医学研究中细胞培养技术实验指南
《细胞培养技术》课程教学大纲
《细胞生物学（技术）》课程教学大纲课程中文名称：细胞生物学（技术）课程英文名称：technique of cell culture学分：2总学时：36实验学时：30课程性质：学位公选课适应研究生专业：生命科学、生物技术、医学基础研究一、本课程的性质和任务细胞培养技术作为研究工作的基本技术已经广泛应用于生命科学各研究领域。
细胞培养技术教学大纲是根据生命科学、生物技术专业人才的培养目标所需要的基本理论和基本技能的要求，根据本课程的教学性质、条件和教学实践而制定的。
细胞培养技术是生物学所有专业的一门专业基础课程，是一门独立的实验课程，同时也是为了配合基础研究中需要操作细胞实验的研究生开设的一门实验课程。
本课程目的旨在初步掌握细胞学研究中所必需的基本实验技术。
本课程的任务是让学生牢固掌握细胞生物学研究方法与技术，具备细胞培养中观察和研究的基本方法，学会发现问题和解决问题的基本技能，通过实验，培养学生观察、比较、分析、综合等科学思维能力，以及独立工作的能力和实事求是的科学作风，同时要求学生初步具备进行细胞学实验创新性研究的基本能力与素质。
二、本课程的教学内容和基本要求基本了解细胞培养的基础知识及应用范围，基本掌握细胞培养的操作技术。
本课程以实验操作为主。
因此，教学中应讲清基本知识，实验示教要规范，并要组织好学生的实习操作。
学生学习时应在了解基本知识的基础上，认真地按要求实际操作，以初步掌握各项实验技术的原则和要领。
1．要求学生认真预习实验指导书，理解实验原理及实验方案，掌握正确操作规程；上课亲自动手操作，作好实验记录，实验结束后详细整理、统计、分析实验结果；写出实验报告。
2．掌握细胞培养一般操作和实验规则；熟悉各种常用试剂配制；具备从事细胞生物学研究工作所必需的基本技能。
通过本课程的学习，使学生了解细胞培养的基本知识，初步掌握基本培养技术及观察、检测方法，为进一步学习及科研实验奠定基础。
一、细胞培养概论（集中授课，理论课，3学时）二、组织细胞的原代培养（1）实验课3 学时必修验证采用组织块培养法对胎鼠组织进行原代培养，观察细胞培养和生长状况。
病毒的细胞培养操作流程
病毒的细胞培养操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤细胞培养是一种在体外培养和繁殖细胞的方法，广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域。
下面是细胞培养的操作步骤，包括细胞的收获、传代和检测。
1.材料准备：- 细胞培养基：选择适合细胞类型和培养要求的培养基，常用的包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）等。
-细胞：选择合适的细胞系，如人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。
-细胞培养器具：包括培养皿、细胞培养瓶、细胞离心管等。
2.细胞收获：-细胞培养器具消毒：用70%乙醇或其他消毒剂将培养器具进行消毒。
-细胞培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞培养皿涂覆：将培养皿或瓶子内壁涂覆一层细胞黏附物，如明胶或聚-卵氨酸等，以增加细胞附着。
3.细胞传代：-培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞收获：将细胞培养瓶中的培养基倒掉，用生理盐水等缓冲液洗涤细胞。
- 细胞分离：使用胰酶（Trypsin）或胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）将细胞从细胞培养瓶上析离下来。
-细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。
-细胞培养：将细胞培养在新的细胞培养瓶中，加入适量的预热培养基。
4.细胞检测：-细胞形态观察：使用倒置显微镜或显微摄像系统观察细胞的形态变化和增殖情况。
- 细胞活力检测：使用细胞活力检测试剂，如MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）或CCK-8（Cell Counting Kit-8）等，评估细胞的存活率和代谢活力。
- 细胞凋亡检测：使用凋亡检测试剂盒，如Annexin V-FITC和PI （Propidium Iodide）等，评估细胞凋亡的程度。
干细胞培养基的配制及培养方法指南
干细胞培养基的配制及培养方法指南干细胞（Stem Cells）是具有自我更新和多能分化能力的一类特殊细胞，具有广泛的潜在应用前景。
在干细胞研究中，正确的培养基配制及培养方法是确保细胞生长和分化的关键。
本文将为您介绍干细胞培养基的配制及培养方法指南，以帮助您顺利进行实验。
首先，让我们来了解一下干细胞培养基的组成。
