细胞色素P450nor在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化
人源细胞色素C在大肠杆菌中的重组表达和分离纯化
１５００
Ｏ Ｏ
５
１０
（ｍ１）
围３细胞色素ｃ在ｐＨ ８．Ｏ条件下的层析围
Ｃｈｒ帅ａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｆｔｇ ３
ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｕｎｄｅｒ ｐＨ ｄ．Ｏ
万方数据
圈４不同ｐＨ条件（５．４，７．５·８．Ｏ）下纯化的细胞色素Ｃ Ｆｉｇ ４ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｕｎｄｅｒ ｐＨ５．４（Ｉａｎｅ １），
万方数据
万方数据
生物医学工程学杂志
第２４卷
或含血红素蛋白的底物‘８３检测。取１０弘ｌ不同浓度的 蛋白加入９６孔板中，再加入１００肛ｌ ＴＭＢ显色液， ３７℃孵育１０ ｍｉｎ，５０ ｐｌ １ Ｍ Ｈ２ＳＯ．终止反应，然后 于４５０ｎｍ测定吸收值。以溶于相同缓冲液中的牛血 清白蛋白为对照。
３结 果
２ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｐ∞ｉａ Ｃｏｍｍｉｔｔ％Ｐｌｌａｒｍａｃｏｐｏｅｉ矗ｏｆ Ｔｈｅ Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ ＲｅｐｕｂＩｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ。２０００．Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｐｒｅ３ｓ，２０００ｔ４４１．４４３［国家药典委员会编．中华人民共和国药 典．第二部．北京ｔ化学工业出版社．２０００．。４４ｌ－４４３］
由于细胞色素Ｃ的等电点较高，用阳离子交换 分别为５．４，７．５和８．Ｏ时，获得样品的Ａ。。咖／２８咖
纯化是比较好的方法。但是，从图２ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ的 的比值分别为１．９４６，３．３４１和３．６３７。如图４所示，
结果可以看出，经过一次离子交换柱后的细胞色素
用Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ软件（Ｂｉｏ—Ｒａｄ）对电泳图谱进行分
交换的方法分开。虽然从电泳图谱上无法分辨用溶 菌酶破菌后获得的蛋白与另两组有明显差异，但从 获得样品Ａ。。嘶／Ａ。。嘶的比值来看，直接超声破碎和 冻融联合超声破碎组相近，分别为１．５９和１．６７；而 溶菌酶破菌组的比值为１．１２，明显比前两组低。这 表明用溶菌酶处理的样品中含有的杂蛋白多，可能 是因为残留了部分溶菌酶所致。
抗肿瘤新药一豹蛙酶在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化化
抗肿瘤新药一豹蛙酶微生物与生化药学（医）王娜108120105/12/2011随着医学的进步，普通传染病逐渐被控制，恶性肿瘤(癌症)成为目前最为常见且严重威胁人类生命和生活质量的主要疾病之一。
抗肿瘤药物市场近年来呈逐年增长的势头，目前占世界药品市场总销售额的4．2％左右。
份额虽小，但进入20世纪90年代以来，由于肿瘤病人的总体增加趋势和肿瘤发病者的年轻化趋势，临床上对于新型肿瘤治疗药的需求量急剧上升。
豹蛙酶是一种抗肿瘤药物，属于核糖核酸酶A超家族，它的核糖核酸酶活性低，细胞毒性较强，在体内外对多种肿瘤具有显著杀伤作用，是目前全球正在重点研究的100种新药之一。
豹蛙酶英文名称为onconase，最早分离自北极豹蛙的卵母细胞和早期胚胎，属于核糖核酸酶A超家族。
1988年Mikulski等发现蛋白经过纯化和粗提，在体外能有效地抑制人下颚癌细胞株A-253、人白血病细胞HL-60和人腺癌细胞株Colo 320等的生长并能杀死细胞，通过体内实验进一步证明了其抗肿瘤活性，同时并显示出时间剂量依赖效应。
1991年Aldelt等测出了它的全序列，并根据oneology和ribonuelease将其命名为onconase。
