。 流量稳定（影响重现性及分析精度）、流速可调 应具有压力平稳、脉冲小、耐腐蚀等特性
Shimadzu液相色谱基础
3
性能指标
检测限、线性范围、稳定性等，影响检测结果的 准确性。
数据处理系统
作用
01
数据处理系统用于采集、处理、分析色谱数据，提供实验结果
和图谱。
功能
02
包括基线校正、峰识别、定量分析等。
软件应用
03
常用的软件有ChemStation、Empowe
液相色谱操作流程
详细描述
当色谱峰的形状异常，出现拖尾或前延现象时，可能是由于固定相的流失或污染、流动相的配比不当、柱温波动、 样品溶剂选择不当等原因造成的。为了解决这个问题，可以更换固定相、调整流动相的配比、保持柱温恒定、选 择合适的样品溶剂等方法。
峰分离不完全
总结词
峰分离不完全会导致相邻峰的干扰，影响分析结果的准确性。
流动相
作用
流动相用于携带样品通过色谱柱，与固定相相互作用，实现组分 分离。
组成
通常由溶剂和水等组成，根据分离需求选择合适的流动相。
流速控制
流速直接影响分离时间和效果，需精确控制。
检测器
1 2
作用
检测器用于检测色谱柱流出的组分，并将其转化 为电信号。
类型
常见类型有紫外可见吸收检测器、荧光检测器、 电化学检测器等。
数据处理
对采集到的数据进行基线校 正、峰识别、定量计算等处 理。
结果分析
根据处理后的数据，对样品 中的组分进行分析和比较， 得出实验结论。
04
液相色谱条件优化
流动相的选择与优化
总结词
流动相的选择与优化是液相色谱分离 效果的关键因素之一。
详细描述
根据样品的性质和分离要求，选择合 适的流动相种类、溶剂和比例。优化 流动相的pH值、离子强度和粘度，以 提高分离效果和降低背景干扰。
学习液相，必须要知道的三大理论
学习液相，必须要知道的三大理论写在前面高效液相色谱我们常用，如何操作自然难不倒我们，那么，液相色谱的分析的理论基础是什么？这个你知道吗？这一篇咱们好好学一学液相色谱的分析理论基础，可以让你更好地使用高效液相色谱仪。
在说分析的理论基础之前，问大家一个问题，为什么液相色谱柱的内径都不是整数呢？”例如:1.7、1.9、2.1、4.6这是为什么呢？想了解真相？往下看色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离。
组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相的分配系数决定的，即色谱过程的热力学性质有关。
但是两峰间虽有一定的距离，如果每个峰都很宽，以至彼此重叠，还是不能分开。
这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程中的动力学性质有关。
因此要从动力学和热力学两方面来研究色谱行为。
色谱热力学理论主要研究溶质在色谱柱内的分离机制及分子特征与分离结果之间的关系；色谱动力学主要研究溶质在色谱柱中的运输规律，解释色谱流出曲线的形状、影响色谱区带展宽及峰形的因素，从而为获得高效能色谱分离结果提供理论指导，为峰形预测、重叠峰的定量解析以及选择最佳色谱分离方法奠定理论基础。
先复习一下仪器分析的重点——色谱分析的三大理论。
1相平衡理论相平衡理论认为溶质在流动相和固定相之间达到平衡。
分配（吸附）色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配（吸附-脱附）过程，在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达到平衡时的浓度之比K分配系数，分配系数是由组分在两相的热力学性质决定的。
在一定温度下，分配系数K小的组分在流动相中浓度大，先流出色谱柱。
K=Cs/Cm lnK=-△Gm/RTc由上式可以看出分配系数和温度呈反比，升高温度，分配系数变小，组分在固定相的浓度减小，可缩短出峰时间。
分配比κ又称容量因子，它是在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比κ=ms/mm，κ越大说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量越大，因此又称分配容量比或容量因子。
液相色谱基本原理与应用ppt课件
一、液相色谱定义
高效液相色谱是在经典液相色谱基础上， 引入了气相色谱的理论，在技术上采用了 高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器， 因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操 作自动化的特点。
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
三、HPLC在各领域的主要应用
• 环境：常见多环芳烃、多氯联苯、硝基化 合物、酚类化合物、邻苯二甲酸脂、有机 农药等。
• 农业：土壤矿物成分、肥料、饲料添加剂、 茶叶等农产品中无机和有机成分等。
• 食品：有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂 肪酸、香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、 病原微生物、霉菌毒素、多核芳烃等。
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
多环芳烃标准品色谱图
mV 900
萘 苊
800
700
600
二 苯 并a，h蒽 苯 并g，h，i苝 茚 苯1，2，3-cd苝