一般来说，基本的干细胞培养基主要包括培养基基础（Basal Medium）和补充物（Supplement）。
培养基基础是为细胞提供必需的营养物质和生长因子，而补充物则可以根据实验需求来进行选择和添加。
一、干细胞培养基的配制1. 首先，准备好培养基基础。
常用的干细胞培养基基础有DMEM/F12、RPMI 1640、E8等。
您可以根据实验的需要选择适合的基础培养基。
2. 接下来，选择适当的补充物。
常用的补充物包括胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）、基础纤维生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor, bFGF）、人血小板衍生生长因子（Platelet-Derived Growth Factor, PDGF）等。
具体选择和添加的补充物应根据干细胞类型和实验目的来确定。
3. 正确控制pH值。
将培养基基础和补充物按照比例混合后，使用pH计检测pH值，通常干细胞培养基的pH值应保持在7.2-7.4之间。
4. 最后，将配制好的培养基过滤以去除可能存在的微生物，然后储存在低温环境中，避免光照和冻结。
二、干细胞培养方法指南1. 准备培养皿。
选择含有黏附因子的培养皿，如明胶、凝胶体、胎牛血清等。
在使用之前，进行预处理，以去除可能存在的细菌和残留的化学物质。
2. 培养基更换和细胞分割。
干细胞培养过程中，定期更换培养基以提供新鲜的养分和生长因子。
另外，当细胞达到一定程度的密度时，需要将其分割为合适的尺寸，以保持细胞的良好生长。
3. 细胞培养环境的控制。
干细胞在培养过程中对环境的要求较高，需要在无菌和恒温的环境下进行培养。
《生物学实验操作手册》
生物学实验操作手册1. 实验介绍在本操作手册中，将为您提供一系列生物学实验的操作指南。
这些实验涵盖了从基础的生物学概念到高级的实验技术。
通过遵循本手册中的步骤，您将能够掌握各种生物学实验的基本操作和技能。
2. 实验分类2.1 细胞生物学实验•环境对细胞形态的影响：包括温度、pH值、离子浓度等因素对细胞形态和功能的影响。
•染色体核型分析：使用显微镜观察染色体，并进行核型分析。
•细胞培养与维护：培养和繁殖不同类型的细胞系。
2.2 分子生物学实验•蛋白质表达与纯化：利用细菌或其他表达系统表达目标蛋白，并进行纯化。
•DNA/RNA提取和纯化：从生物样品中提取DNA/RNA，并进行纯化。
•PCR扩增：使用聚合酶链反应（PCR）方法扩增目标DNA片段。
2.3 遗传学实验•杂交与基因组分析：通过杂交实验和基因组分析确定遗传物质的传递方式。
•基因突变分析：利用不同突变体进行基因功能鉴定。
•遗传连锁和基因定位：通过遗传连锁和基因定位方法确定基因的位置。
3. 实验步骤示例3.1 细胞生物学实验中的步骤示例实验名称：观察温度对细胞形态的影响1.准备培养细胞所需的培养基及培养器具。
2.将细胞接种到已经预先消毒并加入培养基的培养皿中。
3.设立不同温度条件下的实验组，将培养皿置于恒温箱中。
4.观察细胞在不同温度条件下的形态变化，并记录相应数据。
5.结束实验后，根据数据结果进行统计和分析。
3.2 分子生物学实验中的步骤示例实验名称：DNA提取与纯化1.准备待提取DNA的生物样本，如血液或植物组织等。
2.使用特定试剂对样本进行细胞破碎和溶解。
3.添加相关酶和缓冲液，促使DNA释放并与其他细胞组分分离。
4.经过离心等步骤，收集纯化后的DNA溶液。
5.使用吸光光度计或凝胶电泳等方法检测DNA提取纯度和浓度。
3.3 遗传学实验中的步骤示例实验名称：杂交实验确定基因型1.准备不同基因型的个体进行交叉杂交。
2.收集得到的杂种后代，并对其表型进行观察和记录。
细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤细胞冻存细胞复苏1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基、培养皿、细胞传代液等。
2.涂覆培养皿：将培养皿内涂覆一层适宜的基质（如凝胶、基质蛋白等）使细胞黏附在培养皿表面。
3.移植细胞：将细胞传代液中的细胞取出，经过适当的处理（如洗涤），将其转移到新的培养皿中。
可选择不同的分离方法，如以胰酶来切割细胞聚集物或以细胞转染剂来解离细胞。
4.培养细胞：将新的培养皿放入恒温培养箱中，提供适宜的培养基和环境条件（如温度、湿度、CO2浓度等），使细胞可以继续增殖和生长。
5.观察细胞生长：每天观察细胞的形态、数量和健康状况，记录细胞的生长曲线和其他相关信息。
6.传代细胞：当细胞生长到达一定程度（一般为80-90%的密度）时，可将细胞传代到新的培养皿中。
首先将细胞培养液抽吸并丢弃，并用适当的缓冲液（如PBS）洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。
接着加入胰酶等酶消化液，使细胞分离，并加入培养基将细胞转入新的培养皿中。