1994年Merlino等用1.7AX 射线对其三维结构做了准确的描述，其结构和性质均类似于天然蛋白质。
从1996到2004年Alfacell公司相继开展了豹蛙酶对肺小细胞肺癌、恶性间皮瘤、乳腺癌、胰腺癌、肾癌等临床研究，其中对恶性间皮瘤疗效显著，且副作用小。
一、豹蛙酶抗肿瘤作用机制与细胞膜表面受体结合转入细胞质，破坏细胞膜的整体性，降解胞质中高分子rRNA，抑制蛋白质合成导致减缓细胞增殖和细胞凋亡是豹蛙酶细胞毒性的基本机制，这在目前所有上市药物中是独一无二的。
豹蛙酶与细胞膜受体结合，通过内吞作用转入细胞质，同时破坏细胞膜的整体性，这一过程需要三磷酸腺苷(ATP)，是豹蛙酶细胞毒性作用的关键步骤。
利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在Sf9细胞中表达真菌细胞色素P450nor
’ DE< P5H5I5K<K G;**<6H&M &+KH N%*< HE56
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细胞色素P450酶代谢产物的分离与鉴定
细胞色素P450酶代谢产物的分离与鉴定
细胞色素P450酶是机体内重要的一类氧化酶，参与很多内源
性和外源性物质的代谢和解毒。
其主要作用是催化体内代谢物与
外界有害物质之间的化学反应，使这些物质在体内的水平得以控
制和调节。
然而，细胞色素P450酶在体内的代谢产物往往难以分
离和鉴定，这使得该领域的研究备受关注。
分离技术
细胞色素P450酶代谢产物的分离技术是研究该领域的重要方
法之一。
近年来，高效液相色谱（HPLC）技术在该领域中得到广
泛的应用。
该技术可以将复杂的混合液体分离出各自的分子成分，减小分析物在分离过程中的相互干扰，提高鉴定的准确性。
此外，毛细管电泳也是一种常用的分离技术，该技术通过电泳力的作用，将混合物分离成各自的组成部分。
鉴定技术
细胞色素P450酶代谢产物的鉴定技术也是该领域的重要研究
方向。
较为常见的鉴定方法有质谱分析、核磁共振（NMR）技术
等。
质谱分析技术是一种通过测量样品中化合物的质量分子比，
来对化学成分进行鉴定的方法。
该技术具有高度灵敏性和分辨率，能够分析非常广泛的分子量区间。
NMR技术是另一种常用的鉴定技术，它通过测量核磁共振信
号来对样品的成分进行鉴定。
该技术对于小分子的谱线特别清晰，可以对等体、环境等作出高度区分。
总结
细胞色素P450酶代谢产物的分离和鉴定是该领域中的一项重
要研究内容。
随着科学技术不断的发展，人们不断地开发出更高效、更快捷、更准确的方法来进行该领域的研究。
未来，我们也
期待更多优秀的研究成果的出现，以推动该领域的不断发展。
产绿原酸内生菌细胞色素P450基因的克隆和功能研究
产绿原酸内生菌细胞色素P450基因的克隆和功能研究王川;李丽;魏丕伟;黄非【摘要】Based on a chlorogenic acid-producing endophytic Bacillus subtilis,cloning and function of a key gene in the synthetic pathway of chlorogenic acid was studied. The cytochrome P450 gene of the endophyte was cloned and expressed in prokaryotic vector,and the cinnamate 4-hydroxylase(C4H)activity of the recombinant proteins were determined. Four cytochrome P450 genes were cloned and expressed in prokaryotic vector,and the recombinant protein P-4 presented C4H activity. The coumarate produced by the C4H activity was the same as the result measured by LC-MS. The activity of P-4 existed in a broad optimal temperature and was inhibited by product coumarate. It is supposed that,taking cytochrome P450 as isozyme of C4H,the endophyte led the product coumarate to the synthetic pathway of chlorogenic acid.%以一株产绿原酸的内生枯草芽孢杆菌为基础，对其绿原酸途径的关键酶基因进行克隆和功能研究。
