Seahorse-XF实验流程
揭示细胞代谢过程
XF 测试样品制备仪
为与 XFe 分析仪一起使用而设计的 XF 测试 样品制备仪使实验的准备更快捷，简易， 且不出差错。XF 测试样品制备仪组合了 一个无 CO2 培养箱和一个自动培养基 换洗器。
XF 压力测试盒和试剂
XF 压力测试盒和试剂为快速简单地操作 XF 实验提供了一个标准化方式。经过预先 校准且质量可靠的试剂和标准测定实验方案 可确保获得可靠且可重复的数据；而样本 与样本，患者与患者的比较可揭示出细胞 能量生成路径与疾病之间相互作用的详情。
XFe 分析仪、XF 压力测试盒、试剂和 软件应用程序使如今可以在一个微板 块上能够提供最简单、最全面的细胞 代谢评估。
线粒体呼吸是产生细胞能量的基础。 XF 细胞线粒体压力测试盒可全面测定 线粒体呼吸的概况，进而揭示线粒体 功能的关键参数：基础呼吸、ATP 转换、 氢离子渗漏、最大呼吸值和备用呼吸量。
XFe 分析仪
直观的 XFe 软件
XFe 软件采用多点触摸用户界面来简化 您的测定工作流程。简单的 4 步流程 可引导您顺利完成测定，并提供一份 简明的总结报告。您可更加快速和 轻松地完成研究。
能够提供实时动力学数据，
设计一个实验，从拟定到分析报告从未如此简单。
通过 XF 应用程序，即可轻松有趣地运行压力测试盒和测定。
XFe 分析仪
24 孔和 96 孔式
XFe 分析仪使用无标签的 24 孔或 96 孔式的 一次性固态传感器盒，在数分钟内同时测量细 胞内的线粒体呼吸和糖酵解。本款多功能的台 式设备占地面积小；可测定原代细胞和肿瘤细 胞系（粘连或悬浮细胞）以及胰岛和分离线粒 体。XFe 分析仪可为您的细胞代谢研究提供呼吸 (O2)
随着对细胞代谢－细胞生成和消耗能量的 过程－的了解，科学家们正在将基因组和 蛋白质组数据与细胞的生理特性相关联， 从而对肥胖、糖尿病、癌症、心血管疾病 和神经退行性疾病的形成提供了崭新而 深入的研究。
Seahorse海马代谢仪使用说明
配制XF细胞线粒体压力测试盒中药物 母液
检测液体积 Oligomycin FCCP Rotenone/Ant imycin A 630 μL 720 μL 540 μL
终浓度 100 μM 100 μM 50 μM
将药物稀释为10×浓度，用于加到加药孔中
1.按左边表格，用3 mL 检测液将 oligomycin稀释为所需浓度（或使 用大多数细胞都适用的1 μM）。
3.放入无CO2的培养箱，37℃过夜（使校准液能浸没在sensors 中；保证培养箱湿度，防止干燥）
培养细胞
1.100ul 培养液收集细胞，按最佳细胞 密度重悬细胞（10,000 - 80,000个细胞/ 孔）。 2.每孔接种100 μL细胞悬液，背景校正 孔（A1, B4, C3, D6）不接种细胞。将 细胞板室温静置在超净台上1 h。
实验当天 准备XF检测液
一个培养板 手动加液需100ml，仪器加液需 200ml
1.使用NaOH调节pH值至7.35±0.05 2.检测液中所需要添加的底物及浓度取决于细 胞类型和实验设计，或者与生长培养基保持一 致。 3.37℃放置备用。
NO sodium bicarbonate Low phenol red (3 mg/L)
Review Run-----Plate Information-----Well Volume-----Plate by----Start Run，放入测试板。当软件出现校准完成提示时，将Utility板 换为细胞培养板。点击Continue。仪器完成OCR值测定，数据分析。
寡霉素：ATP合酶抑制剂； FCCP：解偶联剂 ； 抗霉素A/鱼藤酮：呼吸链抑制剂；
How do I know whether the cell density is good?
