细胞实验操作流程
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
细胞生物学实验操作指南
细胞生物学实验操作指南目录1．洗涤与灭菌1.1细胞培养瓶1.2小烧杯、吹管1.3盐水瓶1.4瓶盖、胶塞1.5塑料器皿1.6附注：洗液配方（次强酸液）2．配置常用溶液2.1 平衡盐溶液2.2 pH调整液2.3 抗生素液2.3.1 青霉素+链霉素2.3.2 两性霉素2.3.3 G4182.3.4 潮霉素2.4 消化液2.5 培养基2.5.1 配置2.5.2 使用3．培养操作基本要求无菌操作一．洗涤与灭菌在组织培养中，离体细胞对任何有害物质都十分敏感。
有害物质包括微生物、细胞残余物以及非营养成分的化学物质。
因此对新采用和重新使用的培养器皿，都要严格清洗。
1．细胞培养瓶：(1)浸泡：初次使用和培养用后的玻璃器皿都需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶解掉。
新的玻璃器皿，玻面常带有许多干涸的灰尘，同时在生产过程中，玻璃表面常呈碱性并带有一些对细胞有毒的物质，如铅和砷等。
新瓶使用前应先用自来水简单冲洗，然后用稀盐酸(5%)浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。
培养后的玻璃器皿往往附有大量蛋白质，干涸后不易刷洗掉，故用后要立即浸入清水中；注意让水能完全进入瓶皿中，不应留有气泡。
(2)刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般仍然要用毛刷沾洗涤剂洗涤，以除去器皿表面的附着较牢的杂质。
刷洗次数太多，能损害器皿表面光泽度，所以应选用软毛刷和优质的洗涤剂（如高级洗衣粉或洗洁精），绝对不能使用含沙粒的去污粉！洗刷时特别注意洗刷瓶角部位。
可以将洗涤剂倒入浸泡培养瓶的清水中，直接在水中进行刷洗，然后再以清水冲洗干净。
(3)泡酸：刷洗不掉的极微量杂质经过硫酸和重铬酸钾洗液的强氧化作用后，可被除掉。
洗液对玻璃器皿无腐蚀作用，去污能力很强，是清洗过程中关键的一环。
浸泡时，器皿要充满洗液，勿留气泡。
浸泡时间不应少于6小时，一般应浸泡过夜。
注意，泡酸时要戴防酸手套，否则将损伤皮肤。
(4)冲洗：泡酸后必须用水充分冲洗，使之不留任何残迹。
冲洗时每瓶都要用水灌满，倒掉。
细胞实验具体操作
就细胞试验具体操作实施方法：（MDA-MB-231为例）一、细胞培养1、试剂材料10%胎牛血清DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶溶液、PBS溶液配置(pH7.4)等2细胞培养技术2.1细胞复苏细胞复苏的原则是快融。
预先在超净台中准备一培养瓶，内装5ml 配好的培养液。
从液氮罐中将细胞冻存管快速取出，并迅速放入37℃水浴中轻摇至其完全溶化。
置于装有培养液的75cm2的培养瓶中，放入37℃、5℅CO2的培养箱中常规培养24小时后，更换培养液，继续传代培养。
2.2细胞传代(1)在75cm2培养瓶中培养细胞，细胞生长到密度(2)为70%-90%融合时(24小时左右)，按1:2传代。
吸掉旧的培养液；(3)用1-5mlPBS清洗细胞两次（注意勿吹到瓶壁上），洗掉残余的培养基（防止残余培养基妨碍胰蛋白酶对细胞的消化），真空吸去PBS；(4)加入适量的500ul胰蛋白酶（0.25%），胰酶量以刚好盖住瓶底为佳，消化细胞（可在倒置显微镜下观察），一般十几秒到几分钟不等，如消化过慢可放入37°C温箱加快消化，作用时间根据胰酶的消化能力及细胞对胰酶的敏感性而定（即由细胞系种类而定）；(4) 当细胞变圆，细胞之间出现空隙时，立即终止消化（可以不吸除胰酶），加入适量（一般5ml）含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，用吸管轻轻反复吹打细胞，避免细胞成团，吹打混匀后再加适量DMEM培养液（根据传代数确定量一般比例为1：5 ），再取适量（根据传代量和总量而定）细胞悬液分别移至75cm2不同的培养瓶中，37℃、5℅CO2的培养箱中常规培养。
2.3细胞冻存细胞冻存原则是慢冻。
(1)冻存前一天细胞更换培养基，取对数生长期细胞冻存，使细胞处于最佳生长状态（融合度达80%-90%）；(2) 弃去旧的培养液，用灭菌的PBS洗细胞1-2次，然后加入0.25%的胰酶进行消化，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆，细胞间间隙增大后，立即弃去胰酶，加入新的含10%胎牛血清DMEM培养液终止消化，用吸管轻轻反复吹打细胞，移至10-15ml无菌离心管中。