植物细胞色素P450基因的克隆策略及鉴定方法
细胞色素P450酶及其代谢途径的研究和应用论文素材
细胞色素P450酶及其代谢途径的研究和应用论文素材细胞色素P450酶及其代谢途径的研究和应用细胞色素P450酶是一类催化氧化还原反应的重要酶，在生物体内广泛存在，并参与多种生物代谢过程。
本文将围绕细胞色素P450酶及其代谢途径的研究和应用展开探讨。
一、细胞色素P450酶的概述细胞色素P450酶是一类存在于生物体内的酶家族，其命名源自其与二氧化碳结合时的吸收谱峰位于450纳米。
这类酶主要负责催化机体中的内源性和外源性物质的氧化反应，参与许多生物代谢途径以及药物、毒物的转化。
1. 结构与分类细胞色素P450酶结构包括一个蛋白质部分和一个辅助还原酶（如NADPH-P450还原酶）部分。
根据基因的相似性和功能的差异，细胞色素P450酶家族可分为多个亚家族，如CYP1、CYP2、CYP3等。
2. 功能与生理作用细胞色素P450酶在机体内发挥多种重要的生理作用。
例如，在肝脏中，细胞色素P450酶参与体内多种内源性物质（如激素、胆固醇等）的合成和代谢；在肠道中，细胞色素P450酶参与有毒物质的代谢和解毒作用。
二、细胞色素P450酶的代谢途径研究细胞色素P450酶的代谢途径研究对于揭示物质在机体内的代谢过程具有重要意义，其理论和实验研究为药物研发、毒理学评价等领域提供了重要依据。
1. 药物代谢途径研究细胞色素P450酶是药物代谢的重要参与者，在药物研发中的代谢动力学评价中具有重要意义。
通过研究药物在机体内的代谢途径以及细胞色素P450酶的参与情况，可以评估药物的安全性和代谢特性，并为合理用药提供依据。
2. 毒物代谢途径研究细胞色素P450酶在毒物代谢过程中发挥着重要的作用。
通过研究细胞色素P450酶与毒物之间的相互作用，可以揭示毒物的代谢途径和转化产物，进而评估毒物的危害性和毒性机制。
三、细胞色素P450酶在应用中的意义细胞色素P450酶的研究不仅对于基础科学具有重要意义，还在药物研发、毒理学评价等应用方面有着广泛的应用。
细胞色素P450酶的结构与功能
细胞色素P450酶的结构与功能细胞色素P450酶是一类具有重要生物学功能的酶，其结构和功能备受科学家关注。
在本文中，我们将会主要探讨细胞色素P450酶的结构与功能，并了解其在生物体内的作用。
一、细胞色素P450酶的结构细胞色素P450酶是一类具有高度保守性的蛋白质，在不同类群中具有相似的结构。
其基本结构为单个多肽链，分子量在40000-60000之间，通常由500个氨基酸组成。
蛋白质中有两个重要的部位：色团（heme）和多肽链（apoprotein）。
色团通常与多肽链结合，形成酶的活性部位。
它是一种含有铁离子的分子，对于细胞色素P450酶的催化活性具有重要作用。
多肽链归属于膜蛋白，尤其是内质网膜蛋白，在膜上具有定位的作用。
它是细胞色素P450酶中最重要的结构要素。
二、细胞色素P450酶的功能细胞色素P450酶可在许多生理和生化过程中发挥重要的催化作用。
它参与产生和代谢各种生物大分子，如内源性激素，脂肪酸，生长因子，以及药物等。
许多临床药物如阿司匹林，四环素，苯妥英和二氢麻酮等都是由细胞色素P450酶代谢。
这类药物进入体内后，常常会被细胞色素P450酶检测和代谢。
如果人体内存在一定的细胞色素P450酶酶活性，则这些药物会被更快的代谢并排出体外。
否则，这些药物就会潴留在体内，引发副作用。
在高级生物体内，细胞色素P450酶还与许多代谢过程密切相关。
例如，它与胆固醇代谢，类固醇合成和代谢，酚在哺乳动物体内的代谢等方面密切相关。
三、细胞色素P450酶的分类细胞色素P450酶可在不同的细胞和组织中表现不同的活性。
因此，它们被分类为家族和亚家族。
目前，已知超过50个细胞色素P450家族和数百个亚家族。
举个例子，CYP1家族成员参与代谢许多环境污染物和药物，包括多氯联苯，二噁英和苯酚等；CYP2家族成员则是药物代谢中最为重要的一类，如CYP2C9和CYP2D6可代谢广谱的药物，例如华法林和酚妥拉明等。
