细胞生物学课程第16章(细胞衰老与细胞死亡)2017
细胞生物学-第16章-细胞死亡与细胞衰老
（2） Caspase 的激活及其级联效应
翟中和 王喜忠 丁明孝 主编 细胞生物学（第4版）© 高等教育出版社 2011
（2） Caspase 的激活及其级联效应
Nat Rev Mol Cell Biol, 2010, 11(9): 621-632
翟中和 王喜忠 丁明孝 主编 细胞生物学（第4版）© 高等教育出版社 2011
翟中和 王喜忠 丁明孝 主编 细胞生物学（第4版）© 高等教育出版社 2011
（二）细胞凋亡的检测方法
细胞凋亡早期，位于细胞 膜内侧的磷脂酰丝氨酸 （PS）迅速翻转到细胞膜 外侧，使得PS 暴露在细胞 膜表面，可以用PS 与抗凝 血剂Annexin V 的相互作用 检测外翻的PS
翟中和 王喜忠 丁明孝 主编 细胞生物学（第4版）© 高等教育出版社 2011
翟中和 王喜忠 丁明孝 主编 细胞生物学（第4版）© 高等教育出版社 2011
（1） Caspase 分类及其结构
翟中和 王喜忠 丁明孝 主编 细胞生物学（第4版）© 高等教育出版社 2011
Caspase 家族成员及其在细胞凋亡过程中的功能
翟中和 王喜忠 丁明孝 主编 细胞生物学（第4版）© 高等教育出版社 2011
（二）细胞凋亡的检测方法 4. 彗星电泳法
正常细胞的核无DNA 断裂泳动时保持圆球形 凋亡细胞中的DNA 降解片段在电场中泳动速度较快，细胞核呈现出慧星式图案
翟中和 王喜忠 丁明孝 主编 细胞生物学（第4版）© 高等教育出版社 2011
（二）细胞凋亡的检测方法 5. 流式细胞分析
左图：正常细胞周期 右图：地塞米松 处理的细胞在G1峰左侧可见一典型的凋亡峰型（亚二倍体峰）
（2） Caspase 的激活及其级联效应
细胞生物学 第十六章 细胞衰老与细胞死亡
第十六章细胞衰老与细胞死亡细胞衰老：指随着时间的推移，细胞的增殖能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程。
机体衰老：指绝大多数生物性成熟以后，机体形态结构和生理功能逐渐退化或老化的过程，是一个受发育程序、环境因子等多种因素控制的、不可逆的生物学现象。
Hayflick界限：细胞停止分裂是由细胞自身决定，正常的体外培养的细胞寿命不是无限的，只能进行有限次数的增殖。
细胞衰老的形态学变化：主要表现在细胞皱缩、膜通透性和脆性增加、核膜内陷和细胞器数量特别是线粒体数量减少、胞内出现褐脂素等异常物质沉积，最终出现细胞凋亡或坏死。
细胞衰老在生化方面的改变：①DNA：复制与转录受抑制，个别基因异常激活，端粒DNA丢失，线粒体DNA特异性缺失，DNA氧化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低。
②RNA：mRNA和tRNA含量降低。
③蛋白质含量下降，发生糖基化、脱氨基等修饰反应导致蛋白质稳定性、抗原性和可降解性下降，自由基使肽链断裂，交联而变性。
氨基酸左旋变右旋。
④酶分子：活性中心被氧化，金属离子丢失，二级结构、溶解度和等电点发生改变，总效应是酶失活，但β-半乳糖苷酶活性增强。
⑤脂类：不饱和脂肪酸被氧化，膜脂之间或与脂蛋白之间交联，膜的流动性降低。
遗传决定学说：认为衰老是遗传上的程序化过程，其推动力和决定因素是遗传的基因组，控制生长发育和衰老的基因都在特定时期有序地开启和关闭。
自由基学说：认为活性氧基团导致细胞损伤和衰老。
自由基：指那些在原子核外层轨道上具有不成对电子的分子或原子基团。
是一类高度活化的分子，当它与其他物质反应时力图得到电子，而对细胞及组织产生十分有害的生物效应。
未成对电子：指在原子或分子轨道中未与其他电子配对而独占一个轨道的电子。
内源性自由基：环境中的高温、辐射、光解、化学物质等引起的外源性自由基。
外源性自由基：体内各种代谢反应产生的自由基，主要途径有①线粒体呼吸链电子泄露产生②由经过氧化物酶体的多功能氧化酶（MFO）等催化底物羟化产生③机体血红蛋白、肌红蛋白中可通过非酶促反应产生自由基。
