土壤微生物的分离、培养、鉴定及菌落数的测定
土壤微生物计数法
土壤微生物计数法土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。
土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。
1.1培养计数法1.1.1概要在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。
因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。
这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。
稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。
最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。
根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。
1.1.2稀释平板法一、试剂配制常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。
按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。
凝固后的培养基可加热溶解后使用。
二、仪器设备广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。
三、操作步骤（1）土壤系列稀释液制备取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。
微生物学 实验7 土壤中细菌的分离纯化及计数
2、首先选择平均菌落数在30～300之间的，当只 有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以 该平均菌落数乘其稀释倍数即为该样品的细菌总 数（见下表，例1）。 3、若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之 间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值 小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其 中稀释度(倍数)较小的计算菌落总数（见下表， 例2及例3）。
10-4 稀释度 细 菌 cfu数/平板 每g土壤的CFU数 10-5 10-6
1
2
3
平均 1
2
3
平均 1
2
3
平均
平均菌落数(个) 相应释倍数 CFU/g 100mL 0.2mL 10 g
2、培养时为什么要将培养皿倒置培养？
其它微生物的分离纯化方法
（一）、稀释混合平板法
①按无菌操作要求，用胶头滴管依次吸取10-6、 10-5 、 10-4稀释液各200 uL，分别加入编号为10-6、 10-5 、 10-4的培养皿中。
正置培养过程中，培养基中水分蒸发后，会在培养皿
计算公式：
平均菌落数(个) 相应释倍数 CFU/g 100mL 0.2mL 10 g
平均菌落数——某一稀释度下三个平皿上的菌落平均数； CFU——菌落形成单位（colony-forming units，CFU）； 0.2mL——每个平皿加入的菌悬液体积； 100mL——10-1菌悬液的体积； 10g——称取的土壤重量。
交叉划线法
连续划线法
4、若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应 按稀释度(倍数)最高的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例4）。
5、若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按 稀释度(倍数)最低的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例5）。 6、若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之 间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例6）。
土壤微生物计数法
土壤微生物计数法土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。
土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。
1.1培养计数法1.1.1概要在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。
因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。
这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。
稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。
最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。
根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。
1.1.2稀释平板法一、试剂配制常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。
按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。
凝固后的培养基可加热溶解后使用。
二、仪器设备广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。
（1）土壤系列稀释液制备取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。
土壤中微生物实验报告
一、实验目的1. 了解土壤中微生物的种类和数量；2. 掌握土壤微生物的分离和纯化方法；3. 熟悉微生物的形态和生理生化特性；4. 培养无菌操作和实验记录能力。