另外，CYP3家族成员则广泛参与酒精和药物的代谢等。
一种功能性表达细胞色素P450酶的方法及其应用[发明专利]
专利名称：一种功能性表达细胞色素P450酶的方法及其应用专利类型：发明专利
发明人：李洁,李宜奎,汪仁,李杨,徐晟,周正雄
申请号：CN202210263908.6
申请日：20220315
公开号：CN114672505A
公开日：
20220628
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种功能性表达细胞色素P450酶的方法及其应用，属于生物技术领域。
本发明所公开的功能性表达细胞色素P450酶的方法是(1)一种模块化的表达系统，易于调节；(2)具有更高的生物合成效率；(3)适用于植物、动物来源的细胞色素P450酶，进行天然产物、异源物质及其代谢物的生物转化与生物合成。
因此，本发明具有极高的应用价值。
申请人：江苏省中国科学院植物研究所
地址：211225 江苏省南京市溧水县白马镇国家农业科技园江苏省中国科学院植物研究所基地国籍：CN
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细胞色素P450nor在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化
用 Ｎ— Ｔ 亲 和层 析 柱 纯化 ， 到 了单 一 的 目的 条 带 。 ｉ Ａ Ｎ 得
关键词 ： 细胞 色素 Ｐ ５ ｎｒ克隆 ； ４ ０ ｏ； 表达 ； 大肠杆 菌
中图 分 类 号 ： ５３ Ｑ ８ Ｑ ０ ； ７ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ８— ６２ ２ １ ）４— ０ ５— ３ １０ ９ ３ （０ ０ ｏ ０ ０ ０
第２ ７卷第 ４期
２１ ０ ０年 ８月
生 物 学 杂 志
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收稿日期：2009－03－20；修回日期：2009－05－31基金项目：国家自然科学基金（No．30170011）作者简介：陈舒丽（1980－），女，硕士；通讯作者：罗德生（1950－），男，教授，E-mail ：jxa12419@126．com 。
doiʒ10.3969/j．issn．1008－9632．2010.04．005细胞色素P450nor 在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化陈舒丽1，刘德立2，蔡朝晖3，刘汉才1，罗德生1（1．咸宁学院基础医学院，湖北咸宁437100；2．华中师范大学生命科学学院，湖北武汉410079；3．咸宁学院化学与生命科学学院，湖北咸宁437100）摘要：研究改造了原有的未能高效表达的重组表达载体pRSET-p450nor ，通过PCR 方法，去除了P450nor 起始密码子ATG 上游的59个碱基序列。
将真菌细胞色素P450nor 基因首先克隆至克隆载体pBluescript II 上，然后亚克隆到高效表达载体pET-28上，得到了重组表达载体pET-p450nor 。
该基因在30ħ、0.1mM IPTG 诱导下在大肠杆菌中获得高效表达融合蛋白His-P450nor 。
SDS-PAGE 蛋白电泳表明在45kD 处出现强特异性带。
将大量表达的重组蛋白用Ni-NTA 亲和层析柱纯化，得到了单一的目的条带。
关键词：细胞色素P450nor ；克隆；表达；大肠杆菌中图分类号：Q503；Q78文献标识码：A文章编号：1008－9632（2010）04－0005－03Cloning expression and purification of cytochrome P 450nor in Escherichia coliCHEN Shu-li 1，LIU De-li 2，CAI Zhao-hui 3，LIU Han-cai 1，LUO De-sheng 1（1．Basis medical college ，Xianning College ，Xianning 437100；2．College of Life Science ，Huazhong Normal University ，Wuhan 430079；3．