南昌地区蔬菜冰核活性细菌分离鉴定
优良发酵果蔬原酱专用乳酸菌的筛选及鉴定
２ ０℃培养箱 培 养 。培养 ２ ７ １ 、４ ｄ 观 察 菌生 长 、 、０ １ ，
情 况及 明胶 是否融 化 。
１２４ 菌株发酵 果 蔬酱 性 能试 验 ．．
理一 接种一发 酵。
发 酵 果酱 的 制
淀粉水 解试 验 ： 供试 菌 株 接种 于含 ０ ５ ｇ可 将 ． 溶性 淀粉 的 Ｐ Ｙ基 础 培养 基 ， 少 量 培 养液 于 比色 取 皿 ， 未接种 的培养液 作对 照 ， 取 分别 向其 中加入路 哥
摘 要 ： 用 目的 平 板 梯 度 稀 释 法 ， 自然 发 酵 果 蔬 原 浆 及 中外 泡 菜 老 液 中 分 离 到 ２ 采 从 ２株 乳 酸菌 。采 用 ＭＲ （ Ｈ ． Ｓｐ２
０ 初 筛 平 板 和 ＭＲ （ ０ 葡 萄 糖 ） 筛 平 板 ， 选 小 ４株 耐 酸 、 高糖 乳 杆 菌 。对 其 进 行 了 ｐ 值 、 度 、 菌 数 Biblioteka ） Ｓ ３％ 复 筛 耐 Ｈ 酸 活
采 用 雷 磁
１２４２ 发 酵果蔬 酱酸度 的测定 ．．．
准确 吸取发
酵液 １ Ｌ 加入 １ 酚 酞 指 示 剂 ２～３滴 ， ０ １ ０ｍ ， ％ 用 ．
ｍ ｌＬ标准 Ｎ Ｏ ｏ ／ ａ Ｈ溶 液滴 定 至 微红 色 ３ ０Ｓ不褪 色 ， 记 录标 准 Ｎ Ｏ 用量 ， ａＨ 同时 做空 白试 验 。 以下 式计 算样 液的总酸度 。
ｍ 。盐 溶 液 Ⅱ成 分 ： ａ １ ０ ２ ｇ Ｍｇ Ｏ Ｌ Ｃ Ｃ ２ ． ， Ｓ ４‘７ ２ ＨＯ
０． ８ ｇ， ＨＰＯ４１． ＫＨ２ ４ Ｋ２ ０ ｇ， ＰＯ４ １ ０ ｇ， ＨＣＯ３ １ ０ ． Ｎａ ０．
ｇ Ｎ Ｃ ． ， 馏 水 １ ０ Ｌ ， ａ １ ０ｇ 蒸 ２ ０ｍ 。 ０
江西省苦瓜枯萎病菌的分离、鉴定及苦瓜种质抗性的评价
江西农业大学学报2017,39(3):476-484 Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensishttp://xuel)a().j DOI:10」3836/j.jjau.2017062关峰，万新建，张景云，等.江西省苦瓜枯萎病菌的分离、鉴定及苦瓜种质抗性的评价[J].江西农业大学学报，2017,39 (3) ：476-484.江西省苦瓜祜萎病菌的分离、鉴定及苦瓜种质抗性的评价关峰，万新建，张景云，石博，刘玉婷，缪南生*(江西省农业科学院蔬菜花卉所，江西南昌330200)摘要:通过分离、纯化和鉴定江西省苦瓜枯萎病致病菌株，探讨适用于江西地区苦瓜苗期人工接种的抗性鉴定 方法，对36个苦瓜品种进行抗性鉴定，筛选高抗资源，以期为抗性育种提供科学的理论基础。
采用室内筛选和 田间试验相结合的方法。
从江西省苦瓜枯萎病病株茎基部分离、纯化了 3株致病力较强的尖孢镰刀菌um oxysporam)，通过形态观测、致病力检测和rRNA-ITS序列分析，初步确定该病是由尖孢镰刀菌苦瓜专化型(f.oxysporam f.sp.momdicae)。
优化了适用于江西地区苦瓜苗期人工接种方法，在此基础上，米用浸根移栽法对36个苦瓜品种进行枯萎病抗性(fusarium oxysporam f.sp.)鉴定，发现具有高抗枯萎病特性材料6份，抗病材 料11份，中抗材料4份，高感材料9份。
关键词:苦瓜;枯萎病;致病力;抗性鉴定中图分类号:S436.429;S642.5 文献标志码:A文章编号：1000-2286( 2017) 03-0476-09 Isolation and Identification of Pathogen Causing Fusarium Wilt and Disease Resistance Evaluation of Bitter Gourd in JiangxiG U A N F e n g，W A N X i n-j i a n，Z H A N G J i n g-y u n，S H I B o，L IU Y u-t i n g，M IA O N a n-s h e n g"(Vegetable and Flower Institute，Jiangxi Acadmy of Agricultural Sciences，Nanchang330200，China)Abstract：In order to provide a scientific basis for the anti-wilt breeding program of fusarium wilt of in bitter gourd in Jiangxi Province，it is very important to screen and identify the pathogen which causes fusarium wilt.The resistance identification technology was investigated with inbred lines presenting different degrees of field resistance.A lab-screening and field experiment were carried out to identify the pathogen.Three pathogenic strains were obtained from the diseased plants.The pathogen was isolated and characterized based on the morphological features，pathogenicity test，and sequence analysis of internal transcribed spacer region of the ri-bosomal DNA(rRNA-ITS).The results showed that the fusarium wilt was caused by fusariumoxysporum f.sp.收稿日期:2016-12-10 修回日期:2017-02-20项目基金：国家现代农业产业技术体系专项资金项目（CARS-25)、江西省现代农业科研协同创新专项经费 (JXXTCX2015005)和江西省农科学院创新基金博士启动项目（20151CBS002)Project supported by the National M odern Agriculture Industr y Technolog^^System Special Fund Project(CARS-25)，Provincial M odern Agricultural Research Collaborative Innovation Special Funds of Jiangxi(JXXTCX2015005) and Ph.D.Programs Foundation of Innovation Fund Jiangxi Academy of Agricultural Sciences (20151CBS002)作者筒介:关峰（1986—），女，助理研究员，博士，主要从事蔬菜遗传育种与栽培技术研究，guanfeng_0813@;*通信作者:缪南生，研究员，jaasvfimiao@。