二、实验原理土壤是微生物生活的良好环境，其中含有大量微生物，包括细菌、放线菌、真菌、藻类、原生动物、噬菌体、病毒和线虫等。
微生物在土壤中发挥着重要作用，如土壤肥力的维持、植物生长的促进、有机物的分解等。
本实验通过分离和纯化土壤微生物，观察其形态和生理生化特性，进一步了解土壤微生物的种类和功能。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖、酵母提取物、琼脂、无菌水、无菌平板、无菌移液器、显微镜、培养箱等。
2. 实验仪器：天平、酒精灯、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、无菌操作台等。
四、实验方法1. 土壤样品的采集：选取有代表性的土壤样品，注意样品的均匀性和代表性。
2. 土壤微生物的分离和纯化：a. 制备牛肉膏蛋白胨培养基，高压蒸汽灭菌后备用；b. 将土壤样品与无菌水按1:10的比例混合，充分搅拌；c. 将混合液进行系列稀释，取适量稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上；d. 将平板倒置放入恒温培养箱中培养，观察菌落生长情况；e. 挑取单个菌落进行纯化，重复以上步骤，直至获得纯菌株。
3. 微生物的形态观察：a. 将纯菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基，培养后进行显微镜观察；b. 观察菌体的形态、大小、排列方式等特征。
4. 微生物的生理生化特性测定：a. 对纯菌株进行革兰氏染色，观察菌体的染色特性；b. 进行糖发酵试验，观察菌株对葡萄糖、乳糖、麦芽糖等糖类的分解能力；c. 进行氧化酶试验，观察菌株的氧化酶活性。
五、实验结果与分析1. 土壤样品的微生物数量：通过平板计数法，估算土壤样品中的微生物数量。
2. 微生物的分离和纯化：成功分离和纯化出多种微生物，如细菌、放线菌、真菌等。
3. 微生物的形态观察：观察到的菌体形态、大小、排列方式等特征与文献报道相符。
土壤微生物的知识
土壤微生物的知识土壤微生物的知识在我们的学习时代，大家最不陌生的就是知识点吧！知识点是知识中的最小单位，最具体的内容，有时候也叫“考点”。
你知道哪些知识点是真正对我们有帮助的吗？下面是店铺精心整理的土壤微生物的知识，欢迎大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
土壤微生物的知识篇1土壤微生物的采集一般有土样采集、增殖培养、培养分离、筛选最后进行纯种分离、毒性试验等。
1、采样：一般在有机质较多的肥沃土壤中，微生物的数量最多，中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主，酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多，果园、菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多。
选择一定的土壤环境采集土样，将采集到的土样盛入清洁的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。
2、增殖培养：为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。
例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉，纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。
这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。
3、培养分离：尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。
因此还必须分离，纯化。
在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。
纯种分离的方法有划线分离法，稀释分离法。
4、筛选：这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。
关于菌种的识别，细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，每一类微生物在一定培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物。
土壤一般取土壤表层5—10cm处土壤，如果土壤有翻动，应更深一点，避免空气中微生物污染。
1、我们一般都用那种封口袋（塑料的），纸袋不容易保持水分。
2、当天采当天快递回来，不用加冰袋。
土壤微生物的分离纯化与鉴定
目录摘要利用分离纯化微生物的基本操作技术以及选择培养基对土壤中的微生物进行分离与纯化,得到能够产生果胶水解酶的细菌以及能够分解几丁质的霉菌;根据菌落形态观察,革兰氏染色结果,芽孢有无及位置,运动性以及一系列的生理生化试验的结果,对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群;关键词土壤微生物、细菌、果胶、霉菌、几丁质、划线分离、纯培养前言在自然条件下,微生物常常在各种生态系统中群居杂聚;群落是不同种类微物的混和体;为了生产和科研的需要,人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株;这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术;纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代;分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成;实验目的1.学习利用选择培养基从土壤中分离能够产生特殊水解酶的细菌以及霉菌的方法；2.学习运用划线分离法纯化分得的细菌以及真菌的方法；3.学习测定土壤中细菌数目,种类的方法；4.根据菌落形态,染色结果,运动性以及生理生化试验鉴定未知细菌；小室培养法观察鉴定未知真菌;实验原理一、经典分类鉴定方法以上便是在微生物鉴定过程中的经典思路及流程,因此我们可以针对以上各项指标设计一系列试验包括形态学观察,染色,生理生化试验,免疫学试验等对其进行逐步定位;二、现代分类鉴定方法1．