苯 并a蒽 屈 苯 并b荧 蒽 苯 并k荧 蒽 苯 并a芘
500
荧蒽
苊烯
400
芴 菲
蒽 芘
300
200
100
0
3 -100
6
9
12
15
18
高效液相色谱是在经典液相色谱基础上， 引入了气相色谱的理论，在技术上采用了 高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器， 因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操 作自动化的特点。
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
三、HPLC在各领域的主要应用
• 环境：常见多环芳烃、多氯联苯、硝基化 合物、酚类化合物、邻苯二甲酸脂、有机 农药等。
• 农业：土壤矿物成分、肥料、饲料添加剂、 茶叶等农产品中无机和有机成分等。
• 食品：有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂 肪酸、香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、 病原微生物、霉菌毒素、多核芳烃等。
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
多环芳烃标准品色谱图
mV 900
萘 苊
800
700
600
二 苯 并a，h蒽 苯 并g，h，i苝 茚 苯1，2，3-cd苝
苯 并a蒽 屈 苯 并b荧 蒽 苯 并k荧 蒽 苯 并a芘
500
荧蒽
苊烯
400
芴 菲
蒽 芘
300
200
100
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3 -100
6
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• 峰底 － Peak Base
• 峰的起点与终点之间连接的直线
• 峰高 － Peak Height
• 峰最大值到峰底的距离
• 峰宽 － Peak Width
• 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离
• 半（高）峰宽 － Peak Width at Half Height
• 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之 间的距离
• 1906年正式命名（见诸文献）
• 色谱法；Chromatography
• 50年代开始广泛研究和应用
• 主要是气相色谱及薄层色谱
• 高效液相色谱法的广泛应用始于70年代
色谱分离的机理
色谱是一种分离技术 色谱分离是一个物理过程
流动相（Mobile Phase） 固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的溶质）
W
s
方法
Wtan
16 切线法
Wh
5.54 半峰高
W3s
9
3s
W4s
16
4s
W5s
25
5s
理论板数(n)计算公式
或（通常用）： 若应用调整保留时间 tR′计算理论塔板数，
所得值称为有效理论塔板数( n有效或 neff )
分离度(R）计算方法示意图
高效液相谱分离的基本方程式
影响分离度的因素很多，但可 慨刮为三个基本项,(a)柱效项。(b) 柱选择性项(c)柱容量因子项。即 ：
液相色谱基础知识
色谱的发明人
• 俄国科学家：M. S. Tswett
• 正式命名“色谱”的 文献
经典液相色谱
一、色谱起源
色素 玻璃柱
石油醚 碳酸钙颗粒
色谱法简介
• 色谱法（Chromatography）溯源
• 俄国科学家1903年发现色谱的吸附原理，开创 了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸 于俄文的文献
HPLC的仪器配置
数据处理系统
溶剂 流动相 色谱泵（主机） 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器
高效液相色谱基本概念
＊ 色谱峰或色谱谱带 ＊ 基线噪音 ＊ 基线漂移 ＊ 检测限（敏感度） ＊ 色谱峰对称性 ＊ 色谱定性参数 ＊ 色谱柱效能参数
液相色谱图相关术语
• 色谱峰 － Peak
• 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线
基线 ↓
← 色谱峰 峰宽
保留时间（分）
峰高
色谱峰或色谱谱带
流出曲线上的突起部分称为色谱峰 正常色谱峰为对称形正态分布曲线 不对称色谱峰有两种：前延峰和拖尾峰
色谱流出曲线图及相关参数
样品进入色谱柱，经流动相冲洗，由检 测器测得的信号-洗脱时间曲线，即色谱图。
检测限（敏感度）
常用基线噪音的三倍表示： S/N=3
式中： N 为噪音（mV或mAU) S 为信号(mV或mAU)
对称因子计算示意图
色谱峰的对称性—对称因子： a. 拖尾因子 b. 不对称因子
峰对称因子计算公式
对称因子(fs)：
式中： fs=0.95~1.05为正常峰 fs＜0.95为前延峰 fs＞1.05为拖尾峰
色谱柱的柱效 N
理论塔板数计算公式：
液相色谱图相关术语
• 峰面积 － Peak Area
• 峰与峰底之间的面积
• 标准偏差；σ － Standard Error
• 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半