7.重复培养：重复以上步骤，使细胞不断地进行传代培养。
细胞冻存及复苏：细胞冻存是将细胞在低温条件下保存，以便长期保持细胞的活力和功能。
细胞冻存可避免细胞在传代培养中的漂变和突变，并保持细胞库的物种多样性。
而细胞复苏则是指将冻存的细胞重新从冷冻状态回复到活跃状态，以供进一步的研究或应用。
细胞冻存及复苏的步骤如下：1.准备培养器具和试剂：清洁并消毒培养器具，准备好所需的培养基和冻存液。
2.预培养：将要冻存的细胞在新鲜的培养基中进行预培养，以使细胞处于最佳的生长状态。
3.细胞冻存液配制：根据细胞的特性和需要，配制适宜的冻存液。
一般来说，冻存液中含有维持细胞生存的缓冲剂、保护剂（如DMSO）、营养物质和蛋白质（如血清）等。
4.细胞冻存：将细胞培养液去掉，并用PBS洗涤细胞数次，以去除细胞培养液中的残留物。
然后加入适量的冻存液，使细胞和冻存液混合均匀。
最后将混合物分装到试管或冷冻管中，并迅速放入低温处。
细胞培养操作指南
细胞培养操作指南细胞培养操作指南1，原代细胞培养原代培养需要严格要求：（1）取材时需要去除脂肪和坏死的组织(2)为减少对组织的损伤，需用锋利的器具(3)适度离心以去除用于解离的酶（4）由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。
（5）营养丰富的培养基比单一的培养基更可取，如果要添加血清，胎牛血清比牛马的血清更好。
(6)对于取材部位易于感染（如皮肤）应先用70%乙醇消毒，在无菌条件下切除组织，尽快转移入BSS或培养基中。
不要再培养室取材，因为动物可引入微生物污染。
若必须推迟，可保存在4℃，72h。
1. 剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。
再次清洗后，用手术剪将组织剪成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。
静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。
2. 消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。
3. 培养细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为2～5×105 cells／m1，或实验所需密度。
分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。
置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。
一般3～5d，原代培养细胞可以粘附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3 d后换液，一般7～14 d可以长满瓶壁，进行传代。
注意事项：1. 无菌操作细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般是很难消除。
2. 培养液所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。
由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。
小鼠细胞实验培养步骤
小鼠细胞试验培养步骤小鼠细胞常用的分别方法有两种，一种是贴块法，一种是消化法，这两种方法都可以用于分别和培养原代细胞。
一、试验分别和培养步骤1. 小鼠颈椎脱臼处以死刑后，剃除腹胸部的被毛，放入装有75%酒精的烧杯中浸泡5min。
2. 取出小鼠，在无菌环境下打开胸腔，取出心脏组织，注入盛有无菌1×PBS的培养皿中，洗净组织表面的血液。
3. 将清洗干净的心脏组织转入装有75%酒精的培养皿中浸泡15s以杀死大多数的心脏被膜细胞，浸泡完成后赶忙转入装有无菌1×PBS的培养皿中震荡清洗。
4. 清洗完成后，用剪刀镊子搭配除掉自动脉弓和心房组织，仅保管心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室内的血液。
5. 将清洗干净的心室组织用剪刀减成1mm3大小左右的碎块，之后用PBS清洗若干次后按下述两种方法之一进行后续操作。
A. 贴块法6. 将清洗好的碎块转入另一培养皿中，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡组织，室温消化3—5 min。
7. 消化完成后，添加数毫升FBS停止消化，之后吸弃液体，加PBS清洗组织块1伺次后，用200 ul吸头将组织块平均接种于T—25培养瓶的培养面上，之后将培养瓶放置于37℃二氧化碳培养箱中，静置2—4h。
8. 待组织处于略微脱水的状态时，小心添加2ml培养基，添加时注意尽量不要将组织块冲起，要使培养基接触全部的组织块。