微生物遗传型的鉴定（1） DNA碱基比例的测定 G+Cmol%以下为该方法的关键因素：解链温度法Tm值G+Cmol%值只能做否定判断；G+Cmol%值差别>5,属不同的种；差别>10,属不同的属;2 核酸分子杂交法DNA-DNA分子杂交原理：DNA分子解链的可逆性和碱基配对的专一性;结论：I DNA同源性≥ 60% 同种II DNA同源性≥ 70% 同亚种III DNA同源性60~ 70% 不同亚种IV DNA同源性20~ 60% 同属316s rRNA作为细菌进化的计时器本次实验中由于实验性质以及仪器试剂限制,主要以微生物形态鉴定以及生理生化指标鉴定为主;实验整体思路：在确定取样环境之后,对微生物原样进行梯度稀释,产生合适的浓度在选择培养基上进行涂板用于微生物的选择与计数；通过检测得到有特定功能的细菌以及霉菌进行菌种的分离纯化,用平板划线法多次划线得到纯种；对得到的纯种细菌染色并镜检,利用形态学方法以及运动性对微生物做一粗略的定位；根据镜检设计相关生理生化试验作进一步定位；运用小室培养法观察霉菌形态并对其进行鉴定；根据以上获得的信息确定微生物类群并加以定位;实验仪器及材料1.土样：18号土样2.试剂及培养基a)培养基：果胶酶筛选培养基；几丁质酶真菌筛选培养基；果胶酶划线分离培养基；几丁质酶划线培养基；细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基；蛋白胨水培养基b)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95%乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等3.仪器锥形瓶500mL×2；300mL×2；100mL×3、培养皿20套、试管20支、移液管3支、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布等实验步骤A.细菌的筛选,分离纯化及鉴定1.细菌的筛选a)土样处理i.配制生理盐水：在烧杯中配置％的生理盐水,用移液管各移取9ml于五支洁净试管,再移取90ml配置好的生理盐水于三角烧瓶,并放入少许玻璃珠,包好灭菌；ii.加土样：冷却后准确称取10g土样放入盛有90ml无菌生理盐水并带有少许玻璃珠的三角烧瓶中,充分震荡摇匀,然后放在30℃恒温培养箱中静置15min;b)果胶酶菌种筛选i.梯度稀释：用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的试管中充分混匀,此为10-1稀释液,以此类推制成10-2、10-3两种稀释度的土壤溶液如下图；ii.涂布：配制果胶酶筛选培养基,110度灭菌20-30分钟,冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记,分别写上10-1、10-3两种稀释度字样,每稀释度标记三皿,然后用无菌吸管分别由10-3、10-1两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置,每皿准确放入,用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀,其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之均匀分布,然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动,平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；iii.培养：将平板倒置于30℃恒温箱中培养1-2天；iv.果胶酶透明圈平板检测：取10-1涂布平皿,用％的刚果红染色15-20min后,倒掉刚果红,用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈,则说明水解圈内的菌有水解果胶的能力；v.菌落描述：取此菌进行菌落形态描述,就菌落的大小大、中,小,颜色白,黄,粉红等,干湿干、湿,边缘整齐,不整齐,表面光滑,粗糙,有无突起等分别进行阐述并详细记录；2.细菌的分离纯化a)划线分离：制备果胶酶划线培养基,灭菌后倒平板,挑取具有水解圈的菌种,第一次划线分离培养1-2天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离,划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域,然后将接种针在火焰上进行灭菌操作,取含菌种的培养皿,在火图细菌的划线分离示意图焰上方注意：不能离火焰太近打开培养皿盖,先拿接种针在上盖处划线以降温,然后用接种针轻挑所选菌落一到两下,将平皿盖上放好,再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作;操作完毕后对接种针进行灭菌操作,完成后在火焰上方打开平皿盖,将接种针冷却后从1区引线到2区,再如图所示划线,划完后引线到3区,同上进行划线,划线完毕后盖盖平放；b)纯种保藏：再配制一份普通细菌培养基,分装试管后灭菌,制得斜面,将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定;3.细菌的基本形态及运动性鉴定a)纯种果胶酶水解能力的测定配制果胶酶筛选培养基,110度灭菌20-30分钟,冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记,将分离纯化的细菌点种于平板上注意：点种的量不宜过多,以3～4个为宜,在30℃培养箱中培养1～2天,取培养后的平皿用％的刚果红染色15-20min后,倒掉刚果红,用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈,测量并记录透明圈的大小b)简单染色步骤i.涂片取一块载玻片,在上边用胶头滴管加半滴无菌水,用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹,待看到微弱的浑浊即可；注意取菌不要太多ii.干燥与固定涂菌面朝上,通过火焰以干燥并固定菌物,固定过程应使载玻片通过火焰2-3次,注意温度的控制,过热的温度会将细菌杀死,温度以手背感觉微微发烫为标准；iii.染色将载玻片平放于载波片支架上,滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可,染色iv.