• 拖尾峰 － Tailing Peak
• 后沿较前沿平缓的不对称峰
• 前伸峰 － Leading Peak
• 前沿较后沿平缓的不对称峰
Rs与N、K′及 的关系图示
• 鬼峰 － Ghost Peak
• 并非由试样所产生的峰；亦称假峰
•液相色谱图相关术语
• 基线 － Baseline
• 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的 曲线
• 基线漂移 － Baseline Drift
• 基线随时间定向的缓慢变化
• 基线噪声；N － Baseline Noise
• 高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵 敏度的检测器……
• 广泛应用于各个领域：
• 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业……
• 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
检测器
AB C
DE
G
F
泵输液 进样
分离
检测
记录仪和积分仪-色谱工作站
液相色谱分离机理
高效液相色谱是一种以液体作流动相和固体微粒 作固定相，待测组分在柱内的两相之间进行高速分配 和高效分离的柱液体色谱方法。
样品溶液中的各组分，因其物理化学性质的微小 差异，当其随流动相进入色谱柱后，便在柱的两相之 间产生不同的相互作用力，从而导致柱上迁移速率的 微小差异。
随着流动相的连续推移，这种微小的差异被不断 扩大，直至柱内出现明显不同的迁移距离，使最终达 到组分完全分离。
• 由各种因素所引起的基线波动
• 谱带扩展 － Band Broadening
• 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱 内移动过程中谱带宽度增加的现象
液相色谱图相关术语
• 死时间，t0 － Dead time
• 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需 的时间
• 保留时间，tR － Retention time
• 流动相：种类及配比，等度或梯度 • 固定相：色谱柱类型及内径、粒径、长短 • 流动相流速 • 检测器参数：紫外检测波长或其他检测器相应参数 • 柱温度 • 进样量
• 以上参数即构成一个具体的HPLC方法， • 亦称色谱条件
色谱图：HPLC图形结果
（Chromatogram）
色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的 曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保需的时间
• 死体积，V0 － Dead volume
• 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需 的流动相体积
• 保留体积，VR － Retention volume
• 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积
液相色谱实验所需的基本参数
• 液相色谱实验所需的基本参数
什么是液相色谱
色谱
液相色谱
气相色谱
柱色谱 纸色谱 薄层色谱
气相色谱：流动相是气相 液相色谱：流动相是液相
高效液相色谱 HPLC
什么是高效液相色谱
• High Performance Liquid Chromatography
• 高效液相色谱法，简称：HPLC
• 是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高 效能分离手段：
• 峰的起点与终点之间连接的直线
• 峰高 － Peak Height
• 峰最大值到峰底的距离
• 峰宽 － Peak Width
• 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离
• 半（高）峰宽 － Peak Width at Half Height
• 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之 间的距离
• 1906年正式命名（见诸文献）
• 色谱法；Chromatography
• 50年代开始广泛研究和应用
• 主要是气相色谱及薄层色谱
• 高效液相色谱法的广泛应用始于70年代
色谱分离的机理
色谱是一种分离技术 色谱分离是一个物理过程
流动相（Mobile Phase） 固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的溶质）
W
s
方法
Wtan
16 切线法
Wh
5.54 半峰高
W3s
9
3s
W4s
16
4s
W5s
25
5s
理论板数(n)计算公式
或（通常用）： 若应用调整保留时间 tR′计算理论塔板数，
所得值称为有效理论塔板数( n有效或 neff )
分离度(R）计算方法示意图
高效液相谱分离的基本方程式
影响分离度的因素很多，但可 慨刮为三个基本项,(a)柱效项。(b) 柱选择性项(c)柱容量因子项。即 ：
液相色谱基础知识
色谱的发明人
• 俄国科学家：M. S. Tswett
• 正式命名“色谱”的 文献
经典液相色谱
一、色谱起源
色素 玻璃柱
石油醚 碳酸钙颗粒
色谱法简介
• 色谱法（Chromatography）溯源