cck8具体操作流程
cck8具体操作流程
以下是使用CCK8试剂盒进行细胞活力检测的步骤：
1. 准备细胞：取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液。
如果是贴壁细胞，需要37℃培养箱进行预培养2-6小时等细胞贴壁后再开展实验，
如果是悬浮细胞，不需要预培养。
2. 制备培养基：在无酚红DMEM高糖培养基中加入双抗、谷氨酰胺和血清。
3. 准备96孔板：根据实验需求，准备适当数量的96孔板。
每孔加入
100ul细胞悬液，通常细胞增殖实验每孔加入2×10³个/100ul 细胞，细胞
毒性实验每孔加入5×10³个细胞/100ul。
如果是贴壁细胞，可以直接在96
孔板中进行实验，如果是悬浮细胞，需要离心后取沉淀进行实验。
4. 加药处理：根据实验需求，在各组细胞中加入不同浓度的药物或对照组不加药。
5. 孵育：将96孔板放入37℃培养箱中孵育一定时间，通常为24小时。
6. 检测：在检测前，将CCK8试剂加入96孔板中，轻轻混匀后继续孵育1-4小时。
然后使用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度，记录数据并计算
细胞活力。
以上步骤仅供参考，具体操作请根据实验需求和实际情况进行调整。
培养细胞的流程
培养细胞的流程
细胞培养是生物学实验中非常重要的一项技术，它可以用于细胞生物学研究、药物筛选、疾病模型建立等多个领域。
下面将介绍一般细胞培养的流程。
首先，准备工作。
在进行细胞培养前，需要准备培养皿、培养基、细胞传代所需的胰酶等材料。
同时需要消毒工作台和培养箱，确保实验环境的无菌。
接着，解冻细胞。
如果是从冷冻状态中取出细胞进行培养，首先需要将冻存管放入37摄氏度的水浴中迅速解冻，解冻后将细胞转移到预先加热的培养基中。
然后，传代细胞。
当细胞生长到一定密度时，需要进行传代操作，以保证细胞的健康生长。
传代操作需要用到胰酶等酶类物质，可以将细胞从培养皿中剥离出来，然后转移到新的培养皿中。
接下来，细胞培养。
将细胞悬浮在培养基中，放入培养箱中进行培养。
培养箱中需要保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度，以提供良好的生长环境。
最后，细胞观察和实验。
在细胞培养的过程中，需要定期观察细胞的形态和生长状态，确保细胞的健康生长。
同时可以进行相关的实验，如药物处理、基因转染等。
综上所述，细胞培养是一个复杂而又重要的实验技术，需要严格控制实验条件，确保细胞的健康生长。
通过以上流程，可以有效地进行细胞培养，并为后续的实验提供可靠的细胞基础。
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
细胞计数试验的标准操作规程
细胞计数试验的标准操作规程（编号：029）
1、目的及适用范围
该SOP用来规范细胞计数的实验操作。
2、主要仪器
计数板（0.1mm×1/400mm2）、盖玻片、低倍倒置显微镜
3、操作步骤
3.1 将计数板及盖玻片擦拭干净，并将盖玻片盖在计数板上。
3.2 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖玻片边缘，使悬液充满盖玻片和计数板之间，静置3min，注意盖玻片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
3.3 数出计数室的四角的四个中方格的细胞总数，再除4，最后乘以2.5×104，即为每mL细胞悬浮液之细胞数。
若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
4、问题向导
4.1细胞数/mL=4中格细胞总数/4×2.5×104
4.2计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/mL，此范围外计数误差偏大。
高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。
镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按当个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
58。
细胞复苏、传代、冻存过程
细胞复苏、传代、冻存过程引言细胞复苏、传代和冻存是细胞实验中常见的操作流程。
细胞复苏指的是从冻存状态下恢复细胞的生长和功能，传代是将细胞进行繁殖，冻存则是将细胞保存在极低温下，以便长期保存和后续使用。
下面将详细讨论这些过程。
细胞复苏 Process of Cell Revival材料和设备•冻存管：包含冻存细胞的管子•暖水槽：设置在37°C的恒温水槽内•柱塞：用于搅动和混合细胞悬液•无菌培养皿•无菌培养基步骤1.将冻存管取出放在暖水槽中，快速融化冰冻细胞。
2.将融化的细胞悬液转移到无菌培养皿中。
3.加入预热的培养基，使细胞悬液与培养基充分混合。
4.将细胞培养皿放入培养箱中，维持37°C的恒温和5% CO2的含氧条件。
5.定期观察细胞的生长情况。
细胞传代 Process of Cell Passage材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•无菌培养基•显微镜•无菌移液器•15ml离心管•离心机步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器将培养基吹洗细胞，移除老化细胞和细胞碎片。
3.将细胞用预热的无菌培养基均匀混合。
4.用无菌移液器将细胞和培养基移入新的细胞培养皿中。
5.定期检查和记录细胞的生长情况和数量。
冻存细胞 Process of Cell Cryopreservation材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•冻存液：包含细胞冻存所需的成分•冻存管•冷冻容器：用于储存冻存管的液体氮罐•标签：用于标记冻存管步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器吹洗细胞，并移除老化细胞和细胞碎片。
3.用预热的无菌培养基将细胞均匀混合。
4.将混合的细胞和冻存液按照特定比例混合。
5.将混合液转移至冻存管中，并封闭管盖。
6.标记冻存管上的信息，包括细胞类型、传代数和日期。
7.将冻存管放入冷冻容器中，迅速冷冻至-80°C或更低温度。
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细胞冻存、复苏及传代操作流程1. 试剂与仪器：1.1 试剂PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P1022胰蛋白酶-EDTA溶液：Gibco公司，货号15400054 100 mL；青链霉素：Gibco公司，货号15140-112 100 mL；FBS：Gibco公司，货号10091-148 500 mL；DMEM （4.5g/L glucose）培养基：CORNING公司，货号10-013-CVR 500 mL；RPMI 1640 ：CORNING公司，货号10-040-CVR 500mL；DMSO：SIGMA公司，货号：D8418；PBS磷酸缓冲液：Solarbio，货号：P10221.2 仪器生物安全柜：离心机：37℃恒温水浴箱：-80℃冰箱：4℃冰箱：荧光倒置显微镜：37℃恒温培养箱：液氮罐：2、实验方法：2.1 细胞冻存配制含10% 体积DMSO的冻存培养液（90% FBS+10% DMSO或70%培养基+20%FBS+10%DMSO），冻存盒室温放置。
将正常生长的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6 cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入消化液体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬细胞，1mL分装于冻存管中，做好标记。
悬浮细胞收集细胞培养液于15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入适量冻存液重悬，1 mL分装于冻存管中，做好标记。
将冻存管放入冻存盒中，放入-80℃过夜，第二天转入液氮中长期保存。