水洗倾去染液,将载玻片的涂菌面朝下,自来水冲洗,水流不宜太急、太大,至洗出水无色为止；v.干燥用吸水纸吸去多余水分后自然干燥；vi.镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察,先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油,用油镜观察细菌的形态;c)革兰氏染色步骤i.涂片先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域,在另一侧四个区域的位置分别滴加半滴无菌水;分别取四种活跃生长期菌种大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,枯草杆菌和一种自选菌按常规方法涂片不宜过厚,用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对四种菌进行干燥和固定;ii.初染滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位,染色后水洗；iii.媒染先用卢戈氏碘液冲去残留水迹,再用碘液覆盖1min后水洗；iv.脱色先用乙醇冲去水迹,然后用95%乙醇覆盖脱去色素,脱色约30s,立即用水冲洗；v.复染先用番红洗去水迹,然后滴加番红复染后水洗；vi.镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察,先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油,用油镜观察细菌;分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照,来判断枯草杆菌以及另一种自选菌的染色结果;d)芽孢染色步骤i.涂片,加热干燥及固定在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水,分别接种枯草芽孢杆菌及梭状芽孢杆菌;然后按照常规方法加热干燥及固定；ii.孔雀绿加热染色用木夹夹住载玻片,向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位,然后在酒精灯上微微加热孔雀绿着色能力强,加热可使较难染色的芽孢染成绿色,且再难洗脱至染液冒蒸汽开始计时并维持5min,注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜,过热或加热不足均会影响观察效果,且加热时在载玻片上随时补加染液,切勿让涂片干涸；iii.水洗水洗一定要等载玻片冷却后进行,否则可能导致载玻片的破裂;具体水洗按常规方法进行；iv.复染用%番红水溶液复染2min；v.水洗并干燥按常规方法水洗后自然干燥；vi.镜检先在低倍镜下寻找视野范围,然后换用高倍镜调焦,最后加香柏油在油镜下仔细寻找两种细菌以及其周围或内部染成绿色的芽孢;e)半固体穿刺法观察细菌运动性i.配制培养基配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基,分装于4支试管内,110度灭菌20-30分钟,正立于烧杯中冷却至室温；ii.在无菌操作台上右手握接种针,以针挑取菌苔.垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近但勿触及试管底,然后循原路退出;如图所示：iii.接种完成后在30℃条件下培养两天观察并判断其运动性;4.细菌的生理生化试验a)淀粉水解试验i.培养基制备配制淀粉培养基,灭菌后将冷却至50℃左右,无菌操作制成平板；ii.接种用记号笔将平板划成四部分,将所鉴定的菌种在不同位置点种;注：由于四种菌对淀粉的水解程度不同,为防止由于接种量过大导致四种菌对应区域水解部位发生重叠,宜采用点种的方式,如下图;接种完成后贴好标签；iii.培养将上述已接种的平板倒置于30℃培养箱中培养48小时;b)葡萄糖发酵试验i.培养基配制将配制好的葡萄糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名;取盛有葡萄糖发酵培养基的试管2支,接种鉴定菌,另一支作为对照;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;c)乳糖发酵试验i.培养基配制将配制好的乳糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名;取盛有乳糖发酵培养基的试管2支,接种鉴定菌,另一支作为对照;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;d)吲哚试验i.培养基的配制将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上标明所接种的菌名;取盛有蛋白胨水培养基的试管2支,接种鉴定的菌种;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;e)甲基红试验i.培养基的配制将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上标明所接种的菌名;取盛有蛋白胨水培养基的试管2支,接种鉴定的菌种;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;5.土壤中分解果胶细菌种类和数目的测定及纯化细菌菌属鉴定取培养三天的菌液1000倍稀释涂布平板3个,观察不同形态菌落的数目以及总菌落数,并记录,求3个平板的总菌数平均值来计算1g土壤中分解果胶的细菌数目;根据以上细菌的形态,革兰氏染色结果,芽孢的位置,运动性以及生理生化试验结果查看伯杰手册对纯种细菌做出鉴定;B.霉菌的筛选,分离纯化及鉴定1.霉菌的筛选a)涂布配制几丁质酶筛选培养基,110度灭菌20-30分钟,冷却至不烫手,无菌操作加链霉素1mL/1000mL倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记,分别写上100、10-2两种稀释度字样,每稀释度标记三皿,然后用无菌吸管分别由100、10-2两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置,每皿准确放入,用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀,其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之均匀分布,然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动,平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；b)培养将平板倒置于30℃恒温箱中培养2-3天；2.