第八章 电泳技术
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2023
电泳技术
目 录
• 电泳技术简介 • 电泳技术的基本原理 • 电泳技术的实验流程 • 电泳技术的优化改进 • 电泳技术的实际应用
01
电泳技术简介
电泳技术的定义
电泳技术是一种基于电场作用下溶液中带电粒子移动的分离 技术，具有高分辨率、高灵敏度和操作简便等优点。
电泳主要利用待测样品中各种粒子所带电荷量的差异，在电 场中受到的静电力也不同，从而以不同的速度移动，最终实 现样品中各种粒子的分离或鉴定。
在其他领域的应用
刑事侦查
电泳技术可用于痕迹物证 的分析和鉴定，为刑事侦 查提供重要线索。
食品工业
电泳技术可用于食品营养 成分的分析和鉴定，为食 品工业提供质量控制手段 。
能源领域
电泳技术可用于电池、燃 料电池等能源器件的制造 和性能优化，提高能源利 用效率。
THANK YOU.
。
观察分析
观察染色结果，通过拍照或记录 数据，对凝胶中的蛋白质条带进 行分析和比较。
结果整理
整理实验结果，包括蛋白质的相对 分子质量、浓度等参数的定量和定 性分析。
04
电泳技术的优化改进
电泳技术的局限性
电泳技术对样品性 质和操作条件的敏 感性。
难以实现自动化和 集成化。
电泳技术存在分辨 率和灵敏度的限制 。
在医学领域，电泳技术被用于血清蛋白分析、血 红蛋白分析、免疫电泳等诊断试剂的制作。
此外，电泳技术还可用于分析生物样品中的蛋白 质组分、DNA和RNA的分离纯化、检测蛋白质和 DNA的分子量等。
在化学领域，电泳技术可用于分离和鉴定各种离 子和分子，以及分析化学反应动力学和热力学参 数。
02
电泳技术的基本原理
电泳技术的发展历程
电泳技术
目 录
• 电泳技术简介 • 电泳技术的基本原理 • 电泳技术的实验流程 • 电泳技术的优化改进 • 电泳技术的实际应用
01
电泳技术简介
电泳技术的定义
电泳技术是一种基于电场作用下溶液中带电粒子移动的分离 技术，具有高分辨率、高灵敏度和操作简便等优点。
电泳主要利用待测样品中各种粒子所带电荷量的差异，在电 场中受到的静电力也不同，从而以不同的速度移动，最终实 现样品中各种粒子的分离或鉴定。
在其他领域的应用
刑事侦查
电泳技术可用于痕迹物证 的分析和鉴定，为刑事侦 查提供重要线索。
食品工业
电泳技术可用于食品营养 成分的分析和鉴定，为食 品工业提供质量控制手段 。
能源领域
电泳技术可用于电池、燃 料电池等能源器件的制造 和性能优化，提高能源利 用效率。
THANK YOU.
。
观察分析
观察染色结果，通过拍照或记录 数据，对凝胶中的蛋白质条带进 行分析和比较。
结果整理
整理实验结果，包括蛋白质的相对 分子质量、浓度等参数的定量和定 性分析。
04
电泳技术的优化改进
电泳技术的局限性
电泳技术对样品性 质和操作条件的敏 感性。
难以实现自动化和 集成化。
电泳技术存在分辨 率和灵敏度的限制 。
在医学领域，电泳技术被用于血清蛋白分析、血 红蛋白分析、免疫电泳等诊断试剂的制作。
此外，电泳技术还可用于分析生物样品中的蛋白 质组分、DNA和RNA的分离纯化、检测蛋白质和 DNA的分子量等。
在化学领域，电泳技术可用于分离和鉴定各种离 子和分子，以及分析化学反应动力学和热力学参 数。
02
电泳技术的基本原理
电泳技术的发展历程
生物分离工程第八章电泳技术ppt课件
– SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试 剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠 ，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂 ，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之 间的二硫键断裂。
– 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白 质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基 酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶 束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消 除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚 合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中 分子形状对迁移率的影响。
电泳的简单原理
蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中 ，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它 大分子的相互作用。
带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺 寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学 与化学特性。
电泳迁移率
电泳迁移率（mobility）:在电位梯度E的影响下 ，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。
工作原理
蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不 同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是 在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该 蛋白的等电点（isoelectric point pI）。
蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象， 是一个物理化学常数。
可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析
其中区带电泳是目前常用的电泳系统。
区带电泳的主要技术
区带电泳中的常用技术
– 载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、 聚焦电泳
– 无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳
凝胶电泳