虾青素试验方法
虾青素试验方法警告----本产品对光敏感，在操作过程中应避光操作。
三氯化锑-三氯甲烷溶液有强腐蚀性，在操作过程中应注意避免与皮肤接触，如不慎接触到皮肤，应立即用清水冲洗。
本标准所用的试剂和水，除非另有说明，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。
4.1 试剂和溶液4.1.1 三氯甲烷。
4.1.2 无水乙醇。
4.1.3 BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）。
4.1.4 三氯化锑-三氯甲烷溶液：称取1g三氯化锑用4ml三氯甲烷溶解即得（现配现用）。
4.2 仪器和设备4.2.1 紫外-可见分光光度计。
4.2.2 分析天平。
4.2.3 超声波清洗器。
4.2.4 恒温水浴装置。
4.2.5 离心机（离心试管体积大于20ml）。
4.2.6 氮气吹干装置。
4.2.7 孔径为0.84mm的分析筛。
4.2.8 孔径为0.425mm的分析筛。
4.3 鉴别4.3.1 取试样约10mg于试管中，加50℃-60℃热水1ml，于50℃-60℃热水浴中超声5min。
冷至室温后，加入三氯甲烷（4.1.1）10ml并振摇30s，静置分层后，取三氯甲烷层溶液3ml与三氯化锑-三氯甲烷溶液（4.1.4）1ml反应，溶液应立即显蓝紫色。
4.3.2 取含量测定项（4.4.1）下的待测液，以三氯甲烷为空白，使用1cm的比色皿，于分光光度计上扫描波长200nm-600nm之间的吸收光谱，其最大吸收波长应在波长 484nm-490nm之间，光谱图参见附录A。
4.4 含量4.4.1 测定待测液：称取试样0.15g（精确至0.0002g），置于250ml棕色容量瓶中，加入BHT（4.1.3）约10mg，加入蒸馏水10ml，在50℃-60℃热水浴中超声5min，流水冷却至室温，加入无水乙醇（4.1.2）100ml和三氯甲烷100ml，于室温水浴中超声5min，用三氯甲烷稀释至刻度摇匀。
取该溶液适量，置于具塞离心管中离心5min（转速为3000r/min），精密称取上层清液2ml于50ml棕色容量瓶中，将容量瓶置于约45℃的水浴中，用氮气流吹干，用三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，即为待测液，应立即测定（于20min内完成测定）。
Seahorse使用前准备物品清单
glucose, L-glutamine, sodium pyruvate用于配制检测液，同时准备1N NaOH用于调pH值。
检测液配制方法见培训手册”Preparation of Assay Media for Use in XFp Assays”。
【注意】sodium pyruvate可以准备粉末，但我们更推荐购买sodium pyruvate 100mM 液体包装，使用方便。
注意购买后分装保存。
上述试剂配制都不需要无菌操作。
3.仪器和耗材：
无二氧化碳37度培养箱，pH计，细胞计数仪（或计数板），37度水浴锅，显微镜，
涡旋混合器，移液枪，0.22uM滤器，10ml灭菌管6个，1.5ml EP管若干。
【注意】请确认PH计是准确的好用的，提前使用校准液校准。
Seahorse实验要求精确测量PH值。
4.细胞：
我们曾经做过的效果比较好的细胞有C2C12，HepG2等。
请告知您实验室培养的细胞系有哪些，我们将采用贴壁牢的细胞进行培训及相关实验。
Seahorse问答集锦-摘录
Seahorse问答集锦一次实验可以只使用探针板其中的一部分吗？为了将所有药物或化合物成功地注入细胞培养孔中，Agilent建议水化整个探针板并因需要将相同字母标注的全部加药孔注入药物（请参考实验流程中关于加载药物的注意事项）。
背景孔的加药孔也必须加上药物，保证所有的A加药孔体积一致，B、C、D孔同理，否则会造成打药失败；实验中为何必须设置背景校正孔？背景校正孔被用来过滤掉实验的干扰因素，比如温度和buffering capacity，这些干扰因素会影响氧含量和pH变化（非来源于代谢变化的影响）。
背景校正孔还能被用来修正整板间温度波动，来诊断潜在温度问题，以及作为实验获得非期望数据时原因筛查的切入点。
背景校正孔怎么设置？背景校正孔里除了没有细胞，其它所有操作和细胞孔一致。