医学细胞生物学细胞衰老和细胞死亡优质课件
细胞死亡
• 3.胞浆Ca2+、pH的变化 Ca2+能通过 两条途径 诱导细胞凋亡：①胞 内 Ca2+库 释放，胞外 Ca2+内流 使胞浆内 Ca2+持续升高，作为凋亡信 号启动凋亡；②Ca2+的释放打破了胞内结构的稳定，使细胞凋亡系统 的关键成分 与正常时不能接触的基质发生反应，从而触发凋亡
β-半乳糖苷酶在衰老细胞中表达增加→
细胞衰老
• ⑤脂类：不饱和脂肪酸被氧化，引起膜脂之间或与脂蛋白之间 交联， 膜的流动性降低
• 细胞衰老的学说与机制
• 有许多学说诠释细胞衰老过程
• 1.遗传决定学说认为衰老是遗传上的程序化 • 认为：衰老是 遗传上的程序化过程，其推动力和决定因素是遗传的基
因组；控制 生长发育和衰老的基因 都在特定时期 有序地 开启和关闭 • 早老衰综合症 Hutchinson-Gilford syndrome 婴幼儿期开始衰老，
• 也有细胞凋亡时，仅仅 核固缩、胞质浓缩 形成 致密结构→凋亡小体
细胞死亡 • 细胞凋亡时细胞生化改变的复杂性和多样性
• 1.DNA片段化 细胞凋亡时，胞内 内源性核酸内切酶 活化，将核小 体在 连接区 切断，形成180～200bp片段，电泳时可见 DNA梯状条 带 DNA ladder——细胞凋亡 最典型生化特征之一。细胞坏死时， DNA随意断裂，电泳呈 弥散状 smear
• 细胞坏死时， 细胞膜渗漏、内容物外流，导致炎症反应； 细胞凋亡 时，细胞膜反折包裹断裂的染色质片段或细胞器等，形成众多凋亡小 体，最终被巨噬细胞吞噬消化，不引起炎症反应
医学细胞生物学-15 细胞衰老与细胞死亡-2017(1)
第十六章细胞衰老与细胞死亡第一节细胞衰老第十六章 细胞衰老与细胞死亡第十六章 细胞衰老与细胞死亡第十六章 细胞衰老与细胞死亡细胞来源人胚肺成纤维细胞中年人成纤维细胞老年人成纤维细胞可增殖代数60-80 40 30不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数细胞来源龟鸡小鼠可增殖代数90-120 15-35 14-28不同物种来源的成纤维细胞的增殖代数植物细胞未发现有最高分裂次数。
第十六章细胞衰老与细胞死亡第十六章细胞衰老与细胞死亡第十六章细胞衰老与细胞死亡第十六章细胞衰老与细胞死亡第十六章细胞衰老与细胞死亡第十六章细胞衰老与细胞死亡第十六章细胞衰老与细胞死亡第十六章细胞衰老与细胞死亡目前人们根据端粒与端粒酶在细胞衰老上的研究成果，将细胞衰老区分为两大类：与端粒、端粒酶直接相关的复制性衰老；氧化应激诱导的非端粒依赖性衰老，也被称为早熟性衰老（premature senescence）。
第十六章细胞衰老与细胞死亡第十六章细胞衰老与细胞死亡第二节 细胞死亡第十六章细胞衰老与细胞死亡第十六章 细胞衰老与细胞死亡第十六章细胞衰老与细胞死亡第十六章细胞衰老与细胞死亡第十六章细胞衰老与细胞死亡第三节细胞凋亡第十六章细胞衰老与细胞死亡细胞凋亡信号途径LigandPlasma MembraneNucleusAPOPTOSISEffector CaspasesDeath receptor AdapterInitiator Caspase-8BidCa ++Cyto cInitiator caspase-9Apaf-1AIFEndo GCa ++IP3RAPOPTOSISER Stress(misfolded proteins)UV, radiation, chemo,hypoxiaInitiator Caspase-12APOPTOSISTRAF2Procaspase-12Bcl-2/ Bcl-x L Effector CaspasesINTRINSIC PATHWA YEXTRINSIC PATHWA YBcl-2/ Bcl-x LDeath domainMitochondriaEndoplasmic reticulum第十六章 细胞衰老与细胞死亡第十六章细胞衰老与细胞死亡第十六章细胞衰老与细胞死亡凋亡小体的形成有三种方式：发芽脱落机制；分隔机制；自噬体形成机制。