作为电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分 子的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电 内渗小等特性。
– 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白 质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基 酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶 束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消 除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚 合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中 分子形状对迁移率的影响。
电泳的简单原理
蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中 ，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它 大分子的相互作用。
带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺 寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学 与化学特性。
电泳迁移率
电泳迁移率（mobility）:在电位梯度E的影响下 ，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。
工作原理
蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不 同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是 在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该 蛋白的等电点（isoelectric point pI）。
蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象， 是一个物理化学常数。
可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析
其中区带电泳是目前常用的电泳系统。
区带电泳的主要技术
区带电泳中的常用技术
– 载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、 聚焦电泳
– 无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳
凝胶电泳
作为电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分 子的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电 内渗小等特性。
电泳技术(基础医学与医学实验技术)
电泳技术的应用领域
总结词
电泳技术广泛应用于生物、医学、化学等领域。
详细描述
电泳技术广泛应用于生物学、医学、化学和环境科学等 领域。在生物领域，电泳技术用于蛋白质、核酸和糖类 等生物大分子的分离和鉴定。在医学领域，电泳技术用 于血液、尿液和其他体液中蛋白质、酶和代谢产物的分 析。在化学领域，电泳技术用于合成高分子聚合物、金 属离子和有机化合物的分离和纯化。此外，毛细管电泳 和芯片电泳等新型电泳技术在生命科学和临床诊断等领 域也具有广泛的应用前景。
DNA电泳
DNA电泳是电泳技术中用于分离、鉴定和纯化DNA片段的一种方法。通过电泳技术可以将DNA片段按照大小进行分离，为基 因克隆、基因诊断和基因组学研究等领域提供基础。
DNA电泳的原理是利用DNA片段在电场中的迁移率不同而实现分离。DNA片段在电场中的迁移率取决于其大小、电荷和构象 等因素。通过选择合适的电泳介质和电泳条件，可以实现对DNA片段的精细分离。
电泳技术(基础医学与医学实验技 术)
contents
目录
• 电泳技术概述 • 电泳技术的基本类型 • 电泳技术在基础医学中的应用 • 电泳技术在医学实验技术中的应用 • 电泳技术的优缺点 • 电泳技术的发展趋势和未来展望
01 电泳技术概述
电泳技术的定义
总结词
电泳技术是一种利用电场对带电粒子进行分离的实验技术。
样品损失。
局限性
电泳技术对于某些特定类型的 生物大分子分离效果不佳，如 蛋白质的分离。
耗时长
电泳技术需要较长时间进行分 离，对于某些快速变化的生物 样品，可能无法及时检测。
高压电场影响
电泳过程中需要施加高压电场 ，可能会对生物大分子产生一 定的影响，如引起蛋白质的变
第八章 电泳技术
但实际情况中， f 还取决于凝胶厚度、颗粒尺寸、甚
至是介质的内渗等。
1.迁移率（或泳动度）
是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的 速度，可用下列公式计算：
Ｕ =υ /E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt
Ｕ为迁移率（cm2· V-1· min-1）；υ 为颗粒泳动速度（cm· s-1）； E为电场强度（V· cm-1）； t为通电时间（s或min） d为颗粒泳动的距离（cm）； l为滤纸有效长度（cm）； V为实际电压（V）；
第八章电泳技术(Electrophoresis)
一、基本原理 二、电泳的分类 三、醋酸纤维素薄膜电泳 四、琼脂（糖）凝胶电泳 五、丙烯酰胺凝胶电泳
六、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
七、常见电泳设备及试验举例
电泳
是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷
的电极移动的现象。
Arne Tiselius——物理化学家、诺贝尔奖金获得者 电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层，离 子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时，电泳现象变得越 明显。因此，电泳现象中的表面电势和双电层因素起着决 定性的作用。
（3）溶液的离子强度