霉菌的分离纯化a)划线分离：制备几丁质酶划线培养基,灭菌后倒平板,挑取长出的菌种,第一次划线分离培养2-3天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离,划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域,然后将接种针在火焰上进行灭菌操作,取含菌种的培养皿,在火焰上方注意：不能离火焰太近打开培养皿盖,先拿接种针在上盖处划线以图霉菌的划线分离示意图降温,然后用接种针轻挑所选菌落一到两下,将平皿盖上放好,再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作;操作完毕后对接种针进行灭菌操作,完成后在火焰上方打开平皿盖,将接种针冷却后从1区引线到2区,再如图所示划线,划完后引线到3区,同上进行划线,划线完毕后盖盖平放；b)再配制一份PDA培养基,分装试管后灭菌,制得斜面,将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定;3.小室培养法鉴定霉菌a)灭菌准备制作4个平皿,在每个平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片,再放一U形玻棒,其上放一洁净载玻片和四块盖玻片,盖上皿盖、再与1个空平皿一起用牛皮纸包好；在100mL锥形瓶中用甘油配制20%的甘油,加塞包好；最后取10mL 移液管两支用牛皮纸包好;b)灭菌将上述用牛皮纸包好的仪器与试剂连同配好的PDA培养基一并放入灭菌锅中110℃灭菌30min由于培养基中有葡萄糖,为防止由于高温而使糖发生糊化而变质,灭菌温度不宜过高;c)制作琼脂薄片在无菌操作台上分别取已灭菌并溶化冷却至约50℃的马铃薯琼脂培养基6～7mL 注入两个灭菌空平皿中,使之凝固成薄层;在两个凝固后的平板背部用记号笔画下约1～×1～的方格,通过无菌操作,用解剖刀沿画下的方格线将其切成方形的琼脂块;注：解剖刀使用前应先在酒精中浸泡,然后在酒精灯上灼烧,冷却后再进行切割操作d)接种在无菌操作台上,先用镊子将载玻片放于U型玻璃管上,然后用解剖刀取一小块儿琼脂块,置于载玻片上注意：镊子与解剖刀每次使用前都应先在酒精中浸泡,灼烧冷却后再进行下一步的操作,用接种环分别从斜面培养物上挑取很少量的鉴定菌的孢子,分别接种于培养小室中琼脂块的边缘上,用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上;最后用移液管在培养小室中的圆滤纸上加3ml 灭菌的20 %的甘油用于保持平皿内的湿度 ,盖上皿盖并贴标签,每一种菌接种两个小室;e)恒温培养将接种后的平皿正置于28℃培养箱中恒温培养3～4天;f)镜检在显微镜下直接观察小室培养后的载玻片,用低倍镜即可较为清晰的观察到霉菌的菌丝体及孢子,根据真菌手册对所得的菌进行鉴定;实验结果A.细菌部分倍稀释平板的细菌种类和数目表错误!未定义书签。
微生物检验的基本内容
微生物检验的基本内容微生物检验是一种通过对样本中的微生物进行分离、培养和鉴定的方法，用于检测和确认样本中是否存在微生物，并确定其种类和数量。
微生物检验在医学、食品安全、环境保护等领域具有重要的应用价值。
本文将介绍微生物检验的基本内容，包括样本采集、分离培养、鉴定和计数等步骤。
一、样本采集微生物检验的第一步是采集样本。
样本可以是各种物质，如食品、水、空气、土壤、人体组织和体液等。
采集样本时需要注意保持样本的无菌状态，避免外界的污染。
常用的采样方法包括直接刮取、吸取、冲洗和切割等。
二、分离培养分离培养是微生物检验的核心步骤，目的是将样本中的微生物分离出来，并使其在培养基上生长成单独的菌落。
分离培养可以采用液体培养和固体培养两种方法。
液体培养适用于检测微生物总数和特定菌群的数量，而固体培养适用于分离和鉴定不同种类的微生物。
分离培养的关键是选择适当的培养基和培养条件。
培养基应包含必需的营养物质，如碳源、氮源、无机盐和水分等，以满足微生物生长的需要。
培养条件包括温度、pH值、氧气浓度和湿度等，不同微生物对这些条件的要求各不相同。
因此，在进行分离培养时需要根据待检测微生物的特性来选择适当的培养基和培养条件。
三、鉴定鉴定是确定分离出的微生物种类的过程。
鉴定微生物可以从形态学、生理生化特性、生长习性和分子生物学等方面进行。
形态学鉴定是通过观察微生物的形状、大小、颜色和结构等特征来判断其种类。
生理生化特性鉴定是通过检测微生物对不同营养物质的利用、产物的生成和酶的活性等来判断其代谢特征。
生长习性鉴定是通过观察微生物的生长速度、温度范围和耐受性等来判断其生态特征。
分子生物学鉴定是通过检测微生物的DNA或RNA序列来判断其遗传关系和亲缘关系。
鉴定微生物的方法有很多种，如显微镜观察、生化试验、培养基特性和PCR等。
根据待鉴定微生物的特点和需要，可以选择适当的方法进行鉴定。
鉴定的结果应与已知的微生物参考库进行对比，以确定待鉴定微生物的种类和名称。
土壤中微生物的分离与鉴定实验报告
Sdu微生物大实验土壤微生物的分离纯化与鉴定【实验目的】1、从各地区土壤中筛选含几丁质酶的真菌及含果胶酶的菌株；2、通过从土壤中分离纯化菌株，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的筛选、分离纯化方法和无菌操作技术。
3、复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。
4、掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。
【实验原理】1、微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
此次实验采取平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：a.选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。