96机型背景校正孔（A1,A12,H1,H12，即4个角）不接种细胞；24机型背景校正孔设置为（A1,B4,C3,D6）；确保背景校正孔中只加入培养液（无细胞）为何细胞培养板需要在37℃无CO2培养箱中放置45-60min？细胞培养板在37℃无CO2培养箱（即普通37℃恒温培养箱）中孵育45-60min的目的是为了脱气，释放CO2。
Seahorse 实验时，我担心细胞量少，我多种点细胞可以吗？细胞的密度需要摸索，在实验上机前，长满板底面积80-90%为最佳，设置一个密度梯度，找到最佳的密度；细胞过密会使检测时形成的瞬间微室氧气快速耗尽。
Seahorse 实验，种细胞和平时种细胞有区别吗？安捷伦细胞培养板种细胞时候，枪头抵壁，与水平面呈45°角度加入，加完在超净台静置1小时，有助于促进细胞均匀分布并减少边缘效应。
96孔细胞板种80ul；24机型的板子分二步，先每孔接种100μL细胞悬液，培养细胞1-6小时，细胞贴壁后，再补充生长培养基，每孔加入150μL生长培养液,总体积为250μL。
加液时沿壁轻轻加入，避免吹起刚贴壁的细胞。
赛默飞X射线荧光分析仪安装手册
仪器的验收仪器的包装检查如果看到仪器包装箱上有明显的损伤，或者发货单上所列的箱子有丢失，收货方应在有效的交货文件上记下申诉意见。
如果在验收以后发现损伤或箱子丢失，那么收货方必须立即通知最后一位搬运货物的运输公司。
通知应以挂号信发出。
请务必在交货时记下任何损坏或丢失的物品，否则，保险索赔请求可能会被拒绝。
即使货物收货方通常不是投保人，他（她）也有义务记下任何损伤的疑点。
材料清单检查用户负责检查收到的材料是否与材料清单上所列相符。
卸货建议必须认真搬运仪器，否则可能会倾翻仪器，因此只有用叉车来升降仪器，即卸货和短距离运输都要将仪器置于叉车的托盘上。
叉车应避免突然起动。
尽量使仪器不要离开地面。
失去平衡造成的损坏完全不能赔偿。
仪器从一米高处掉下来将完全损坏。
不要让ARL9800 X射线荧光仪承受机械压力。
如果需要提升仪器，可使用仪器框架上的环。
在仪器运抵最终位置之前，别把仪器从木质托盘上取下来。
实验室准备仪器房间准备实验室布局下图示为实验室布局。
在仪器背面与墙之间至少留出30cm的距离，这是非常重要的。
因为冷却空气的出口位于仪器后面。
下图为带有12位样品库的ARL9900仪器布局。
注意：ARL9900 Oasis额外需要一台热交换器，以便通过空气来冷却X射线管水。
热交换器与仪器之间的地面距离可以小于10米。
如图所示，用户可以从左右侧抵达仪器各个部位，以便进行维护。
如果维护作业需要移动仪器，则使用托盘运输装置会很容易。
环境条件安装的仪器应防止强烈震动，避免阳光直晒，防尘和防止腐蚀性蒸汽或气体。
总之，对仪器房间的要求与一般工业控制房间的要求相同。
位置安装ARL9900最合适的位置是楼房底层靠阴面。
这些房间即使在夏季通常温度也比较低，因此能够容易地保持在一个合适的温度范围内。
位于靠阴面，说明不应使阳光透过窗户直晒在仪器上。
环境温度实验室理想的温度是22 °C 。
对于ARL9900 XP 型，室温与冷却水温相对应。
Seahorse XFe96 申报资料-药物
5.可调温控检测室，温度控制在30-37℃。
6.药物注入系统：气体驱动，自动注入药物。每孔整合4个独立加药窗口，加药体积为20-25l。
7.全程非接触式设计，免去使用任何染料、标签和报告子，摒除放射线或有毒化学物质对操作人员的伤害。
2.软件：windows 7.0操作系统；XFe96数据获取及分析软件。
主要功能、应用范围
主要功能：海马XFe96细胞能量代谢分析系统以96孔微孔板为平台，实时同步检测细胞以及线粒体中的有氧呼吸以及糖酵解功能。主要通过检测细胞或线粒体中代谢指标变化，如ECAR(细胞外酸化率)和OCR（耗氧率），进而解析线粒体的功能，从而了解代谢变化的真实内涵或做出药物毒性评价。检测快速、灵活、通量及灵敏高，能广泛应用于基础研究的各个方面。
美国海马生物技术公司拥有细胞多种生理指标同时检测等多项专利。海马XFe96细胞能量代谢分析系统使用高灵敏度微型传感器及首创的检测原理，革命性地在不破坏样本、不侵入细胞、实验条件无生物危害性的前提下实现实时、高通量、多样本来源的细胞有氧呼吸以及糖酵解作用的检测。在一次实验中能够得到样本的基础呼吸能力、ATP转换、质子渗漏、极限呼吸能力、储备呼吸能力、糖酵解通量、最大糖酵解能力及糖酵解储备能力等细胞代谢主要指标的检测值，并得到细胞生物能量的变化图。并通过这两大能量生成途径的实时对比，揭示它们之间的动态互动变化。