电泳液中的离子增加会使电泳迁移率降低，原因 是带电的离子会吸引相反符号的离子聚集在其周围， 相成一个与运动粒子符号相反的离子氛（ionic atmosphere），它使该离子向相反的方向运动，从 而降低了该粒子的迁移率。
离子的这种阻碍效应是与其浓度和价数相关的。 用离子强度来表示，它的数值如下式：
凝胶作为支持介质的电泳方法 。
PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸
等生物分子的分离、定性、定量及少量的制
备，还可测定分子量、等电点等 。
1.丙烯酰胺凝胶的优点：
至是介质的内渗等。
1.迁移率（或泳动度）
是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的 速度，可用下列公式计算：
Ｕ =υ /E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt
Ｕ为迁移率（cm2· V-1· min-1）；υ 为颗粒泳动速度（cm· s-1）； E为电场强度（V· cm-1）； t为通电时间（s或min） d为颗粒泳动的距离（cm）； l为滤纸有效长度（cm）； V为实际电压（V）；
第八章电泳技术(Electrophoresis)
一、基本原理 二、电泳的分类 三、醋酸纤维素薄膜电泳 四、琼脂（糖）凝胶电泳 五、丙烯酰胺凝胶电泳
六、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
七、常见电泳设备及试验举例
电泳
是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷
的电极移动的现象。
Arne Tiselius——物理化学家、诺贝尔奖金获得者 电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层，离 子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时，电泳现象变得越 明显。因此，电泳现象中的表面电势和双电层因素起着决 定性的作用。
（3）溶液的离子强度
电泳液中的离子增加会使电泳迁移率降低，原因 是带电的离子会吸引相反符号的离子聚集在其周围， 相成一个与运动粒子符号相反的离子氛（ionic atmosphere），它使该离子向相反的方向运动，从 而降低了该粒子的迁移率。
离子的这种阻碍效应是与其浓度和价数相关的。 用离子强度来表示，它的数值如下式：
凝胶作为支持介质的电泳方法 。
PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸
等生物分子的分离、定性、定量及少量的制
备，还可测定分子量、等电点等 。
1.丙烯酰胺凝胶的优点：
电泳技术
1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；
2）PH中性或易调为中性；
3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。
1. 速率区带离心度沉降
用途：分离密度相近而大小不等的细胞或颗粒。 特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离 生物颗粒的最小密度。
原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数 以不同的速度沉降而达到分离。
二、离心机的结构与分类 (一）分类 1.低速离心机：转速<6kr/min 2.高速离心机：转速10~25kr/min的离心机 称为。 3. 超 速 离 心 机 ： 转 速 >25kr/min ， 离 心 力 >89Kg；最高转速可达100kr/min，离心力 超过500kg。
一、离心技术原理 在离心力场中，颗粒在离心运动中受离心力、 重力、摩擦力及浮力的共同作用。 在离心力场中，如果颗粒的密度大于周围介 质的密度，则颗粒发生沉淀；反之发生漂浮。 无论发生沉降与漂浮，离心力的方向总与浮 力的方向相反，离心力加大时，反向的两个 力也增大，当离心力与反向力达到平衡时， 可人力的沉降（浮力）加速度为零，直到各 组分达到分离目的。
第三节
电泳技术
电泳技术：利用带电粒子在电场作用下 定向移动的特性，对混合物组进行分离、 纯化和测定的一项技术。 电泳：溶液中带电粒子在电场中定向移 动的现象称为电泳
1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷 相反的电极移动的过程。 2 电泳技术优点：快速、准确、重现性好 3 电泳方法分类 按电场分：常压（<500V，适用大分子）、高 压（>500V，适用小分子） 支持体分：自由电泳、区带电泳 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式 4 电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区 带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽）
电泳技术
v=QX /6πrη
迁移率u：单位电场强度下的电泳速度， 粒子的迁移 率在一定条件下决定于粒子本身的性质即其所带电荷 及大小和形状。
u＝v/E=q/6πrη
在具体实验中，移动速度V为单位时间t（单位为s）内移 动的距离d（单位为cm），即V＝ d/t。电场强度X为单位 距离L（单位为cm）内电势差E（单位为伏特），即 X＝E/L。将这两个公式代入上述公式，得到 U=v/X=dL/Et d=u*Et/L 由此可以得到两种物质移动距离的差为 △ d=(dA-dB)=(uA-uB)Et/L 从这个公式可以看出物质能否进行分离决定于二者的迁 移率。
+
白蛋 白(A)
α1
α2
β
γ
血清蛋白的 pI 大多在 7.5 以下，在 pH8.6 的巴比妥缓冲液 中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电 点及形状也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维 薄膜上分离成 A、α 1、α 2、β 、γ 五条区带。
蛋白质名称 清蛋白 α 等电点 4.88 5.06 分子量 69000 α 1－200000 α 2－300000 β γ 5.12 6.85－7.50 90000－150000 156000－300000