• 俄国科学家1903年发现色谱的吸附原理，开创 了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸 于俄文的文献
HPLC的仪器配置
数据处理系统
溶剂 流动相 色谱泵（主机） 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器
高效液相色谱基本概念
＊ 色谱峰或色谱谱带 ＊ 基线噪音 ＊ 基线漂移 ＊ 检测限（敏感度） ＊ 色谱峰对称性 ＊ 色谱定性参数 ＊ 色谱柱效能参数
液相色谱图相关术语
• 色谱峰 － Peak
• 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线
基线 ↓
← 色谱峰 峰宽
保留时间（分）
峰高
色谱峰或色谱谱带
流出曲线上的突起部分称为色谱峰 正常色谱峰为对称形正态分布曲线 不对称色谱峰有两种：前延峰和拖尾峰
色谱流出曲线图及相关参数
样品进入色谱柱，经流动相冲洗，由检 测器测得的信号-洗脱时间曲线，即色谱图。
检测限（敏感度）
常用基线噪音的三倍表示： S/N=3
式中： N 为噪音（mV或mAU) S 为信号(mV或mAU)
对称因子计算示意图
色谱峰的对称性—对称因子： a. 拖尾因子 b. 不对称因子
峰对称因子计算公式
对称因子(fs)：
式中： fs=0.95~1.05为正常峰 fs＜0.95为前延峰 fs＞1.05为拖尾峰
色谱柱的柱效 N
理论塔板数计算公式：
液相色谱图相关术语
• 峰面积 － Peak Area
• 峰与峰底之间的面积
• 标准偏差；σ － Standard Error
• 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半
• 拖尾峰 － Tailing Peak
• 后沿较前沿平缓的不对称峰
• 前伸峰 － Leading Peak
• 前沿较后沿平缓的不对称峰
Rs与N、K′及 的关系图示
• 鬼峰 － Ghost Peak
• 并非由试样所产生的峰；亦称假峰
•液相色谱图相关术语
• 基线 － Baseline
• 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的 曲线
• 基线漂移 － Baseline Drift
• 基线随时间定向的缓慢变化
• 基线噪声；N － Baseline Noise
• 高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵 敏度的检测器……
• 广泛应用于各个领域：
• 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业……
• 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
检测器
AB C
DE
G
F
泵输液 进样
分离
检测
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液相色谱分离机理
高效液相色谱是一种以液体作流动相和固体微粒 作固定相，待测组分在柱内的两相之间进行高速分配 和高效分离的柱液体色谱方法。
样品溶液中的各组分，因其物理化学性质的微小 差异，当其随流动相进入色谱柱后，便在柱的两相之 间产生不同的相互作用力，从而导致柱上迁移速率的 微小差异。
随着流动相的连续推移，这种微小的差异被不断 扩大，直至柱内出现明显不同的迁移距离，使最终达 到组分完全分离。
• 由各种因素所引起的基线波动
• 谱带扩展 － Band Broadening
• 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱 内移动过程中谱带宽度增加的现象
液相色谱图相关术语
• 死时间，t0 － Dead time
• 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需 的时间
• 保留时间，tR － Retention time
• 流动相：种类及配比，等度或梯度 • 固定相：色谱柱类型及内径、粒径、长短 • 流动相流速 • 检测器参数：紫外检测波长或其他检测器相应参数 • 柱温度 • 进样量
• 以上参数即构成一个具体的HPLC方法， • 亦称色谱条件
色谱图：HPLC图形结果
（Chromatogram）
色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的 曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保需的时间
• 死体积，V0 － Dead volume
• 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需 的流动相体积
• 保留体积，VR － Retention volume
• 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积
液相色谱实验所需的基本参数
• 液相色谱实验所需的基本参数
什么是液相色谱
色谱
液相色谱
气相色谱
柱色谱 纸色谱 薄层色谱
气相色谱：流动相是气相 液相色谱：流动相是液相
高效液相色谱 HPLC
什么是高效液相色谱
• High Performance Liquid Chromatography
• 高效液相色谱法，简称：HPLC
• 是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高 效能分离手段：