8.耗材一次性使用，用后无须清洗，杜绝交叉污染可能性。
9.检测后细胞保持活性，可以用于后续的其它检测。
10.可以无限次地重复测试以检测动力学反应。
测试样品制备工作站：
包括无二氧化碳培养箱、自动培养基更换系统和温控系统。
Seahorse XF实验流程
Seahorse XF实验流程（此为简略版实验流程，详细步骤参见培训手册）XF实验前一天1.种细胞：将细胞接种到Seahorse XF细胞培养板中，在生长培养基中过夜培养。
注：细胞接种时间和培养时间可根据细胞处理要求进行选择。
2.预热仪器：打开Seahorse仪器和电脑，并打开软件，使仪器升温至37℃，过夜预热。
3.水化探针：在Utility Plate中加入Seahorse XF校准液，将测试板放回Utility Plate上，置于37℃无CO2培养箱中过夜水化探针。
XF实验当天1.准备检测液：用Seahorse XF Base Medium配制检测液，加入所需要的底物，将溶液加热至37℃，用NaOH调pH值至7.4，过滤，置37℃水浴中备用。
注：检测液中所需要添加的底物及浓度取决于细胞类型和实验设计，或者与生长培养基保持一致。
2.观察细胞：将细胞板从CO2培养箱中取出，在显微镜下观察细胞状态。
3.细胞换液：将生长培养基换为检测液，然后将细胞放置在37℃无CO2培养箱中1小时。
4.配药：根据试剂盒说明书，配制并稀释药物至所需浓度。
5.加药：将稀释好的药物分别加入测试板上的A，B，C，D 四个加药孔中。
注：根据实验设计选择所用加药孔数量。
6.设计实验模板：用软件记录实验条件和设计实验程序。
7.上机：开始运行实验程序，将加过药的测试板和装有校准液的Utility Plate一起放置到仪器托板上。
8.仪器自动校准探针。
9.换细胞板：当软件出现提示信息时，将Utility Plate换为细胞板。
10.实验完成时根据软件提示信息退出测试板和细胞板，并在显微镜下观察细胞状态。
11.数据分析：采用wave软件和report generator对实验数据进行分析。
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Seahorse XF实验流程
（此为简略版实验流程，详细步骤参见培训手册）
XF实验前一天
1.种细胞：将细胞接种到Seahorse XF细胞培养板中，在生长培养基中过夜培
养。
注：细胞接种时间和培养时间可根据细胞处理要求进行选择。
2.预热仪器：打开Seahorse仪器和电脑，并打开软件，使仪器升温至37℃，
过夜预热。
3.>
4.水化探针：在Utility Plate中加入Seahorse XF校准液，将测试板放回
培养箱中过夜水化探针。
Utility Plate上，置于37℃无CO
2
XF实验当天
1.准备检测液：用Seahorse XF Base Medium配制检测液，加入所需要的底物，
将溶液加热至37℃，用NaOH调pH值至，过滤，置37℃水浴中备用。
注：检测液中所需要添加的底物及浓度取决于细胞类型和实验设计，或者与生长培养基保持一致。
2.】
3.观察细胞：将细胞板从CO2培养箱中取出，在显微镜下观察细胞状态。
培养箱4.细胞换液：将生长培养基换为检测液，然后将细胞放置在37℃无CO
2中1小时。
5.配药：根据试剂盒说明书，配制并稀释药物至所需浓度。
6.加药：将稀释好的药物分别加入测试板上的A，B，C，D 四个加药孔中。
注：根据实验设计选择所用加药孔数量。
7.\
8.设计实验模板：用软件记录实验条件和设计实验程序。
9.上机：开始运行实验程序，将加过药的测试板和装有校准液的Utility Plate
一起放置到仪器托板上。
10.仪器自动校准探针。
11.换细胞板：当软件出现提示信息时，将Utility Plate换为细胞板。
12.实验完成时根据软件提示信息退出测试板和细胞板，并在显微镜下观察细胞
状态。
13.数据分析：采用wave软件和report generator对实验数据进行分析。