电泳（el或大分子在外加电场中，向带相反电荷 的电极作定向移动的现象称为电泳。生物分子都带 电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质 的 pH 及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性 质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作 用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在 一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离 鉴定各组分的目的。
4 、定量 1）取 6 支试管并编号，分别加入 0.4N 氢氧化钠 4ml。 2 ）剪下各条蛋白带和在膜空白部位剪一条带（空白带的宽 why？） 度以最窄的条带为准， ， 将各条带浸入试管， 不时摇动， 洗脱蓝色。 3）光光度计比色，波长为 650nm，以空白薄膜条洗出液为 空白对照，读取其它 5 管的光密度值。 5、计算总吸光度 光密度总和 T＝A＋α 1＋α 2＋β ＋γ 各部分蛋白质的百分数： 蛋白质％＝A/T×100％
第八章电泳
分离操作
不连续的凝胶层上部和下部分别使用pH值不同的缓冲 液。以分离蛋白质为目的时，上部缓冲液根据待分离蛋白 质的等电点选定。例如，如果蛋白质的等电点小于8－9.5 时，可采用pH8.3的甘氨酸-Tris－HCl缓冲液。浓缩层用 pH6.8的缓冲液平衡。此时，Cl－为前导离子，阴离子甘氨 酸为末尾离子，Tris为反离子，，料液中的蛋白质夹在前 导离子和末尾离子间在浓缩层内泳动，最后达到等速电泳 状态进入下层分离凝胶。在下层凝胶中，蛋白质受到高浓 度凝胶的分子筛作用，不能继续保持等速泳动，被末尾离 子甘氨酸超过，因而在分离区带前面显示甘氨酸区带的pH 值，蛋白质之间根据荷电量和分子大小，进行一般的凝胶 电泳，得到分离。
3.3 等电点聚焦
IEF的分离对象：蛋白质、两性分子 IEF操作的关键:是调配稳定的连续pH梯度， 一般采用氨基酸混合物或氨基聚合羧酸的缓冲 溶液调 配pH梯度，前者的生物相容性好，但 形成的pH梯度稳定性较差；后者的聚合物含有 许多正负电荷，且与蛋白质的等电点范围相同， 缓冲能力强，pH梯度较为稳定，称为载体两性 电解质。 应用：同工酶分离、分析、pI测定
3.2 不连续凝胶电泳
等速电泳的关键：使用含强酸和强碱基的前导 电介质以及含有弱酸和弱碱基的末端电解质从电泳 池的两侧流过，含料液的两性试样从电泳池中央流 过，调pH值，使前导离子 ＞样品＞末端离子，使 不同的溶质在电场力作用下达到分离。 用途：分析技术，目标蛋白与杂质的分离，两 种蛋白质的分离。
c)特点
优点： 混合物可以达到完全分离，而 且只要电场保持不变，扩散和对流 迁移就不会影响分离的有效性。
缺点： ①.载体两性电解质对产品产生污染； ②.pH梯度的稳定性不高； ③.操作过程中容易发生凝胶脱水起皱现象。 ④.等电点聚焦要求用无盐的溶液，而在无 盐的溶液中蛋白质可能发生沉淀。
第八章 电泳
三、影响电泳分离的因素 （一）、被分离物质的本性（内部因素） 1、结构（形状） 2、电荷 3、大小
（二）、外部因素 1、支持介质 蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
（1）、介质可能对样品物质有吸附作用
（2）、电渗作用 电渗就是在电泳过程中，由于支持物吸 附水合离子（H3O+）或OH-，使溶液相对带正 电或负电，在电场作用下溶液向相反的方向 移动，这一现象称电渗。
SDS + 蛋白质
1.4g 1g
巯基 乙醇
蛋白质-SDS复合物
引入的净电荷大约为蛋白质本身的净电 荷的10倍，消除了蛋白质原有电荷的影响。
②、SDS与蛋白质结合后，引起了蛋白质构象 的改变。 蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状为长 椭圆棒，短轴长度都一样，约为10Å，而长轴 则随蛋白质的分子量成正比地变化。
B
C
15000
40000
4
2
6.0
6.0
（1）将该蛋白混合样品溶液进行SDS-PAGE和常规 PAGE电泳，在电泳图谱上会有几条带，在图上表明 位置； （2）请设计一个方案来分离纯化这三种蛋白质。
2、名词解释 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 3、简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳和连续聚 丙烯酰胺凝胶电泳，常规聚丙烯酰胺凝胶电 泳与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别及分离 原理？ 4、影响电泳分离的主要因素？（8分）
（isoelectrofocusing,IEF或EF）
1、等电聚焦电泳的定义 利用具有pH梯度的支持介质分离等电点不 同的蛋白质的技术。
pH=10
负极
pH=3
正极
2、原理 （1）在支持介质中放入 载体两性电解质，当通 以直流电时，载体两性 电解质即形成一个由阳 极到阴极逐步增加的pH 梯度； （2）蛋白质是两性电解 质，当蛋白质放进此体 系时，不同的蛋白质即 迁移并聚焦于相应的等 电点位置上。
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载体两性电解质pH梯度等电聚焦原理
载体两性电解质pH梯度等电聚焦是在支持介质
中加入载体两性电解质，通以直流电后在两极 之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，当带电 的蛋白质分子进入该体系时，便会产生移动， 并聚集于相当于其等电点的位置。
等电聚焦分离示意图
常规PAGE和等电聚焦电泳的区别
载体两性电解质和pH梯度的形成
无毒； 染色、脱色程序简单，背景色较低；
热可逆性；
生物中性：一般不与生物材料结合； 电内渗（EEO）大：对于对流电泳有益
电泳新介质
N-取代聚丙烯酰胺介质： Poly-N-acryl-tris (NAT) gel N-Acryloyl sugars Acryloylmorpholine Hydrolink gels N-acryloylaminoethoxye thanol (AAEE) 特点： 具有极强的水解稳定性 具有高度亲水性 孔径大
因此，在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离时
，在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度，还取 决于蛋白质的尺寸和形状。