702 抗尖孢镰刀菌次级代谢产物的 分离鉴定及活性研究
种子培养基： 蔗 糖 20 g，玉 米 粉 30 g，黄 豆 粉 10 g，酵 母 膏 4 g，碳 酸 钙 6 g，豆 油 4 mL，定 容 至 1 000 mL，起始 pH 7． 0。
发酵培养基： 玉米淀粉 16． 83 g，玉米粉 30 g，葡萄糖 20 g，磷酸二氢钾 0． 3 g，蛋白胨 8． 64 g，黄豆饼 粉 15 g，硝酸钾 5g，氯化钙 5 g，豆油 10 mL，定容至 1 000 mL，起始（ 消前） pH8． 0。 1． 1． 4 阳性对照药 纳他霉素，购自北京东方瑞德生物技术有限公司。 1． 2 实验方法 1． 2． 1 链霉菌 702 种子培养 将链霉菌 702 斜面菌种制成孢子悬液（ T660nm = 80% ） ，按 2． 5% 体积比接 种链霉菌 702 孢子悬液于装有 400 mL 种子培养基的 2 000 mL 三角瓶中，30 ℃ ，200 r / min 回转式摇床 旋转培养 48 h。 1． 2． 2 链霉菌 702 的 50 L 罐一级发酵 接种 1． 5 L 培养 48 h 的链霉菌 702 种子液于装有 30 L 发酵 培养基的 50 L 发酵罐中，以转速 200 r / min，通气量 30 L / min，30 ℃ 下培养。 1． 2． 3 链霉菌 702 的 500 L 罐二级发酵 接种培养 48 h 的链霉菌 702 一级发酵液 30 L 于装有 200 L 的发酵培养基的 500 L 发酵罐中以转速 200 r / min，通气量 200 L / min，30 ℃ 下培养。 1． 2． 4 化合物的分离纯化 200 L 链霉菌 702 发酵液，加 2 倍体积 90% 的工业酒精室温浸提 2 次，每 次 24 h，真空抽滤，合并滤液，减压浓缩，得油状物 80 L，然后用乙酸乙酯萃取 3 次，每次 120 L，萃取液 减压浓缩，得抗尖孢镰刀菌活性物质浸膏。取浸膏 500 g，上硅胶柱色谱，用氯仿∶ 甲醇（ 100∶ 0，90∶ 10，95 ∶ 5，85∶ 15，80∶ 20，75∶ 25，0∶ 100） 溶剂系统洗脱，得 26 个馏分，合并得抗黑曲霉组分 48． 08 g。
蔬菜污染状况调查及治理对策可行性研究报告
南昌市蔬菜污染状况调查及治理对策课题研究可行性报告一、项目概述1、项目名称：南昌市蔬菜污染状况调查及治理对策2、项目实施单位：南昌市蔬菜科技推广中心江西省农科院农副产品加工测试研究所3、项目负责人：闵跃中卢普滨4、项目管理单位：南昌市蔬菜管理局二、选题的必要性蔬菜是人们生活中必不可少的食品。
随着国民经济的高速发展，我国大多数城市其处在城郊的蔬菜生产基地都不同程度地遭受了工业“三废”、城市垃圾、农药残留的污染。
污染蔬菜的物质主要有三类：一是硝酸盐和亚硝酸盐类物质；二是有害元素；三是高危险性的农药残留物。
它们给城乡居民的身体健康和安全带来了极大的威胁。
一些疑难怪病和癌症的发生以及食物中毒事件发生，都与蔬菜受污染有关。
这已成为社会不安定因素之一。
党和政府非常重视蔬菜生产，投入了大量的人力、物力和财力发展菜篮子工程。
同时也非常重视人民的身心健康和食品的安全问题。
江主席和朱总理对保障人民人体健康和安全都有过重要指示，把安全隐患消灭在萌芽之中。
鉴于蔬菜对人体健康和安全的重要性，目前国内许多大、中城市都极其重视，投入巨资，对市场销售蔬菜品质和蔬菜生产环境进行监测。
在样品的提取、净化、浓缩过程中应用了较多的先进技术。
所用分析仪器也趋向于多检测器，多台仪器联用[6]。
国内如北京、天津、上海、浙江等地方在这些方面做得较好，引进并开发先进的检测技术，制定了较多的检测标准，开展必要的检测工作。
上海市农委制定了《农产品安全卫生质量标准》，并让农民和生产单位及时了解有关标准，指导他们生产合格、优质的农产品，供应市场。
同时上海通过抓好几个“关”即市场准入关、标准制定关、生产源头关和安全检测关，实施从“菜园子”到“菜篮子”的安全质量全过程管理，保证广大市民餐桌上的蔬菜更丰富，吃得更安全。
鉴于上海市民餐桌上的蔬菜和农副产品大多数来自外省市，有关部门采取了准入制度，根据国家现有标准对进入上海市场的农副产品（包括蔬菜）进行检测，不符合质量标准要求的坚决拒之门外；武汉市政府着重研究无污染蔬菜问题，建立了万亩无公害蔬菜生产基地。
一株耐冷微生物的分离鉴定及降解特性研究
一株耐冷微生物的分离鉴定及降解特性研究
孙梓轩;陈亚军
【期刊名称】《中国资源综合利用》
【年(卷),期】2022(40)8
【摘要】为了解耐冷微生物对马铃薯淀粉加工废水中化学需氧量(COD)的降解特性,本研究采集传统特色食品浆水,对其中的微生物进行低温培养,并以淀粉废水COD去除率为指标筛选菌株,通过菌落形态观察、生理生化反应和基因测序,对筛选的耐冷菌株进行初步鉴定。
结果显示,菌株J4初步鉴定为白地霉,属于酵母菌,其在10℃环境下处理9 d后,淀粉废水中的COD去除率达到79.14%。
菌株J4具有较好的应用潜能,可以在低温环境下处理淀粉废水。
【总页数】3页(P20-22)
【作者】孙梓轩;陈亚军
【作者单位】定西市食品检验检测中心
【正文语种】中文
【中图分类】X703.1;X172
【相关文献】
1.一株耐冷苯胺降解菌An7的分离和降解特性的研究
2.一株乙醛耐冷降解菌A27的分离鉴定和降解特性的研究
3.一株耐盐石油烃降解菌的分离、鉴定及其降解特性研究
4.一株耐盐原油降解菌的分离鉴定及其降解特性研究
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有机磷降解酶
有机磷降解酶1、有机磷降解酶性状粉状物体:浅米黄色;2、功效高效、快速、深层去除蔬菜瓜果表面的残留农药，并保持蔬菜瓜果原有的品质和色泽不变;无刺激、无毒无害、易于清洗、安全高效"有机磷降解酶"是目前我国唯一能够既安全又彻底去除新鲜蔬菜、瓜果等农产品上残留农药的产品，从根本上不同于目前市场上的化学洗涤剂采用化工原料用物理方法去除农药残留的方式，也避免了化学洗涤剂去除农药残留不彻底而且会形成二次污染的弊端，是真正的绿色环保产品。
同时它还对已被农药污染的水和土壤有相当好的修复作用，可用于江湖水域和土壤有机磷污染的生物修复。
模拟实验数据结果显示，本产品降解某些农药残留物的比率最高可以达到99.3%，对甲基对硫磷和氧化乐果的降解效果最好，对其他有机磷农药降解效果比较好，属于一种极为有效的环保型产品。
3、作用原理"有机磷降解酶"又称磷酸三酯酶，通过水解有机磷农药分子中的磷酯键而使其脱毒。
"比亚蔬菜瓜果农药降解酶"可以与瓜果蔬菜表面残留的农药发生化学反应，破坏其剧毒成分的结构，使剧毒的农药瞬间变为无毒的、可溶于水的小分子，从而达到迅速使瓜果蔬菜脱毒的效果。
新时代10119:57:18降解有机磷农药的细胞表面展示工程菌的构建及性能分析【摘要】:有机磷农药在农业生产中得到了广泛使用,但是其高毒、高残留等不利因素也给人类健康和生态环境带来巨大威胁。
环境中有机磷农药的降解主要是靠微生物进行。