第十六章 细胞死亡与细胞衰老
●细胞凋亡(Apoptosis) ●细胞衰老 (cellular aging）
第一节 细胞死亡
就单细胞生物而言，细胞死亡即个体的死亡。 对于多细胞生物，细胞死亡是维持生物体的正常生长发育及
生命活动的必要条件。
细胞死亡方式包括：细胞凋亡、坏死、自噬性细胞死亡。它 们具有不同形态和分子特征，发挥不同的功能，但均受到细 胞内在基因控制。
胞程序性死亡的理想材料（生命周期短，细胞数量
少）。
线虫神经系统由 302 个细胞组成。这些细胞来自于 407个前体细胞。也就是说105个细胞发生了程序性 死亡。
◆ caspase的发现
控制线虫细胞凋亡的基因主要有3个： Ced-3、Ced-4和Ced-9
Ced-3和 Ced-4的作用是诱发凋亡； Ced-9 阻止Ced-3、Ced-4激活，抑制细胞凋亡。 Ced3 哺乳类同源物是白介素－１转换酶 (Interleukin-1-
细胞凋亡信号途径
3、 caspases非依赖性的细胞凋亡
线粒体向细胞质内释放多个凋亡相关因子，诱发caspases 非依赖性的细胞凋亡。
凋亡诱导因子（AIF）：从线粒体释放到细胞质基质中，进
而进入细胞核，引起核内DNA凝集并断裂。
限制性内切核酸酶G（endonuclease G）:负责线粒体DNA 的修复和复制。受到凋亡信号的刺激，endo G从线粒体释 放，进入细胞核，对核DNA进行切割。
（一）衰老的概念
●细胞衰老(cell aging ，cell senescence)：一般
指复制衰老，即体外培养的正常细胞经过有限次数
的分裂后，停止生长，细胞形态和生理代谢活动发
《细胞生物学》16 细胞死亡与细胞衰老ppt课件
• 体外培养人的成纤维细胞，在体外分裂次数有限， 证明细胞不是不死的
• 将老年人的成纤维细胞与年轻的人的成纤维细胞同 时培养，年轻状态的细胞在体外分裂次数更多，说 明衰老与供体细胞的年纪有关
• 老年人的成纤维细胞与年轻的人的成纤维细胞进行 混合和单独培养比较实验，发现二者的分裂次数没 有变化，说明与培养的环境无关
• 利用细胞杂交的方法确定引起衰老的真正原因。年 轻的胞质体与年老的完整细胞融合，杂种细胞分裂 能力没有改变；年老的胞质体与年轻的完整细胞融 合，杂种细胞分裂能力与年轻相同，证明细胞核是 导致衰老的真正原因
二、细胞衰老的分子机制
5’ 3’
5’ 3’
5’
oH3’ 5‘
二、细胞衰老的分子机制
人的胚胎经历 有尾阶段
P352示电镜下的自噬源自溶酶体线粒体 过氧化物体☻ 老年人体内有没有幼嫩的细胞？
有，如造血干细胞一生都能增殖分化产 生各种类型的血细胞。
☻ 年轻人体内有没有衰老的细胞？
有，如皮肤表皮细胞衰老成角质层细胞， 最后细胞凋亡、脱落。
• Hayflick limitation
1961年，Hayflick 首次报道了体外培养的人 成纤维细胞(human fibroblast)具有增殖分裂 的极限。他利用来自胚胎和成体的成纤维细胞 进行体外培养，发现胚胎的成纤维细胞分裂传 代50次后开始衰退和死亡，而来自成年组织的 成纤维细胞只能培养15～30代就开始死亡。
细胞的衰老和死亡ppt课件
A.被自由基攻击的机体细胞的死亡属于细胞坏死 B.自由基属于免疫活性物质，能特异性攻击病毒和机体细胞 C.自由基会攻击蛋白质，使蛋白质活性下降，致使细胞衰老 D.服用自由基清除剂有助于减轻新冠肺炎伴随的器官损伤
产生 自由基 攻击
磷脂
DNA
蛋白质
生物膜损伤 基因突变 活性下降
细胞 衰老
（2）端粒学说 ➢ 端粒：每条染色体的两端都有一段特殊序列的DNA—蛋白质复合体
3.细胞衰老与个体衰老的关系
➢ 单细胞生物
个体衰老与死亡 ＝ 细胞衰老与死亡
➢ 多细胞生物
＝ 个体衰老与死亡 细胞衰老与死亡
大肠杆菌 变形虫 酵母菌
细胞来源 增殖代数/细胞分裂次数
胎儿 50
1. 从实验1中你能得出什么结论？