PAGE可以用圆盘电泳、垂直电泳或水平电泳
电泳前的准备工作
缓冲系统的选择：
– 保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物 活性的保持；
– 电泳时间和分辨率：从理论上讲PAGE可
以在任何pH进行，但实际上过酸或过碱的
影响聚合的主要因素
引发剂和增速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度 过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制 使聚合过程在40~60分钟内完成。 系统pH值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最 佳pH值，以获得最佳的聚合结果； 温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高温度可 以是凝胶透明而有弹性； 分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气 系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合；
聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应
在使用凝胶介质的电泳中，由于电泳介质具有高粘度 和高的摩擦阻力，因此不仅可以防止对流，而且可以 把扩散减到最小。 凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺寸和形状 凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的 尺寸筛分能力（Size sieving capacity），这种现象被称 为分子筛效应（molecular sieving effect）
5 10 15
20
30~200 15~100 10~50
2~15
5 10 15
20
60~700 22~280 10~200
5~150
PAGE的具体操作过程
制胶：确定凝胶配方（凝胶、引发剂、增速剂的浓度和缓 冲液），使用灌胶模具灌胶； 样品准备：选择合适的样品缓冲液、确定合适的样品浓度 （1~2mg/L，考染），加样（溴酚蓝）；
凝胶浓度太大，孔径小于样品分子尺寸，电泳时蛋白 质分子不能进入凝胶，样品仍留在加样位置； 凝胶浓度太小，孔径太大，样品中各种蛋白质分子均
随缓冲液推进，不能得到很好的分离；
凝胶浓度与分子量测定的关系
凝胶浓度 (C=2.6%) 分子量范围 (kDa) 凝胶浓度 (C=5%) 分子量范围 (kDa)
电泳：4~6小时，待溴酚蓝前沿到达阳极底部；
检测：紫外扫描或染色（考马斯亮蓝R-250、银染色—灵 敏度比考染高100倍、荧光探针）； 照相、凝胶干燥： 定量测定：
SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
主要用于测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白
质分子量的测定；
电泳技术 Electrophoresis
本章主要知识点
电泳的概念 电泳的基本原理 电泳技术的分类 常用的凝胶电泳技术有哪些？ 电泳装置的基本组成 聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程
SDS-PAGE电泳的基本原理及过程
琼脂糖电泳的特点及其应用 等电聚焦电泳的基本原理 双相电泳的概念及其特点
蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和 分子形状的改变
未知蛋白质分子量的测定
基于上述SDS-PAGE的原理介绍，我们可以利
用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测 定；
– 以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到 不同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线， 然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳 ，测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量；
离子强度的选择
离子强度不宜过高，此时电导率低，产热少，电
泳速度快；但也不可过低，必须具有一定的缓冲 能力，过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝。
一般选择缓冲液的离子强度为0.01~0.1 mol/L之间
凝胶浓度的选择
由于PAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度，而 且取决于分子的大小、形状。因此，与凝胶的分子筛 效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电泳速度）密 切相关。 根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以将凝 胶分为： – 非排阻性凝胶（unrestrictive gel）:浓度0.7 ~1.0% 的琼脂糖凝胶； – 排阻性凝胶（restrictive gel）：浓度大于1%的琼 脂糖凝胶和常规PAGE
区带电泳的主要技术
区带电泳中的常用技术
– 载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝Байду номын сангаас电泳、
聚焦电泳
– 无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳
凝胶电泳
作为电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分 子的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电 内渗小等特性。 凝胶电泳的支持介质：
– 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PGA） 由丙烯酰胺和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺在引发 剂和增速剂的作用下，聚合而成； – 琼脂糖凝胶： 从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部 分是由1,3连接的β-D吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水αD吡喃半乳糖交替形成的；