从黄杆菌(Flavobacteriumsp.ATCC27551)和缺陷假单胞菌(PseudomonasdiminutaMG)中分离纯化出的有机磷水解酶(organphosphorushydrolase,OPH)以及克隆到的基因opd,在有机磷降解中研究得最为深入。
利用传统的DNA重组技术构建的基因工程菌,往往因细胞内表达的有机磷水解酶不能与胞外底物充分接触而限制了酶活性的发挥。
冰核活性细菌(INA bacteria)对杏花器官ABA、IAA和可溶性蛋白质含量的影响
质 含 量 变 化 。 结 果 表 明 ： 温 度 下 降 ， 接 菌 杏 花 器 官 内 ＡＢＡ 和 可 溶 性 蛋 白质 含 量 呈 上 升 趋 势 ． ５ ｃ是 花 器 官 的 受 随 未 一ｃ 害温 度。 种 Ｉ 细 菌后 ． 接 ＮＡ ＡＢＡ、 可溶 性 蛋 白质 含 量 下 降 ， 花 器 官 在 一 — ４ｃ受 到 伤 害 。 种 Ｉ 细 菌 与 对 照 花 器 官 杏 ３ ｃ 接 ＮＡ 问 ＡＢＡ 与 可 溶 性 蛋 白 质 含 量 差 异 达 显 著 或 极 显 著 水 平 。在 低 温 及 Ｉ ＮＡ 细 菌 影 响 下 ，ＡＡ 在 杏 花 器 官 间 无 规 律 变 化 。 Ｉ 关 键词 Ｉ 细 菌 ；杏 花 器 官 ；ＡＢＡ； ＡＡ；可 溶 性 蛋 白 质 ＮＡ Ｉ
Ａ 一 ｃ ｅｆ ｗ ｒ ｒａ ｓ ｅｅｉｊｒｄ：ｎ ｅ ｅＩ Ａ ｂ ｃｅ ａ ｒａｍｅ ｔ ｔｅ ｏｔｎ ｏ Ｂ ｎ ｏｕ ｌ ｐｏｅｎｗ ｒ ｅ ｔ ５ｃｔ ｏ ｅ ｇ ｎ ｒ ｕｅ ｕ ｄ ｒｈ ａｔｒ ｅｔ ｎ． ｈ ｎｅ ｔ ｆ Ａ ａ ｄｓｌｂｅ ｒｔｉ ｅｅｄБайду номын сангаас— ｈ ｌ ｏ ｗ ｎ ｔ Ｎ ｉ ｔ ｃ Ａ
茄子叶际固氮菌的分离鉴定·培养特性及抑菌活性
茄子叶际固氮菌的分离鉴定㊃培养特性及抑菌活性幸翀１，郭青云２∗㊀（１．赣南医学院医学信息工程学院，江西赣州３４１０００；２．赣南师范大学生命科学学院，江西赣州３４１０００）摘要㊀采用Ａｓｈｂｙ无氮培养基从茄子叶际分离得到１株具有高效固氮性能的自生固氮菌ＱＺ－１，经１６ＳｒＤＮＡ序列鉴定，该菌株与克雷伯氏菌属各菌株同源性高达９９％以上，初步鉴定为克雷伯氏菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｓｐ．），其在酵母粉为碳源㊁ｐＨ为５．０时生长最好㊂菌株ＱＺ－１具有广谱抗真菌活性，对油菜菌核病㊁葡萄炭疽病㊁番茄灰霉病抑制效果可达４０％以上㊂自生固氮菌ＱＺ－１具有固氮和生防作用，可为进一步研发优良的叶际固氮菌肥提供微生物资源㊂关键词㊀茄子；叶际固氮菌；克雷伯氏菌；分离鉴定；培养特性；抑菌活性中图分类号㊀Ｓ１８２㊀㊀文献标识码㊀Ａ㊀㊀文章编号㊀０５１７－６６１１（２０２３）１０－０００１－０４ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５１７－６６１１．２０２３．１０．００１㊀㊀㊀㊀㊀开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＣｕｌｔｕｒａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄＡｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆＮｉｔｒｏｇｅｎ⁃ｆｉｘｉｎｇＢａｃｔｅｒｉａｆｒｏｍＰｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅｏｆＳｏｌａｎｕｍｍｅｌｏｎｇｅｎａＬ．ＸＩＮＧＣｈｏｎｇ１，ＧＵＯＱｉｎｇ⁃ｙｕｎ２㊀（１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃａｌａｎｄＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＧａｎｎａｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇａｎｚｈｏｕ，Ｊｉａｎｇｘｉ３４１０００；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＧａｎｎａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇａｎｚｈｏｕ，Ｊｉａｎｇｘｉ３４１０００）Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ａｎｉｔｒｏｇｅｎ⁃ｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｓｔｒａｉｎＱＺ⁃１ｉｎｔｈｅｐｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅｏｆＳｏｌａｎｕｍｍｅｌｏｎｇｅｎａＬ．ｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｕｓｉｎｇＡｓｈｂｙｎｉｔｒｏｇｅｎ⁃ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ．Ｂｙ１６ＳｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙｂｅｔｗｅｅｎｓｔｒａｉｎＱＺ⁃１ａｎｄＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｉｓｏｌａｔｅｄｗａｓｕｐｔｏ９９％，ｔｈｕｓ，ｔｈｅｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｗａｓｉｄｅｎｔｉ⁃ｆｉｅｄａｓＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｓｐ．．ＴｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｓｔｒａｉｎＱＺ⁃１ｗａｓｂｅｔｔｅｒｗｉｔｈｙｅａｓｔｐｏｗｄｅｒａｓｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅａｔｐＨ５．０．ＳｔｒａｉｎＱＺ⁃１ｈａｄｂｒｏａｄ⁃ｓｐｅｃｔｒｕｍａｎｔｉ⁃ｆｕｎｇａｌａｃｔｉｖｉｔｙ，ｗｉｔｈａｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆｏｖｅｒ４０％ｏｎＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ，ｇｒａｐｅａｎｔｈｒａｃｎｏｓｅａｎｄＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ．ＴｈｅａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｕｍＱＺ⁃１ｈａｄｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｅｆｆｅｃｔｓ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｐｒｏｖｉｄｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｓｏｕｒｃｅｓｆｏｒｔｈｅｆｕｒｔｈｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｎｉｔｒｏ⁃ｇｅｎ⁃ｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＳｏｌａｎｕｍｍｅｌｏｎｇｅｎａＬ．