b.微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。
微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。
前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。
2、霉菌：霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。
霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。
霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3-10μm ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。
观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本实验采用载玻片培养观察法。
3、果胶酶筛选培养基：配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。
刚果红（Congo Red,简称CR）是一种染料，它可与果胶形成红色复合物，但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反应，在含有果胶的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物。
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吉林化工学院科技性论文题目：土壤微生物的分离、培养、鉴定及菌落数的测定学号：12130117姓名：张金磊年级：2012级学院：化工与生物技术学院专业：生物工程指导教师：谢莹，许崇利（讲师）完成日期：2014年3月20 日摘要土壤是矿物质、有机质和活的有机体以及水分和空气等的混合体。
按重量计，矿物质占到固相部分（土壤干重）的90~95%或更多，有机质约占1~10%，可见土壤成分以矿物质为主。
土壤有机质就是土壤中以各种形态存在的有机化合物。
除此之外还有土壤溶液，它是土壤水分及其所含的溶解物质和悬浮物质的总称。
土壤溶液是植物和微生物从土壤中吸收营养物的媒介。
土壤微生物就是土壤中主要的有机生命体，土壤微生物是指生活在土壤中的细菌、真菌、放线菌、藻类的总称。
其个体微小，一般以微米或毫微米来计算，通常1克土壤中有106～109个，其种类和数量随成土环境及其土层深度的不同而变化。
它们在土壤中进行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等过程，促进土壤有机质的分解和养分的转化。
本次实验是研究土壤中细菌、真菌、放线菌的数目。
我们利用选择培养基，以便在土壤水溶液中选出目的菌种，在用分浓度梯度法在选择培养基上培养出但菌落，以便计数。
计数时可以根据不同菌种的不同形态学特征来分辨，如果出现与上述三种以外特性的菌种可以用革兰氏染色鉴别。
关键词：土壤微生物选择培养计数AbstractSoil is a mixture of minerals, organic matter and living organisms as well as water and air. By weight, for solid mineral (soil dry weight) of 90~95% or more, organic matter accounted for about 1~10%, visible in mineral soil composition. Organic compounds in soil organic matter is the soil in various forms. In addition to the soil solution, it is the floorboard of soil moisture and the contained dissolved substances and suspended substances. Soil solution is to absorb the nutrients in plants and microorganisms in soil medium. Organic life is the main soil microorganism, soil microbial refers to live in soil bacteria, fungi, actinomycetes, algae. The individual small, general with micron or nanometer to calculate, usually 1 grams of soil in 106 ~ 109, its species and quantity as soil environment and soil depth varies. They are oxidation, nitration, ammoniation, nitrogen fixation, curing process in the soil, promote the transformation of soil organic matter decomposition and nutrient.This experiment is to study the number of soil bacteria, fungi, actinomycetes. We use the selective culture medium, in order to choose to bacteria in the soil solution in the culture medium, but colonies on selection by density gradient method,in order to count. Counting according to the different morphological characteristics of different strains to distinguish, if appear with the three kinds of characteristics of bacteria can differential staining with gram.Keywords: soil microbial culture counting目录前言 (6)1 材料与方法 (7)1.1材料 (7)1.1.1菌株来源 (7)1.1.2培养基 (7)1.1.3相关试剂的配制 (7)1.1.4主要的实验药品与仪器 (8)1.2 实验方法 (8)1.2.1细菌分离 (8)1.2.2放线菌分离 (9)1.2.3霉菌分离 (9)2 结果与讨论 (9)3 结论 (10)致谢 (10)文献参考 (11)声明 (11)前言土壤中含有大量的微生物,不同深度,不同地点的微生物含量,种类也大不相同,本次实验使用的是来自于玉龙山的15厘米深度的腐殖土,土壤溶液较多,微生物的含量及健康状况良好,是优良的实验材料.