2.2 细胞复苏从液氮罐中取出冻存管，快速浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；从37℃水浴中取出冻存管，在安全柜中，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到15 mL离心管中（15 mL 离心管中已事先加入4 mL培养基）混匀，800 rpm，离心5 min，弃去上清液，加入含10%血清的培养液重悬细胞，根据离心后的细胞沉淀，将细胞培养在10 cm 皿或6 cm皿的培养皿中（一般选用6 cm皿）37℃培养箱静置培养。
次日更换1次培养液，继续培养。
2.3 细胞传代状态良好的贴壁细胞用PBS清洗2遍后加入胰蛋白酶-EDTA（6cm皿加入1 mL，10 cm皿或T25细胞瓶加入2 mL），37℃放置直至细胞显微镜下缩成圆球状，加入胰酶体积2倍以上培养基，终止消化，将细胞吸取至15 mL离心管中，800 rpm离心5 min，去上清加入1-2ml培养基重悬细胞，吹打均匀后根据细胞生长速度1瓶传2瓶或1瓶传3瓶，补齐培养基（6cm皿加5ml，10cm皿加10ml）后放入37℃培养箱继续培养。
悬浮细胞在显微镜下观察，健康的细胞干净而透明，核清晰可见，静置培养时常见小细胞团。
①若细胞状态好，培养基干净而无明显颗粒物沉淀，可直接1:2或1:3分瓶传代培养。
②若细胞有碎片，培养基中颗粒物多，则需收集细胞培养液于15ml离心管中，600rpm离心5min，去上清，加入适量完全培养基重悬，轻柔吹打混匀后，根据细胞生长速度，1:2或1:3传代培养。
3、注意事项1）细胞一旦染菌后直接舍弃并检查所有试剂耗材是否污染，如细胞样本非常珍贵可考虑按下列操作抢救挽回，抢救过程染菌风险极高千万要小心谨慎。
及时换掉已受污染的培养基，PBS清洗7-8次，洗至显微镜下观察看不到一颗细菌为宜，清洗后用高浓度双抗（20×）浸泡5分钟，PBS清洗两次，用含2×双抗的完全培养基另外添加抗支原体药和庆大霉素进行培养；2）细胞消化过程需紧密观察细胞状态，避免消化过度导致细胞死亡，消化时间在1-10分钟不等。
3）细胞冻存密度一般控制在1×106个/ml，可按实验需要进行调整，尽量不要低于1×105个/ml，防止因细胞过于稀疏而导致的复苏失败。
4）细胞培养过程中如发现因细胞状态不佳导致的培养基底部出现黑点杂质，可将细胞消化下来后用PBS重悬，低转速（500rpm，3min）离心，重复两次。
细胞迁移操作流程1、实验原理：将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
Transwell迁移实验常用8.0、12.0 µm 膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
2、实验材料与仪器：2.1试剂PBS磷酸缓冲液培养基：胰酶；FBS：Transwell板（24孔板，孔径8um）：Corning Incorporated公司。
0.1%结晶紫：SIGMA公司。
4%多聚甲醛：SIGMA公司。
2.2 仪器台式低速离心机：二氧化碳培养箱：细胞培养皿：Thermo公司；倒置显微镜：生物安全柜：3、实验方法：3.1 实验流程3.2 实验步骤（1）消化收集细胞，1000rpm离心5min；（2）用1×PBS清洗一次，用对应空白培养基重悬细胞，计数，调整细胞密度为1×105-1×106个/ml；（3）选择孔径大小为8.0μm的transwell板，上室加入100μL细胞悬液，下室加600μL含血清的培养基作为趋化因子，37°C、5%CO2孵育；（4）24-48h（最迟不超过48h）后取出小室，用1×PBS清洗三次；（5）用4%多聚甲醛固定30min，用1×PBS清洗三次；（6）0.1%结晶紫染色30min，用1×PBS清洗三次，使用棉签去除滤膜表面未穿膜细胞；（7）拍照（200×）计数。
4、注意事项1）每个细胞迁移能力不同，本实验需先做预实验摸清铺入的细胞密度，大部分肿瘤细胞可发生迁移的细胞数目在2-8万个/孔。
2）用棉签擦除滤膜表面未穿膜细胞时动作一定要轻柔，滤膜本身柔软易变形，一旦用力过大导致滤膜变形，后续显微镜拍照时便无法细胞将聚焦在同一平面内，导致实验失败。
细胞划痕操作流程1、实验原理细胞划痕实验（Wound Healing)是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。
这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。