中年人 20
老年人 2-4
随着年龄的增长 ，细胞继续分裂的次数会 减少 ， 即细胞会随分裂次数的增多而 衰老 。
实验2 将年轻人的体细胞去核后与老年人的细胞核融合；
将老年人的体细胞去核后与年轻人的细胞核融合。分别在体外培养。
1、细胞凋亡
与凋亡有关基因选择性表达
➢ 概念： 由 基因决定 的细胞自动结束生命的过程。 细胞凋亡受到严格的由遗___传__机__制__决定的程序性调控，也称 程序性死亡 。 ①生长发育中，细胞的 自_动__死__亡___；(胎儿尾巴消失)
②成熟生物体中，细胞的_自__然__更__新__；(清除衰老 的细胞) ➢ 类型： ③被 病原体感染 的细胞的清除；
个体衰老的过程是组成个体细胞 普遍衰老 的过程
新生婴儿体内没有衰老细胞，老年人体内没有新生的细胞（×）
老年人：造血干细胞； 年轻人：皮肤表皮细胞衰老成角质层细胞，最后凋亡、脱落。
细胞生物学-细胞衰老与死亡
衰老细胞的结构变化
❖ 细胞核的变化 体积增大、核膜内折、染色质固缩化、端粒变短， DNA甲基化程度增加；
❖ 内质网的变化 内质网排列无序，膜腔膨胀，膜面上核糖体减少；
❖ 线粒体的变化 线粒体的数量随着年龄的增大而减少，而其体积则随着 年龄的增大而增大。线粒体DNA的损伤程度增加，线粒 体DNA的转录产物减少；
外在信号
内在信号
Cell - extrinsic activation of caspase cascade
❖ 细胞表面具有死亡受体（death receptor） Fas，属于肿瘤坏死因子受体超家族； ❖ 三聚体的Fas与配体（FasL）结合； ❖ 募集接头蛋白FADD和 procaspase-8； ❖ 通过自身剪接，产生caspase-8 ，引起caspase cascade。
❖ 活化的caspase 再切割其他的 caspase，即为 caspase级联反 应（cas胞质蛋白质或 核纤层蛋白
caspase家族与细胞凋亡
❖ 目前认为细胞凋亡的起始者（caspase 2， 8，9和 10）和执行者（caspase 3，6和7） 之间存在着上下游关系，即起始者活化执 行者。
H2O
CuZn-SOD
H2O2 GSH-Px
H2O 细胞质
线粒体
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正常细胞内存在清除自由基的防御系统，包括酶系统和非 酶系统： • 酶系统：超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）， 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）。 • 非酶系统：维生素E、醌类物质等电子受体。 研究显示（1994），将铜锌超氧化物岐化酶基因导入果蝇， 使转基因果蝇具有3个拷贝的SOD基因，其寿命比野生型延 长1/3。这个实验为衰老的自由基学说提供了有力的证据。
根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA 产生激发荧光， 用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状态。
六、细胞凋亡与疾病
（一）细胞凋亡过低导致相关疾病的发生
肿瘤：凋亡抑制基因和凋亡活化基因表达异常 系统性红斑狼疮：Fas表达缺陷，导致T淋巴细胞凋 亡障碍。
（二）细胞凋亡过度导致相关疾病的发生
•
•
脂褐质是一些长寿命的蛋白质和DNA、脂类共价缩合形成的巨 交联物，次级溶酶体是形成脂褐质的场所，由于脂褐质结构致 密，不能被彻底水解，又不能排出细胞，结果在细胞内沉积增 多，阻碍细胞的物质交流和信号传递，最后导致细胞衰老。 如老年性痴呆（AD）就是由β-淀粉样蛋白沉积引起的，因此 β-AP可做为AD的鉴定指标。
The Apoptotic System in Mammals