College of Chemistry and life Science ，Xianning College ，Xianning 437100，China ）Abstract ：P450nor gene was amplified by PCR using previously constucted pRSET-p450nor as template．59bp of the upstream se-quence of P450nor gene was deleted．The recombinant plasmid pBlue-p450nor was constructed by inserting PCR fragment ，i．e．P450nor gene ，into cloning vector pBluescript II．Then the P450nor gene from pBlue-p450nor was sub-cloned into the prokaryotic ex-pression vector pET-28to construct recombinant expression plasmids pET-p450nor．The pET-p450nor was transformed into Escherichia coli BL21．The expression level of recombinant protein His-P450nor was high at 30ħafter 0.1mM IPTG inducing．SDS-PAGE analy-sis showed a specific band （about 45kD ）．It indicated that the target protein was expressed successfully．The over-expressed cyto-chrome P450nor was purified to electrophoretic homogeneity by the facilitation of metal （Ni 2+）chelate affinity chromatography．A sin-gle band ，about 45kD ，was detected．Keywords ：cytochrome P450nor ；cloning ；over-expression ；purification细胞色素P450是一类能与CO 结合，形成的复合物在450nm 附近有最大吸收峰的血红蛋白的总称［1］。
已经发现的细胞色素P450超过3000种，从细菌到高等动、植物都普遍存在这种蛋白［2］。
它可催化多种生化反应，在外源性和内源性化合物代谢中起着非常重要的作用［3］。
细胞色素P450nor 是一类独特的细胞色素P450，虽然它属于P450超家族，但没有单加氧酶活性［4］。
它在真菌反硝化中起着NO 还原酶的作用，能以NAD （P ）H 为直接电子供体将NO 还原成N 2O ［5］。
其催化机制如下：2NO +NAD （P ）H +H +→N 2O +NAD （P ）++H 2O 。
反硝化在大气氮循环中起着重要的作用［6］，可去除污水中的硝酸盐或亚硝酸盐，使其转变为N 2或N 2O 。
细胞色素P450nor 在真菌的反硝化中起着重要的作用，所以研究细胞色素P450nor ，对污水的治理将有非常重要的价值。
虽然已有5种真菌细胞色素P450nor 被克隆和测序［7－8］，但重组细胞色素P450nor 却一直未能高效表达。
这就极大地限制了对细胞色素5P450nor作用机理以及酶结构与功能的研究。
本研究改造了原来构建的未能高效表达的表达载体pRSET-p450nor，去除了P450nor基因上游59个碱基序列，并利用高效表达载体pET-28在大肠杆菌中构建了重组细胞色素pET-p450nor，为细胞色素P450nor的高效表达和分离纯化奠定了良好的基础。
1材料与方法1．1材料1．1．1菌株与质粒大肠杆菌TG1、BL21，质粒载体pBluescriptⅡ，pET-28a，均由本室保存。
1．1．2工具酶及主要试剂DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶均为TaKaRa公司产品。