；Ｎｉｔｒｏｇｅｎ⁃ｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｆｒｏｍｐｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｓｐ．；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｃｕｌｔｕｒａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓ⁃ｔｉｃ；Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌａｃｔｉｖｉｔｙ基金项目㊀国家自然科学基金项目（３２１６０３１４）㊂作者简介㊀幸翀（１９７０ ），男，江西南康人，副教授，硕士，从事生物检测研究㊂∗通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事生物防治㊁昆虫－微生物互作研究㊂收稿日期㊀２０２２－０７－２９㊀㊀植物叶际存在许多有益的微生物种群，在一定程度上促进植物生长㊁拮抗植物病原菌㊂固氮菌可以定殖在植物叶际，通过固定空气中的氮气为植物生长提供必需营养物质，促进植物生长繁殖，在自然生态系统氮循环中发挥着重要的作用［１－２］㊂固氮菌是植物叶际的主要微生物类群，大多为细菌，目前已分离出的叶际固氮菌主要包括固氮菌属（Ａｚｏｔｏ⁃ｂａｃｔｅｒ）㊁气杆菌属（Ａｅｒｏｂａｅｔｅｒ）㊁拜氏固氮菌属（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｅｋｉａ）㊁黄杆菌属（Ｆｌａｖｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ）㊁假单胞杆菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）㊁分枝杆菌属（Ｍｙｅｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ）㊁克氏杆菌属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）㊁螺菌属（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）等［２－４］㊂研究发现叶际固氮菌不仅具有较高的固氮能力，还能促进作物生长，提高作物产量㊂如将森林植物叶际分离出Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ＴＫ２，接种于玉米叶际，可使产量提高约１／３［５］㊂水稻叶际固氮菌具有溶磷作用并能产生吲哚乙酸，可促进水稻生长［６］㊂叶际固氮菌还能产生抗菌物质，降低玉米大㊁小斑病的发病率，提高植物抗病能力，间接促进作物生长发育［３－４］㊂因此，固氮菌被广泛用于生物菌肥中，在取代氮肥的施用上具有广阔前景㊂茄子（ＳｏｌａｎｕｍｍｅｌｏｎｇｅｎａＬ．）是我国广泛种植的蔬菜作物，营养丰富，食用方法多样，深受人民喜爱㊂茄子生长周期长，需要大量的营养物质，氮素是限制茄子生长的主要营养元素［７］㊂合理施用氮肥可以使茄子增产增收，但多年连续施用氮肥，不仅会增加农业种植成本，还会污染环境，造成土壤板结㊁肥力下降，甚至威胁人体健康㊂生物固氮具有成本低㊁高效㊁无污染等优点被广泛用于生物菌肥中，大多数农作物施用叶际固氮菌剂后，可以促进养分的吸收，减少氮肥和农药的用量，提高作物的产量和品质［７－８］㊂茄子叶际存在大量固氮微生物，与茄子生长发育密切相关，该研究利用传统微生物学方法分离筛选茄子叶际固氮菌，并对其培养特性和抗菌活性进行研究，可为生物菌肥生产提供固氮菌种资源，对农业的生产发展具有重要意义㊂１㊀材料与方法１．１㊀材料㊀供试茄子样品于２０２１年９月采自农民自种蔬菜园，取样时每个样品随机选取５株植物，戴上无菌手套进行采集，选取地上叶片，所取叶片位于新叶与老叶之间，避免沾染泥土引起试验误差，将采集到的叶片混合放入无菌培养皿中，２４ｈ内对叶片进行处理㊂１．２㊀供试病原菌㊀棉花立枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）㊁棉花枯萎病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）㊁番茄灰霉病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅ⁃ｒｅａ）㊁黄瓜灰霉病菌（ＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａＰｅｒｓ．）㊁油菜菌核病菌（ＳｃｌｅｒｏｔｉｎｉａｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍＬｉｂ．）㊁苹果轮纹病菌（Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａｄｏｔｈｉｄｅａ）㊁葡萄炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔ－ｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）㊁稻瘟病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｏｒｙｚａｅ）均由赣南师范大学生命科学学院袁小勇教授提供㊂１．３㊀茄子叶际固氮菌分离筛选㊀将取回的新鲜叶片置于装有１００ｍＬ无菌磷酸缓冲液（ｐＨ７．０，含０．１％Ｔｗｅｅｎ）的锥形瓶中，保证溶液完全浸没叶片，２５ħ２００ｒ／ｍｉｎ摇床振荡３０ｍｉｎ，超声波４０ｋＨｚ超声５ｍｉｎ，用镊子取出叶片，将其余的溶液转移至５０ｍＬ离心管中，然后以１００００ｒ／ｍｉｎ离心安徽农业科学，Ｊ．ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．２０２３，５１（１０）：１－４㊀㊀㊀１０ｍｉｎ，倒掉上清，收集得到沉淀菌体㊂吸取１００μＬ稀释液平板涂布法均匀接种到固体Ａｓｈｂｙ无氮培养基上，２８ħ培养５ｄ㊂根据菌落形态选择长势较好㊁生长速度较快的不同菌落进行划线纯化，直至出现有规则的单菌落㊂１．４㊀菌株１６ＳｒＤＮＡ和ｎｉｆＨ基因的ＰＣＲ扩增㊀将筛选获得的固氮菌接种于ＬＢ液体培养基中，于２８ħ㊁２００ｒ／ｍｉｎ的摇床中过夜培养，收集菌体，用天根细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒进行基因组ＤＮＡ提取，以细菌１６ＳｒＤＮＡ全序列通用引物２７Ｆ／１４９２Ｒ［９］和固氮基因ｎｉｆＨ特定的引物ＰｏｌＦ／ＰｏｌＲ［１０］分别进行ＰＣＲ扩增，用１％琼脂糖凝胶电泳进行验证㊂扩增的ＰＣＲ产物送至北京擎科生物有限公司测序，使用ＮＣＢＩ数据库进行序列比对，利用ＭＥＧＡ７．