划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。
基本的步骤包括“划痕”的制造，细胞迁移期间图像的获得以及后期数据的处理。
2、实验材料与仪器：2.1试剂培养基：Corning公司；双抗（青霉素、链霉素）：Gibco 公司；胰酶：0.5%Trypsin-EDTA，Gibco公司；记号笔直尺2.2 仪器生物安全柜：离心机：倒置显微镜：37℃恒温培养箱：3、实验方法：3.1 实验流程3.2 实验步骤（1）先用记号笔在6孔板背面，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm 一道，横穿过孔。
每孔至少穿过4条线；（2）取生长对数期细胞消化计数铺六孔板，贴壁过夜，控制第二天细胞密度达100%；（3）第二天用10μl或200μl枪头比着6孔板盖，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜；（4）用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基；（5）一般按0、24、48、72h取样，在显微镜下拍照，并且保证在不同时间点下，拍下相同视野的照片。
4、注意事项1）划痕前不需要吸干培养基，划痕结束后再吸掉培养基加PBS清洗后加无血清培养基；2）划痕的距离不宜太宽，以免不能在显微镜视野下呈现；3）若划痕实验过程中需药物作用，其药物浓度需在无血清条件下进行摸索。
4）若在相应时间点拍照时发现漂浮的细胞过多，此时需更换培养基，洗干净漂浮的细胞后再继续拍照。
5）划痕法一般只能用于上皮，纤维样细胞系。
因为a.这些细胞本身有迁移能力，且较强。
b.细胞有极性，方便测量，观察。
c.细胞对无血清有较强的忍受力（至少24小时），因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的，很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12小时细胞凋亡就超过50%。
而一些上皮样细胞系甚至可以忍受高达72小时的无血清实验。
克隆形成实验操作流程1、实验原理：克隆形成实验是肿瘤细胞学研究中的一种常用技术，其原理是将细胞分离成单细胞悬液，在培养基上接种培养，根据集落形成数量和大小来检测细胞增殖能力和致瘤性。
该实验可用来研究肿瘤细胞的增殖能力、侵袭性，探讨细胞对不同杀伤因素的敏感性。
根据培养基是否需要软琼脂，克隆形成实验可以分为平板克隆形成实验（PCF）和软琼脂克隆形成实验（SACF）。
PCF是直接将细胞接种于培养瓶、培养皿中，优点为操作简便、细胞间分泌的促生长因子可在培养液中扩散、克隆形成率高，适用于贴壁生长的细胞; 缺点为细胞在贴壁前易于移动。
SACF 是采用半固体培养基模拟体内生长环境，适用于悬浮细胞及不依赖于贴壁生长的肿瘤细胞。
在悬浮状态下不能增殖的细胞（如正常成纤维细胞）不适用此法。
2、实验材料与仪器：2.1试剂培养基：Corning公司；双抗（青霉素、链霉素）：Gibco 公司；胰酶：0.5%Trypsin-EDTA，Gibco公司。
2.2 仪器生物安全柜：离心机：倒置显微镜：37℃恒温培养箱：3、实验方法：3.1 实验流程3.2 实验步骤（1）适用细胞：贴壁细胞（2）将目的细胞的培养基吸弃，用1×PBS润洗2遍去除残余的培养基，加入胰酶消化细胞（最好将细胞消化成单个细胞或者后续吹打细胞使其成单个细胞状态）。
细胞离心弃去上清，用适量培养基重悬，使用细胞计数板计数，根据计数结果将细胞密度稀释（最好梯度稀释）成合适的密度（如10000个/ml）；（3）细胞铺板：若要观察正常细胞的克隆形成情况，建议按六孔板每孔300-500个铺板，14-20天后结束培养；若要看药物处理或辐射等处理的细胞集落形成情况，建议做个预实验，六孔板分别铺500，2000，4000，8000，个/孔，14-20天后结束培养，找出最适的密度，然后再进行后续的实验；（4）14-20天后，细胞停止培养，吸去培养基，用1XPBS洗3遍，然后用4%PFA固定液固定30分钟，1XPBS洗3遍，然后加入0.1%结晶紫染色30分钟，再用1XPBS洗3遍至五紫色背景，最后在镜下数细胞集落数。
4、注意事项1）细胞培养过程较长前期3-4天换一次培养基，后期2-3天换一次培养基，可观察培养基颜色来保证细胞营养充足。