DNA Marker及低分子量蛋白质标准购于华美生物工程公司。
1．2方法1．2．1细胞色素P450nor的克隆PCR方法扩增细胞色素P450nor片段。
根据P450nor核苷酸序列设计引物，P450nor基因核苷酸序列及编码蛋白质序列见GenBank，登记号为：D78512。
引物序列为：P1：5'CGGGATCCATGCACGCTACCGAAGACGA3'；P2：5'CCCAAGCTTGCCATCTGTCATCCATCTACCA3'。
下划线部分为酶切位点，分别是：Bam HI和Hin dIII。
反应程序为：95ħ加热预变性5min后，95ħ变性30s，55ħ退火30s，72ħ延伸1min，30个循环，72ħ延伸10min，4ħ保温。
1．2．2蛋白质的原核表达将含有重组表达质粒pET-p450nor的大肠杆菌单菌落接种到5mL含相应抗生素的LB培养基上，37ħ培养过夜。
然后以1ʒ100稀释到新鲜的培养基中，培养约2h使其OD600值约为0.6，加IPTG至终浓度为0.1mM，在30ħ诱导不同时间取出制样，SDS-PAGE检测表达结果。
1．2．3目的蛋白的大量制备将含有重组表达质粒的大肠杆菌单菌落接种到5mL含相应抗生素的LB培养基中，37ħ培养过夜。
按1ʒ100体积比将过夜培养物转移至200mL新鲜培养基中，培养2 4h，待OD600值达0.6时，加入IPTG（终浓度为0.1mM），30ħ诱导培养8h。
4000r/min离心30min收集菌体，用10mL裂解缓冲液重悬菌体。
冰浴中超声破碎，13000r/min离心30min，取上清保存备用。
1．2．4Ni-NTA亲和层析柱分离纯化蛋白质用10倍体积的H2O和10倍体积的裂解缓冲液依次平衡Ni-NTA树脂。
取10mL超声波上清液上样，待流尽后加入15mL漂洗缓冲液漂洗杂蛋白，最后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，用EP管分步收集。
SDS-PAGE电泳检测。
2实验结果2．1重组质粒pBlue-p450nor的构建和鉴定。
2．1．1细胞色素P450nor的克隆以pRSET－p450nor为模板，PCR扩增细胞色素P450nor基因。
PCR产物检测结果见图1。
图1PCR产物电泳图Fig1Product of PCR1：PCR产物；2：Marker图2pBlue－p450nor的酶切鉴定Fig2Analysis of pBlue-p450nor1：Marker；2：pBlue－p450nor；3：BamHⅠ/HindⅢ双酶切pBlue－p450nor；4：HindⅢ单酶切pBlue－p450nor2．1．2重组质粒pBlue-p450nor的构建和鉴定限制性内切酶Bam HⅠ/Hin dⅢ双酶消化回收的PCR产物，将p450nor基因片段克隆到载体pBluescript构建成重组克隆载体pBlue-p450nor。
构建的重组质粒pBlue-p450nor转化大肠杆菌TG1，用Amp平板筛选阳性克隆，提取重组质粒DNA。
用Bam HⅠ/Hin dⅢ双酶消化重组pBlue-p450nor，有一外源片段放出，且大小与p450nor基因相等，约1．3kb。
证明重组质粒pBlue-p450nor构建成功（见图2）。
图3pET－p450nor的酶切鉴定Fig3Analysis of pET-p450nor1：pET－p450nor；2：BamHⅠ/HindⅢ双酶切pET－p450nor；3：HindⅢ单酶切鉴定pET－p450nor；4：Marker图4P450nor蛋白的SDS－PAGE分析Fig4Analysis of pET-p450nor by SDS PAGE1：BL21；2：E．coli pET－p450nor IPTG未诱导；3：E．coli pET－p450nor IPTG诱导2h；4：E．coli pET－p450nor IPTG诱导4h；5：E．coli pET－p450nor IPTG诱导6h；6：E．coli pET－p450nor IPTG诱导8h；7：Marker62．2重组表达质粒pET-p450nor 的构建和鉴定限制性内切酶Bam H Ⅰ/Hin d Ⅲ双酶消化pBlue-p450nor ，回收P450nor 基因片段，将P450nor 基因片段亚克隆到表达载体pET-28，构建重组表达载体pET-p450nor 。