０软件采用最大似然（ＭＬ）算法构建系统发育树㊂１．５㊀固氮酶活性测定㊀按照微生物固氮酶（ＮＩＴＳ）ＥＬＩＳＡ试剂盒说明书操作测定㊂取９６孔酶标板，分别依次加入待测样本１０μＬ，样本稀释液４０μＬ，加入辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的检测抗体１００μＬ，３７ħ温育６０ｍｉｎ，弃去液体，然后加入２００μＬ洗涤缓冲液洗板５次，加入显色液３７ħ避光孵育１５ｍｉｎ，加入终止液５０μＬ终止反应于１５ｍｉｎ内在４５０ｎｍ波长处测定ＯＤ值㊂同时以不同标准活性的标准品为对照绘制标准曲线，依据标准曲线计算样本固氮酶活性㊂每个样本至少重复３次㊂１．６㊀菌株培养特性研究１．６．１㊀ｐＨ对菌株生长的影响㊂取等量的细菌培养液接种于ｐＨ为５．０㊁６．０㊁７．０㊁８．０和９．０的ＬＢ液体培养基中，每个ｐＨ至少做３个平行试验，置于２８ħ下１８０ｒ／ｍｉｎ恒温振荡培养箱中培养４８ｈ，测定菌液ＯＤ６００的平均值，确定菌株的最适生长ｐＨ㊂１．６．２㊀ＮａＣｌ浓度对菌株生长的影响㊂取等量细菌培养液接种到含ＮａＣｌ质量分数为０㊁１％㊁２％㊁３％和４％的ＬＢ液体培养基中，至少做３个平行试验，置于２８ħ下１８０ｒ／ｍｉｎ恒温振荡培养箱中培养４８ｈ，测定其ＯＤ６００的平均值，确定菌株的耐盐性㊂１．６．３㊀碳源对菌株生长的影响㊂配制分别由麦芽糖㊁葡萄糖㊁淀粉和蔗糖代替ＬＢ培养基中的碳源（酵母粉）的液体培养基，取等量细菌培养液接种于上述培养基中，至少做３个平行试验，置于２８ħ下１８０ｒ／ｍｉｎ恒温振荡培养箱中培养４８ｈ，分别测定不同碳源下菌液ＯＤ６００㊂１．７㊀固氮菌对植物病原真菌的抑制活性㊀采用平板对峙法［１１－１２］研究固氮菌对植物病原真菌的抑制活性㊂将病原菌菌饼接种于ＰＤＡ琼脂平板（ｄ＝８．５ｃｍ）中央，在距离菌饼两侧３ｃｍ处划线接种菌株，将接种后的培养皿在２８ħ恒温培养箱中倒置培养５ｄ，同时接种只含有病原真菌的ＰＤＡ琼脂平板作为对照㊂用十字交叉法测量菌落直径，根据以下公式计算菌丝生长抑制率：菌丝生长抑制率＝（对照菌落直径－对峙板菌落直径）／对照菌落直径ˑ１００％㊂２㊀结果与分析２．１㊀固氮菌的分离及鉴定㊀从茄子叶际分离到１株能在Ａｓｈｂｙ无氮培养基上生长较快的菌株㊂经过５代的分离纯化后，其菌落为圆形半透明，边缘整齐，表面湿润，不易挑起，能够产生黏液㊂在显微镜下观察为棒杆状（图１）㊂通过扩增固氮酶基因ｎｉｆＨ进行复筛，扩增得到大小约为３６０ｂｐ的基因片段（图２），与预期结果一致，将其编号为ＱＺ－１㊂运用ＥＬＩＳＡ法测定其固氮酶活性，菌株ＱＺ－１的固氮酶活性为７８．７９ＩＵ／Ｌ，结合ｎｉｆＨ基因扩增和固氮酶活性测定确定菌株ＱＺ－１具有固氮能力㊂菌株ＱＺ－１的１６ＳｒＤＮＡ序列１４３７ｂｐ，序列提交至ＧｅｎＢａｎｋ数据库，登记号为ＯＮ７７８５６５㊂在数据库中进行ＢＬＡＳＴ比对发现，菌株ＱＺ－１和克雷伯氏菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ亲缘关系最近，聚为一支，序列相似度大于９９％，因此将ＱＺ－１命名为Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｓｐ．ＱＺ－１（图３）㊂图１㊀显微镜下的细胞形态Ｆｉｇ．１㊀Ｃｅｌｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｕｎｄｅｒｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ图２㊀ｎｉｆＨ基因ＰＣＲ扩增Ｆｉｇ．２㊀ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｉｆＨｇｅｎｅ２．２㊀固氮菌的培养特性２．２．１㊀ｐＨ对菌株生长的影响㊂从图４可以看出，菌株ＱＺ－１在ｐＨ为５．０ ９．０时生长较好，生长速率随ｐＨ的增大呈减小趋势，在ｐＨ为５．０时ＯＤ６００达到最大，说明克雷伯氏菌对ｐＨ有较强的酸碱适应性㊂在ｐＨ为６．０时比ｐＨ为８．０时生长状况好，说明菌株ＱＺ－１为中性偏酸菌㊂２．２．２㊀ＮａＣｌ浓度对菌株生长的影响㊂菌株ＱＺ－１在０ ４％ＮａＣｌ浓度下均能生长，说明菌株有较广的盐度适应性㊂菌株２㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年图３㊀基于１６ＳｒＤＮＡ序列的固氮菌ＱＺ－１菌株的系统发育进化树Ｆｉｇ．３㊀Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｅｖｏｌｕｔｉｏｎｔｒｅｅｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎ⁃ｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｓｔｒａｉｎＱＺ⁃１ｂａｓｅｄｏｎ１６ＳｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ的生长速率随ＮａＣｌ浓度的增大而减小，在ＮａＣｌ浓度为０时，ＯＤ６００达到最大，ＮａＣｌ浓度为４％时，ＯＤ６００最小（图５）㊂由此可见，该菌株的最佳ＮａＣｌ浓度为０，较为适宜的ＮａＣｌ浓度为０ ３％㊂２．２．３㊀碳源对菌株生长的影响㊂当ＬＢ培养基中的酵母粉被淀粉㊁麦芽糖㊁蔗糖和葡萄糖替代后，菌株ＱＺ－１对各碳源均能利用，但是酵母粉被替代后生长状况不好，在培养４８ｈ后，以淀粉为碳源的菌液ＯＤ６００最高（１．３２），远低于在ＬＢ培养基中ＯＤ６００（２．７３），说明酵母粉为菌株的最佳碳源（图６）㊂图４㊀ｐＨ对固氮菌株ＱＺ－１生长的影响Ｆｉｇ．４㊀ＥｆｆｅｃｔｏｆｐＨｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｓｔｒａｉｎＱＺ⁃１２．３㊀固氮菌对植物病原真菌的抑制活性㊀菌株ＱＺ－１具有广谱抗真菌活性，对多种植物病原菌的抑制率从大到小依次为油菜菌核病菌（６３．５３％）㊁葡萄炭疽病菌（５７．１４％）㊁番茄灰霉病菌（４８．７５％）㊁稻瘟病菌（３３．３３％）㊁棉花立枯病菌（３１．９１％）㊁苹果轮纹病菌（２１．８８％）㊁棉花枯萎病菌（２２．２２％）㊁黄瓜灰霉病菌（８．５７％），可见，其对油菜菌核病菌㊁葡萄炭疽病菌㊁番茄灰霉病菌活性的抑制效果较好，对黄瓜灰霉病菌活性的抑制效果最弱㊂与对照组相比，各试验组的抑菌圈边界清晰，抑菌圈周围菌丝生长缓慢（图７）㊂３㊀讨论与结论自生固氮菌可以独立进行固定空气中分子态氮，促进植物生长，增加农作物产量，在农业生产中发挥重要作用㊂植物叶际存在高水平的碳水化合物和碳氮比，营养物质丰富，存在广泛的固氮作用，在自然条件下已经发现菊科㊁禾本科㊁图５㊀ＮａＣｌ浓度对固氮菌株ＱＺ－１生长的影响Ｆｉｇ．５㊀ＥｆｆｅｃｔｏｆＮａＣｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｓｔｒａｉｎＱＺ⁃１图６㊀碳源对固氮菌株ＱＺ－１生长的影响Ｆｉｇ．６㊀ＥｆｆｅｃｔｏｆｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｏｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘｉｎｇｓｔｒａｉｎＱＺ⁃１十字花科㊁蔷薇科㊁杜鹃科㊁榆科等科的植物叶际具有较高的固氮酶活性［２－３］㊂人工接种叶面固氮菌可以达到增产增收的效果，大豆喷施叶面固氮菌的增产率可达１３％以上，玉米在苗期和孕穗期喷施叶际固氮菌可增产１０％以上［４］㊂自生固氮菌因其不与植物形成宿主关系且适应能力强，具有增加农作物产量以及绿色环保等优点，已成为２１世纪新型肥料发展的重要方向之一㊂该研究从茄子叶际分离到一株自生固氮菌ＱＺ－１，经１６ＳｒＤＮＡ序列比对分析鉴定为Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属，将其命名为Ｋｌｅｂｓｉｅｌ⁃ｌａｓｐ．ＱＺ－１㊂据研究报道，克雷伯氏菌属的一些种类是重要的条件致病菌和医源性感染菌，大部分克雷伯氏菌基因组可检测出固氮基因ｎｉｆ，说明该属细菌具有固氮的遗传基础，对植物的生长及代谢起着间接的促进作用，在农业生产中可作为一种绿色菌肥［１３］㊂罗霆等［１４］从甘蔗根系分离筛选到１株克雷伯氏固氮菌，其固氮百分率可达２９．２％㊂李树品等［１５］和黄磊等［１６］从小麦根系分离得到３株具有高固氮酶活性的克雷伯氏菌㊂韩梅等［１７］从玉米中分离的内生固氮菌克雷伯氏菌（Ｋ．ｔｒｅｖｉｓａｎ），具有促进玉米生长的作用㊂该研究分离的自生固氮菌ＱＺ－１在碳源氮源的利用方面基本与同属的固氮菌利用情况相似，在淀粉为碳源或者无氮条件下都能生长良好，能耐受低浓度的盐类，在偏酸（ｐＨ５．０）的环境下生长良好，而现阶段报道的菌株适应的ｐＨ为５．５ ７．２，该试验筛选菌株与一般的在酸性环境下难以生存的菌株形成差异，在菌肥应用中能更好地用于不同酸碱度的土壤，因此可以更广泛３５１卷１０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀幸翀等㊀茄子叶际固氮菌的分离鉴定·培养特性及抑菌活性地应用在农业生产中㊂图７㊀菌株ＱＺ－１拮抗真菌活性检测Ｆｉｇ．７㊀ＡｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃａｂｉｌｉｔｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎＱＺ⁃１㊀㊀克雷伯氏菌作为生防菌，对多种植物病原真菌均有抑菌活性㊂如Ｐａｒｋ等［１８］研究发现产酸克雷伯氏菌（Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ）可防治胡萝卜软腐病㊂从石斛上分离到一株内生细菌（Ｋ．ｖａｒｉ⁃ｉｃｏｌａ）可防治由链格孢引起的烟草赤星病㊁甘蓝黑斑病和番茄早疫病等［１９］㊂该研究中分离的菌株Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｓｐ．ＱＺ－１具有广谱抗真菌活性，对油菜菌核病菌㊁葡萄炭疽病菌㊁番茄灰霉病菌抑制效果可达４０％以上㊂因此，自生固氮菌ＱＺ－１的筛选为叶际固氮菌的研究提供了微生物资源，由于克雷伯氏菌繁殖速度快，对环境的适应能力强，具有固氮和生防作用，繁殖过程中能够产生黏液，易于在植物叶际定殖等优点，可望高效地应用于固氮菌剂中进行资源化利用㊂参考文献［１］ＶＯＲＨＯＬＴＪＡ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｌｉｆｅｉｎｔｈｅｐｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１２，１０（１２）：８２８－８４０．［２］潘建刚，呼庆，齐鸿雁，等．叶际微生物研究进展［Ｊ］．生态学报，２０１１，３１（２）：５８３－５９２．［３］沙小玲，梁胜贤，庄绪亮，等．植物叶际固氮菌研究进展［Ｊ］．微生物学通报，２０１７，４４（１０）：２４４３－２４５１．［４］王楠，李刚强，李云龙，等．固氮类芽孢杆菌的分离鉴定及其促生㊁抑菌活性的测定［Ｊ］．中国农业科技导报，２０１９，２１（５）：９５－１０３．［５］ＧＩＲＩＳ，ＰＡＴＩＢＲ．ＡｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｏｎｐｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅｎｉｔｒｏｇｅｎｆｉｘａｔｉｏｎｂｙｎｅｗｌｙｉｓｏｌａｔｅｄＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．＆Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ａｎｄｔｈｅｉｒｐｏｔｅｎ⁃ｔｉａｌｉｔｉｅｓａｓｂｉｏｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒ［Ｊ］．ＡｃｔａＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌＨｕｎｇ，２００４，５１（１／２）：４７－５６．［６］ＭＷＡＪＩＴＡＭＲ，ＭＵＲＡＧＥＨ，ＴＡＮＩＡ，ｅｔａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ，ｒｈｉ⁃ｚｏｐｌａｎｅａｎｄｐｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｆｕｎｇｉｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｒｉｃｅｉｎＫｅｎｙａｆｏｒｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈｐｒｏｍｏｔｅｒｓ［Ｊ］．ＳｐｒｉｎｇｅｒＰｌｕｓ，２０１３，２：１－９．［７］奚辉，陈喜靖，景金富，等．滴灌施肥对秋茄子生长㊁产量及品质的影响［Ｊ］．浙江农业科学，２０１５，５６（７）：１０００－１００１，１００３．［８］焦永刚，郭敬华，董灵迪，等．生物菌肥对土壤生态环境改良效果［Ｊ］．北方园艺，２０１７（１３）：１３５－１３９．［９］李瑞芳，赵玉峰，薛雯雯，等．一株芽孢杆菌１６ＳｒＲＮＡ的基因序列测定和系统进化分析［Ｊ］．广东农业科学，２０１１，３８（３）：１２１－１２２，１２５．［１０］ＲÖＳＣＨＣ，ＭＥＲＧＥＬＡ，ＢＯＴＨＥＨ．Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇａｎｄｄｉｎｉ⁃ｔｒｏｇｅｎ⁃ｆｉｘｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｉｎａｎａｃｉｄｆｏｒｅｓｔｓｏｉｌ［Ｊ］．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００２，６８（８）：３８１８－３８２９．［１１］王家和．烟草根病拮抗真菌的分离与筛选［Ｊ］．中国生物防治，１９９８，１４（１）：２８－３１．［１２］冯蓉，刘丽，陈海念，等．解淀粉芽孢杆菌Ｆ１１抗真菌活性研究［Ｊ］．农业资源与环境学报，２０２１，３８（５）：８４９－８５７．