A human monocyte-derived macrophage ingests multiple apoptotic bodies
五、细胞凋亡的检测
形态学观测
利用各种方法对细胞染色，再在光镜、荧光显微镜、 电镜下检测其形态特征。 台盼蓝被生活细胞、凋亡细胞拒染，但可将坏死 细胞染成蓝色； 借助苏木精-伊红染色（H.E)、Giemsa染色、孚尔 根染色、DAPI染色等，可观察到动物细胞的细胞 核及染色体变化特征； TEM和SEM可观察凋亡细胞的细胞核、染色体、凋 亡小体、细胞表面结构、细胞器的变化特征。
细胞核变化： 染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿核膜分布，形成核碎片
4.线粒体在细胞凋亡中的作用
细胞应激反应或凋亡信号能引起线粒体细胞色素c释放，作为凋 亡诱导因子，细胞色素c能与Apaf-1、caspase-9前体、ATP/dATP形 成凋亡体（apoptosome），然后召集并激活caspase-3，进而引发 caspases级联反应，导致细胞凋亡。
第二节 细胞死亡
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神经细胞发育过程中，未与靶 细胞配对的细胞发生凋亡。 哺乳动物发育早期连在一起的 指间的蹼通过细胞凋亡清除。 蝌蚪向成体发育过程中尾部细 胞的凋亡。
凋亡的生物学意义 • 清除多余的细胞 • 清除发育不正常的细胞 • 清除有害的细胞
细胞凋亡的形态学特征
细胞凋亡的发生过程，在形态学上可分为三个阶段： （1）凋亡的起始： • 细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依 然完整； • 线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀， 并逐渐与质膜融合； • 染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿核膜分布； • 细胞质也发生固缩。 （2）凋亡小体（apoptotic bodies）的形成 • 核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器（如线粒体）一起聚 集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起， 逐渐形成单个的凋亡小体。 （3）凋亡小体逐渐为邻近的细胞所吞噬并消化 • 整个过程细胞质膜保持完整，细胞内容物不会渗漏到细胞外环境，因 而不会引起细胞端粒每年缩短 14-18bp， 1990他提出细胞衰老的端粒假说。 主要思想：端粒是细胞衰老的“有丝分裂钟”， 随细胞每次分裂，端粒不断缩短；当端粒长度缩 短达到一个阈值时细胞进入衰老。 生殖细胞、癌细胞具有端粒酶活性，能维持端粒 长度，从而能持续增殖；
第十五章 细胞衰老与细胞死亡
β-半乳糖苷酶染色
编码核膜蛋白的基因发生突变
成人早衰症：患者因DNA解螺旋酶基因（WRN)突变而导致DNA不能够正常修复
衰老相关基因与抗衰老基因
衰老相关基因：MORF4, p16
抗衰老基因：EF-1α,WRN,SIRT1,Klotho
细胞清除自由基的防御系统
（三）失巢凋亡——另一种凋亡形式
失巢凋亡：是又一种形式的细胞程序死亡，是在 脱离原来生存环境的特殊情况下发生的细胞凋亡， 是因细胞与细胞外基质和其他细胞脱离接触而诱 发的。
三、细胞凋亡的影响因素
四、细胞凋亡的分子机制
线虫虫体共有1090个细胞，在发育过程中 有131个细胞发生凋亡。在这一过程中确定 15个与凋亡相关的基因。
神经退行性疾病——神经元凋亡 AIDS——CD4T细胞凋亡，免疫系统崩溃心血管疾病——多种细胞的凋亡引起功能障碍
自噬类型
1. 微自噬（micro-autophagy） 2. 巨自噬（macroautophagy） 3. 分子伴侣介导的自噬 （chaperone-mediated autophagy，CMA）