等电聚焦技术的关键在于pH梯度的建立 载体两性电解质的概念：
作为载体两性电解质应该具有以下特点：
– 应该是两性的，使它们在分离柱中也能达到一个平 衡位置； – 应该可以作为“载体”，两性电解质不能用于等电 聚焦，只有载体两性电解质，即具有好的导电性和 好的缓冲能力的化合物才能用于等电聚焦。
工作原理
蛋白质的等电点
蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不 同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是 在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该 蛋白的等电点（isoelectric point pI）。
蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象，
是一个物理化学常数。 可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析
条件下将发生某种水解（脱酰胺）。因此
，pH应限制在3~10之间。
缓冲系统的选择原则
是两种标准的对立权衡 – 如果缓冲液的pH选择在远离样品中各种蛋白的等电 点，蛋白质分子所带电荷的密度大，电泳时间短， 区带细而窄；
– 如果缓冲pH选择在靠近被分离样品的一种或几种蛋 白质的等电点，则蛋白质分子之间的电荷密度差别 大，分辨率就高； 因此，常常选择pH 8.0~9.5的缓冲，常用的缓冲液 有Tris-甘氨酸（pH 8.3~9.5），Tris-硼酸(pH 8.3~9.3)和 Tris-醋酸（pH 7.2~8.5）
电泳洗脱仪：回收样品 凝胶扫描和摄录装置：对电泳区带进行扫描，从而给 出定量的结果。
垂直电泳槽及灌胶模具
电泳的一般过程
常规聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
由于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是多孔介质，不仅 能防止对流，把扩散减少到最低；而且其孔径大小与 生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分子 的分离，具有分子筛效应。
电势和双电层的因素起着决定性的作用。
电泳的简单原理
蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中
，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它 大分子的相互作用。
带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺
寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学
与化学特性。
Stoke’s Law（斯托克斯定律）
如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场 中，使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的 有效电荷Q和电位梯度E，它们与介质的摩擦阻力f相抗 衡，这种抗衡服从斯托克斯定律：
电泳系统的基本组成
电泳槽：是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、 垂直板电泳槽、水平板电泳槽 电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳200~600V，载体两性电解质 等电聚焦电泳1000~2000V，固相梯度等电聚焦 3000~8000V 外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却； 凝胶干燥器:用于电泳和染色后的干燥； 灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子； 电泳转移装置：利用低电压，大电流的直流电场，使 凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上， 如PVDF膜
是介质粘度为η中半径为r的颗粒的移动速度。
但实际情况中， 还取决于凝胶厚度、颗粒尺寸、甚至 是介质的内渗等。
电泳迁移率
电泳迁移率（mobility）:在电位梯度E的影响下 ，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。
d m tE
其单位是cm2· -1 · -1 sec V 电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离不同物 质的基础
特点：设备简单、操作简便、测定快速、重复
性高、样品无需纯化。
SDS-PAGE 的原理
蛋白质分子的解聚
– SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试 剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠 ，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂 ，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之 间的二硫键断裂。 – 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白 质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基 酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶 束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消 除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚 合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中 分子形状对迁移率的影响。