［１３］李梦娇，彭晟，徐绍忠，等．克雷伯氏菌在农业与环境治理上的应用［Ｊ］．生物技术进展，２０１４，４（６）：４１５－４２０．［１４］罗霆，欧阳雪庆，杨丽涛，等．１株有固氮能力的甘蔗克雷伯氏菌的分离鉴定及固氮特性［Ｊ］．热带作物学报，２０１０，３１（６）：９７２－９７８．［１５］李树品，蒋千里，楚杰，等．产酸克雷伯氏杆菌（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｏｘｙｔｏｃａ）的分离及其特性研究［Ｊ］．山东科学，１９９１，４（３）：１９－２５．［１６］黄磊，石万瑜，董绍佩，等．小麦根系克雷伯氏杆菌的分离与鉴定［Ｊ］．新疆农业科学，１９９０，２７（１）：２７－２８．［１７］韩梅，罗培宇，肖亦农，等．玉米内生固氮菌的分离鉴定及其促生长作用研究［Ｊ］．沈阳农业大学学报，２０１０，４１（１）：９４－９７．［１８］ＰＡＲＫＭＲ，ＫＩＭＹＣ，ＬＥＥＳ，ｅｔａｌ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎＩＳＲ⁃ｒｅｌａｔｅｄｍｅ⁃ｔａｂｏｌｉｔｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＫｌｅｂｓｉｅｌｌａｏｘｙｔｏｃａＣ１０３６ａｃｔｉｖｅａ⁃ｇａｉｎｓｔｓｏｆｔ⁃ｒｏｔｄｉｓｅａｓｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｎｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］．ＰｅｓｔＭａｎａｇＳｃｉ，２００９，６５（１０）：１１１４－１１１７．［１９］李祖红，曾嵘，文国松，等．一株植物内生细菌ＳＨ－１及其应用：ＣＮ２０１３１０３８３４６４．０［Ｐ］．２０１４－０１－０１．４㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年。
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生物灾害科学2012,35(2):169－171Biological Disaster Science,V ol.35,No.1,2012swzhkx@收稿日期：2012-05-15基金项目：国家科技支撑计划项目（2012BAC11B06）作者简介：宋水林，女，实验员，主要从事植物病理学研究。
*通信作者：崔汝强，男，副教授，博士，主要从事植物病害及其防治研究，Email:cuiruqiang@ 。
DOI ：10.3969/j.issn.2095-3704.2012.02.010南昌地区蔬菜冰核活性细菌分离鉴定宋水林1，郑春1，颜秋梅2，桂良杰2，崔汝强摘要：本研究对南昌地区蔬菜作物上的冰核活性细菌的进行分离鉴定，得到高冰核活性细菌3株，其中活性较强的初步鉴定为欧文氏菌属（Erwinia spp.）2株，假单胞菌属（Pesudomonas spp.）1株。
初步了解了南昌地区蔬菜上冰核活性细菌的主要种群为假单胞菌属和欧文氏菌属。
关键词：蔬菜；冰核细菌；分离；鉴定中图分类号：S436.3文献标志码：A文章编号：2095－3704（2012）02－0169－03Isolation a nd Identification of Ice Nucleating Active Bacteria on Plants inNanchang areaSONG Shui-lin 1*（1.江西农业大学农学院，江西南昌330045；2.吉州区农业局，江西吉安343000）1,ZHENG Chun 1,Y AN Qiu-mei 2,GUI Liang-jie 2,CUI Ru-qiang Abstra ct:Detection of INA (ice nucleation active bacteria)population on horticulture plants in Nanchang City was carried in this study.Through isolation and identification,3strains of high active INA were obtained among which were 2strains of Erwina spp.,1strains Pesudomona s spp.Among them Pesudomonas spp.and E.ananas were dominant population.Key wor ds:horticulture ；ice nucleation active bacteria ；isolate ；identification 1*（1.College of Agriculture,Jiangxi Agricultural University,Nanchang,330045,China;2.Jizhou Bureau of Agricultrue,Ji'an,343000,China ）霜冻是一种严重的自然灾害，能够在短短几小时内毁坏大片农作物，给农业生产造成重大损失。
长期以来人们普遍认为植物霜冻是由低温和植物的霜敏感性所决定，但难以圆满解释霜冻的原因。
自从发现冰核细菌以来，就引起人们的关注，世界上有美、日、中等20几个国家，涉及10多个学科，对冰核细菌进行了全面系统的研究，已召开6次国际生物冰核学术研讨会。
近10年来，国内外大量研究证明[1~6]目前江西省在植物冰核细菌方面的研究还未见报道，为了更好的开展霜冻害的防治工作，本研究就南昌地区蔬菜并和细菌的种类进行调查研究。
，在自然界广泛存在着的冰核活性细菌(Ice nucleation active bacteria 简称INA 细菌)，它可在-2~-3℃诱发植物细胞水结冰而发生霜冻；无INA 细菌存在的植物，一般可耐-6~-7℃的低温不发生或发生轻微霜冻。
1材料与方法1.1样品采集2011年的7月从进贤县，南昌县，新建县，安义县等地采集植物样品，卷心菜（Brassica oleraceav a r ），白菜（B.pckinensis ），青菜（B.chinensis ），花椰菜（B.oleracea var.botry tis ），莴苣（L a ctuca sativa ），刀豆（Canavalia gladiata ），豌170生物灾害科学第35卷第2期豆（Plsurn sativ um），芹菜（A pium graveolens），韭菜（A llium tuberosum），烟草（Nicotia na tabacum），茶树（Thea sinensis）菊花（Chrysanthemum），辣椒（Capsicum annuum）装入采样袋封好袋口，带回实验室，于4℃冰箱保存待用。
1.2冰核细菌的分离1.3冰核活性的测定采用V all发明[9]采用平板稀释法分离。
随机称取1g样品，用无菌剪刀剪成碎条状，放到预先装有9mL无菌蒸馏水的试管中，于250r/min摇床上室温振荡2h。
梯度稀释后涂抹于NA培养基上，20℃（最佳培养温度为20℃左右）培养4d。
挑取培养基上长出的各种类型的细菌菌落，分别移植到NA平板上纯化。