9. 之后放入培养箱中连续培养，一般2—4天后成纤维细胞会从组织块四周爬出，待爬出的细胞有较多数量时，可将细胞消化下来，去除组织块，转入另一培养瓶中培养。
B. 消化法6. 将清洗好的碎块转入另一离心管中，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型胶原酶）37℃水浴消化8 min后，吸取上层混悬液弃去。
7. 余下组织加入混合消化液10 ml，37℃水浴震荡消化10 min；吸取上层悬液至另一离心管中，加入适量FBS停止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3—5次，直至组织块消化。
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医学研究中细胞培养技术实验指南
细胞培养技术是医学研究中不可或缺的重要手段之一，
它为研究人类疾病、药物筛选和治疗方案提供了有力的工具。
本文将为您介绍细胞培养技术实验的指南，帮助您更
好地开展医学研究中的细胞培养实验。
一、细胞培养基准备
细胞培养基是细胞生长和繁殖所必需的基础培养环境，
正确配制培养基是实验成功的关键。
1.1 选择合适的培养基
根据所研究的细胞类型选择适合的培养基，通常，最常
用的培养基有DMEM、MEM和RPMI 1640等。
另外，根
据实验需要，可以添加胎牛血清、人血清、抗生素和生长
因子等。
1.2 培养基的配方与储存
根据细胞类型和实验需要，制备培养基的配制液，遵循
供应商提供的配方和使用说明。
配制好的培养基应储存在4℃冰箱中，避免阳光直射，保质期根据供应商指引执行。
二、细胞培养槽和培养器具准备
保持实验环境的清洁和无菌是细胞培养实验中的另一个
关键点。
2.1 准备培养槽和培养器具
将所需培养槽、培养瓶、离心管、吸头、培养皿、离心
机等培养器具在高压蒸汽灭菌锅或培养箱中进行高温高压
灭菌。
培养槽在灭菌后应放置在无尘台上，注意避免污染。
2.2 储备适量的试剂和培养物品
体外培养需要用到的培养基、胎牛血清、人血清、生长
因子、抗生素等试剂必须事先准备好，并按照实验操作规
范使用。
三、细胞的分离和培养
细胞的有效分离和培养对保证实验结果的准确性至关重要。
3.1 细胞的分离
根据所要研究的细胞类型选择合适的方法进行细胞的分离，如胰蛋白酶消化法、组织弹性体分离法以及银离子胶
体沉淀分离法等。
在进行细胞分离前，务必将所有操作具
备无菌条件，避免外界环境的污染。
3.2 细胞的培养
将分离得到的细胞用预先准备好的培养基进行悬浮培养。
培养器具需先预先灭菌处理，避免细胞感染。
培养皿或培
养瓶中应添加适量的培养基，根据实验需要添加相应的血清、生长因子等。
将需要培养的细胞分散均匀地加入培养
器具中，将培养器具放入恒温培养箱中，维持适当的温度、湿度和二氧化碳浓度。
四、培养环境的维护与监测
为了保证细胞的生长和繁殖，保持适宜的培养环境是必
不可少的。
4.1 细胞培养箱的温度和湿度控制
使用培养箱时，需事先设定合适的温度和湿度。
细胞一
般在37℃恒温环境下培养，湿度的控制在95%或更高。
定
期检查培养箱的温度和湿度，确保其处于稳定和合适的状态。
4.2 CO2浓度和pH值的控制
大多数成纤维细胞和肿瘤细胞在体外培养时需要适宜的CO2浓度（一般为5%）。
使用CO2培养箱或CO2孵化器时，需设定CO2浓度以及培养箱内的pH值，确保细胞处
于最适宜的培养环境。
五、细胞的分裂和传代
随着细胞的分裂和生长，细胞密度不断增加。
为了保证
细胞的正常生长和降低细胞变异的风险，需要进行定期的
传代。
5.1 定期检查细胞状态
通过显微镜观察细胞的生长状态，如形态、色素变化等，以及细胞的密度和附着性，根据细胞状态判断是否需要进
行传代。
5.2 细胞的传代
传代前先准备好新的培养器具和培养基。
将已达到传代
标准的细胞用胰蛋白酶等酶进行消化，分散成单细胞悬浮液。
将适量的悬浮液转移到新的培养器具中，加入新的培
养基。
根据细胞类型的不同，传代时间和比例也有所差异，需根据实验需要进行相应的操作。
六、细胞冻存与复苏
为了长期保存和备份细胞，细胞的冻存是一项重要的操作。
6.1 细胞冻存液的配制
制备适当的冻存液，一般由培养基和甘油、DMSO等冷冻保护剂组成。
冻存液需事先准备好，并进行筛选和优化，以保证细胞的良好保存和复苏率。
6.2 细胞冻存和解冻方法
根据细胞类型和实验需要，选用合适的冻存和解冻方法。
通常，将细胞在适宜细胞密度下与冻存液混匀后分装到冻
存管中，迅速降温并保存在液氮罐中。
对于解冻，将冻存
管立即置于37℃水浴中直至解冻，并迅速将细胞转入预先
准备好的培养器具中。
通过本文所给的细胞培养技术实验指南，相信您能更好
地开展医学研究中的细胞培养实验。
请根据具体实验需求，结合实验室条件和细胞类型的特点，进行相应的实验操作
和优化。
当然，实验中可能会遇到各种挑战和问题，建议
及时与研究团队、导师或实验室同事讨论交流，共同解决。
祝您实验顺利，取得理想的研究结果！。