本次实验要观察土壤中细菌、真菌、放线菌的数目,以实验要求我们使用牛肉膏蛋白胨培养基,高氏一号培养基,马丁氏培养基来选择培养相应菌种.考虑到本实验计数的目的,所以所有培养基均是固体培养基,且为了方便计数,从相关网站查到有关土壤平均含菌信息,制定出合理的浓度梯度,使之能在涂布培养后出现完全的单菌落.1 材料与方法1.1材料1.1.1 菌种来源土壤中细菌、真菌、放线菌,均由实验前各实验组同学取至玉龙山表层15厘米深的腐殖土.1.2.2 培养基牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏0.3g、蛋白胨1g、NaCl 0.5g、琼脂1.5g、水100ml、pH 7.2—7.4高氏一号培养基:可溶性淀粉 20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4 0.01g，琼脂 20g，水 1000ml,pH=7.2-7.4 马丁氏培养基：KH2PO4 1g，MgSO4 0．5g，蛋白胨 5g，葡萄糖 10g，琼脂 16g，水 1000ml，链霉素溶液（10000U/ml） 3.3ml（临用前加入）1.1.3相关试剂的配制牛肉膏蛋白胨培养基:分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2/3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏至于另一小烧杯中，进行称量。
然后加入少量蒸馏水至于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。
将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
加所需的琼脂与三角瓶中，再将定容好的培养基倒入三角瓶中，待溶液冷却后，用1mol/L NaOH 溶液调pH=7.2-7.4。
然后分装，加塞，包装。
高压蒸汽灭菌20分钟。
高氏一号培养基:称取可溶性淀粉，置于烧杯中，加入少量的蒸馏水；加热使其溶化，再分别量取KNO3，K2HPO4，MgSO4，NaCl。
然后加入上述烧杯中。
将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
加所需的琼脂与三角瓶中，再将定容好的培养基倒入三角瓶中，待溶液冷却后，用1mol/L NaOH 溶液调pH=7.2-7.4。
然后分装，加塞，包装。
高压蒸汽灭菌20分钟。
马丁氏培养基：分别称取培养基各组分所需，加入所需水量的2/3左右的蒸馏水于烧杯中；再将培养基营养物质加入其中，溶解。
将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。
加所需的琼脂与三角瓶中，再将定容好的培养基倒入三角瓶中，待溶液冷却后，用1mol/L NaOH 溶液调pH=7.2-7.4。
然后分装，加塞，包装。
高压蒸汽灭菌20分钟。
临用前加热培养基至60度，按3.3ml/L加入链霉素溶液，迅速混匀。
1.1.4主要的实验药品与仪器（1）实验药品:牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂；1mol/L NaOH， 1mol/L HCl, 可溶性淀粉， KNO3 , K2HPO4, MgSO4 ，FeSO4，KH2PO4，葡萄糖（2）实验仪器:试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，扭力天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH 5.5—9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。
1.2 实验方法1.2.1细菌分离：取土样1g，加入99ml无菌水中，震荡10min，制成10-2土壤稀释液，再取0.5ml 10-2土壤稀释液加入4.5ml 无菌水中，制成10-3土壤稀释液，以此类推······。
取10-5，10-6，10-7土壤稀释液0.1ml加入相应编号培养基中，涂平板，每个稀释度两个平板。
在30度恒温培养箱中培养24h后观察结果。
1.2.2放线菌分离：取土样1g，加入99ml无菌水中，震荡5min，制成10-2土壤稀释液，再取0.5ml 10-2土壤稀释液加入4.5ml无菌水中，制成10-3土壤稀释液，以此类推······。
取10-3，10-4，10-5土壤稀释液0.1ml加入相应编号培养基中，涂平板，每个稀释度两个平板。
在28度恒温培养箱中培养5~7d后观察结果。
1.2.3霉菌分离：取土样5g，加入95ml无菌水中，震荡5min，制成10-2土壤稀释液，再取0.5ml 10-2土壤稀释液加入4.5ml 无菌水中，制成10-3土壤稀释液，以此类推······。
将以灭菌的培养基融化，加入链霉素溶液，但培养基凝固后，取10-2，10-3，10-4土壤稀释液0.1ml加入相应编号培养基中，涂平板，每个稀释度两个平板。
在28度恒温培养箱中培养3~5d后观察结果。
2 结果与讨论当培养结束后，观察培养基上的菌落，由于本次试验的各种经济，效果，作用等等方面的原因，培养基并不能完全分离土壤中的各种菌类，例如，土壤中除了细菌，霉菌，放线菌外还有大量的杂菌，如：酵母菌、真菌、藻类等，微生物，如：各种寄生虫（卵）等，所以我们要根据细菌，放线菌，霉菌的宏观物理特性来分别。
当进行显微观察时，霉菌不用染色，放线菌、细菌要进行简单的染色，然后再显微镜下观察菌体形态。