[10]，后由Lindow改进的小液滴冻结法测定冰核活性[11]。
将新鲜培养的待测菌用无菌水配制成浓度约为108cfu/mL的细菌悬浮液。
用移液器吸10ul滴到-5℃的测试表面上，每个样品测20滴，以无菌水作对照。
如在30s内有4滴以上的小液滴冻结成冰，记下冻滴数，换算成冻滴率。
重复测一次进行确认。
保藏有冰核活性的细菌。
测试表面的制作方法：将铝箔纸预先用1%的二甲苯加99%的液体石蜡配制成的溶液喷洒淋湿，放到50℃左右的恒温烘箱中烘干。
此法处理的目的是增加滴加到其上的测试液体的表面张力，使之滴下后不易散开而保持液滴状，易于观察和计数冻滴数。
使用时，将铝箔纸叠置成四周封口不漏水状，大小约为10㎝×15㎝，置入-5℃的酒精溶液中，使之漂浮在酒精液面上[12]1.4冰核细菌的鉴定1.4.1菌落形态观察将冰核细菌接种在NA培养基上，在24℃下培养72h后观察菌落的形态特征，包括形状、大小、透明度、边缘和表面隆起等。
1.4.2菌体形态特征观察新鲜培养菌体进行革兰氏染色，以枯草芽孢杆菌为对照，在普通光学显微镜下观察革兰氏反应结果，是否有芽孢，细胞的形态、大小等。
1.4.3常规生理生化鉴定参照东秀珠等（2001）编著的《常见细菌系统鉴定手册》[13]对菌株进行葡萄糖发酵，运动性，接触酶，氧化酶，硝酸盐，苯丙氨酸脱氨酶，H22结果与分析2.1细菌分离从13种霜冻害植物样品中共分离到细菌菌株89个。
经冰核活性测定后，有18个菌株表现出具有冰核活性，其中3个冰核活性强，冻滴率100%。
S，生长温度等测定试验。
参比菌株为大肠杆菌。
2.2冰核细菌鉴定对冰核活性强的3个菌株进行了鉴定。
2.2.1培养性状3个菌株均能在20℃KB培养基上生长，2~3天长出肉眼可见菌落，4天后逐步表现出菌落的基本特征。
菌落培养特征见表1。
2.2.2生理生化特征3个菌株革兰氏染色均为阴性，菌体杆状，无芽孢。
菌株BH-2-3发酵型，能运动，氧化酶阴性，接触酶阳性，葡萄糖产气，硝酸盐还原阴性，苯丙氨酸脱氨酶阳性，不产生H2S，5℃能生长，40℃能生长。
菌株BH-7-1发酵型，能运动，氧化酶阴性，接触酶阳性，葡萄糖产气，硝酸盐还原阴性，苯丙氨酸脱氨酶阴性，不产生H2菌株BH-13-5非发酵型，能运动，氧化酶阳性，接触酶阳性，葡萄糖产气阴性，还原硝酸盐，苯丙氨酸脱氨酶阳性，不产生HS，5℃能生长，40℃能生长。
2表1冰核细菌菌落形态特征S，5℃能生长，40℃不能生长。
菌株菌落形态隆起形状直径㎜颜色质地边缘KB产荧光水溶色素BH-2-3圆形中央突起2~4蜜黄致密不透明整齐--BH-7-1近圆形扁圆8~12黄粘稠不透明不整齐--BH-13-5圆形平隆2~4乳白湿润半透明整齐＋-2.2.3菌株初步鉴定3个菌株的主要生理生化特征的比较见表2。
参照《常见细菌系统鉴定手册》[13]菌株BH-2-3和BH-7-1初步鉴定为肠杆菌科欧文氏菌属不同种，菌2012年第2期孙晓棠等：南昌地区蔬菜冰核活性细菌分离鉴定171株BH-13-5初步鉴定为假单胞菌属。
还有待进一步鉴定。
表23个菌株与2个已知对照菌株表型特征的比较表型特征BH-2-3BH-7-1BH-13-5大肠杆菌革兰氏染色----有无芽孢----菌体形状杆状杆状杆状杆状菌落颜色蜜黄黄乳白黄KB产荧光--+/水溶色素----葡萄糖发酵++-+葡萄糖产气----氧化酶--+-接触酶++++运动++++硝酸盐还原--+-淀粉水解----H2-S---苯丙氨酸脱氨酶+-+-生长温度5℃+++-生长温度40℃++-+ +：阳性；-：阴性3讨论江西处于北回归线附近，全省气候温暖，日照充足，雨量充沛，无霜期长，为亚热带湿润气候，十分有利于农作物生长。
春季回暖较早，但天气易变，乍暖乍寒，易造成霜冻害。
近年来气温升降异常，受霜冻灾害影响，江西部分地区农作物受灾严重，赣南脐橙、蔬菜育苗、茶叶等农作物直接经济损失每年20多亿元人民币。
据农业部门统计，2011年江西全省果树受冻面积420万亩，预计减产40万吨，直接经济损失超过8亿元人民币。
随着江西现代化建设步伐的加快，以及全球气候变化不稳定性的加剧，霜冻害已成为我省一种严重的自然灾害。
研究发现冰核细菌是诱发和加重农作物霜冻的重要因素。
目前江西省在植物冰和细菌方面的研究还未见报道，为了更好的开展霜冻害的防治工作，本研究就南昌地区蔬菜冰核细菌的种类进行调查研究。
作者从南昌市周围4个县市采集到了13种受霜冻害植物样品，共分离到89株细菌，其中有18个菌株具有冰核活性，3株细菌的冰核活性很高，冻滴率为100%。
经革兰氏染色、形态培养特征观察和生理生化试验，将菌株BH-2-3和BH-7-1初步鉴定为肠杆菌科欧文氏菌属不同种，菌株BH-13-5初步鉴定为假单胞菌属。
就本实验分离结果来看，冰核活性强的主要是欧文氏菌属和假单胞菌属的细菌，这与我国南方冰核细菌的种类基本一致。
然而分离到的种类和数量偏少，可能与分离的时间与分离的地点相对集中有关。
本试验结果为南昌地区蔬菜霜冻害的防治工作提供了一定的理论依据。
参考文献：[1]孙福在.我国生物冰核研究进展[J].中国农业科学,1996,29(5):62-68.[2]冯玉香.黄瓜霜冻与冰核活性细菌的关系[J].园艺学报,1990,17(3):211-216.[3]刘建华,陶毓汾,何维勋,等.冰核活性细菌与玉米和大豆霜冻害关系[J].中国农业气象,1990,11(1):1-5.[4]孙福在,赵廷昌,杨建民,等.杏树上冰核细菌种类及其冰核活性与杏花霜冻关系研究[J].中国农业科学,2000, 33(6):50-58.[5]Lindow S E.Erwinia herbicola:a bacteria ice nucleusactive in increasing frost injury to corn[J].Phytopathology, 1978,68:523-527.[6]Lindow S E.Relationship between ice nucleation frequencyof bacteria and forst injury[J].Plant Physiolo,1982,70: 1090-1093.[7]孙福在,朱红,何礼远.我国植物上冰核细菌种类鉴定[J].自然科学进展,1994,4(4):449-556.[8]孙福在,韦建福.我国冰核活性细菌的优势种群调查与研究[J].中国农业科学,1991,24(3):57-64.[9]Goto M,Goto T.Identification of ice Nucleation-ActiveBacteria Isolated from Frost-Damaged Vegetable Leaves [J].Ann phytopath Soc Japan,1989,55:3340-3351. [10]孙福在,何礼远.冰核细菌与植物霜冻研究概况[J].植物保护,1989,15(4):41-43.[11]后腾正失.野菜分离冰核活性细菌分类学研究[J].日本植物病理学报,1988,54(2):189-197.[12]韦建福.云南冰核活性细菌的鉴定、种类、分布及防霜新技术研究[D].云南农业大学，1994.[13]东秀珠,蔡妙英.常见细菌体统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001,1-419.。