哺乳动物细胞分离纯化
实验一-哺乳动物基因组DNA的提取及纯化
二、实验原理 基因组DNA的特性：分子量较大、易断
如何保证DNA分子的完整性
DNA抽提思路：
破碎组织细胞 去除细胞内杂质
匀浆或液氮研磨 蛋白、多糖、脂类、RNA和小分子物质
所提取的DNA片段的大小：100 ～150kb
纯化DNA
、实验原理
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
鲁东大学 生命科学学院 四、操作步骤
基因组DNA的提取：
School of Life Sciences
0.1g猪肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎 转入玻璃匀浆器中，加入1mL匀浆液，匀浆至无组织块（冰上操作） 将匀浆液转入1.5 mL小指管， 加入蛋白酶K20 uL（20mg/mL），颠倒混匀 650C 恒温水浴锅中水浴30min 12000rpm，离心5min，取上清移入另一离心管
超净台中干燥后加 100～200uL TE, 40C溶解过夜，-200C保存 （可进一步通过凝胶电泳检测所获取基因组DNA质量）
鲁东大学 生命科学学院
五、注意事项
1.肝的处理时间不宜过长；
School of Life Sciences
2.加入细胞裂解液前，细胞需均匀分散，以减少DNA团块形成； 3.提取的DNA不宜过分干燥，否则会导致DNA溶解困难。
DNA纯化
加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置10min 40C，12000rpm离心10min，用扩口枪头取出上清
鲁东大学 生命科学学院
School of Life Sciences
上清加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀 40C,12000rpm，离心10min，用扩口枪头取上清 上清加1/10体积的3mol/L NaAc（pH5.2)和加2倍体积的无水乙醇 慢慢混匀，-200C静置20min 12000rpm离心10min，弃上清 沉淀用1mL 70%冷乙醇洗两次，每次12000rpm离心10min，弃上清
《分子生物实验》教学课件：实验二 哺乳动物白细胞DNA分离
天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形 式存在于细胞核中。环绕着8个组蛋白构成核小体
从细胞中提取DNA 时，要先把DNP抽提出来，再把P除去， 再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等，从中分离DNA 。
DNA提取的几种方法
（1）水抽提法
利用核酸溶解于水的性质，将组织细胞破碎后，用低 盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分 溶解于水中，离心后收集上清液。在上清中加入固体 氯化钠调节至2.6M。加入2倍体积95%乙醇，立即用 搅拌法搅出。然后分别用66%、80%和95%乙醇以及 丙铜洗涤，最后在空气中干燥，既得DNA样品。此法 提取的DNA中蛋白质含量较高，故一般不用。为除蛋 白可将此法加以改良，在提取过程中加入SDS。
此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。
三、主要仪器及试材
实验器材：高速冷冻离心机，高压灭菌锅，离 心管，枪头，移液器，恒温水浴摇 床，冰箱等
试剂及作用
SDS（十二烷基硫酸钠）：溶解细胞膜上的脂类与 蛋白质，使细胞膜裂解，并解离细胞中的核蛋白， 使与DNA双链紧密结合的组蛋白分开和变性，破 坏蛋白质的二级和三级结构，使其容易被蛋白酶水 解。另外，还能与蛋白质结合而沉淀。
六、实验结果处理
提交“哺乳动物白细胞DNA分离”实验报 告（统一格式、纸张）
七、思考题
哺乳动物白细胞DNA分离的原理 及各种试剂的作用。
30μl左右至终浓度100μg/ml，10％SDS
150μl至终浓度0.5%，55℃水浴消化过夜
加入等体积的Tris.Cl饱和酚，轻轻 摇匀10-20min，10000g离心10min
转移上层水相至另一离心管中（重复此步骤一次）
加入等体积苯酚/ 氯仿/ 异戊醇（25: 24: 1），轻轻摇动10-20min以混匀
长白猪精原细胞的分离和纯化
1、实验动物
长白种系公猪，2月龄，由北京养猪中心苇沟现代化猪场提供。取活体睾丸，立即放入1640营养液中，待分离细胞。
2、主要试剂及材料
胶原酶（CLS，Sigma），胰蛋白酶（Sigma），脱氧核糖核酸酶（DNase,Promega），牛血清白蛋白（BSA，中国医学科学院天津血液研究所），胎牛血清（FBS，Gibco），RPMI 1640培养基（Gibco，临用前配制，加链霉素及青霉素至终浓度分别为100mg L及80IU ml，调pH至7 3），其他化学试剂均为国产分析纯。800ml容量的细胞沉降池（定做）。实验用金属及玻璃器皿用前均清洗干净并高压灭菌处理。
间质细胞和支持细胞在体外培养时容易贴壁。我们将BSA重力沉降分离后获得的精原细胞（其中少量的杂细胞主要为支持细胞，还有个别间质细胞）接种于培养瓶中，6~8h后，支持细胞和间质细胞贴壁生长而精原细胞仍呈悬浮状态。利用此选择性贴壁法可将精原细胞进一步纯化。收集悬浮精原细胞并经HE染色，在光学显微镜下任选5个视野，细胞纯度分别为93%、94%、96%、93%及95%，平均值为94.2%，高于沉降分离后91%的纯度。
5、细胞的沉降分离
固定沉降池并保持水平状态，池底下口周围加数十粒硅化玻璃珠。10mlPBS及10ml待分离的单细胞悬液按先后从底部下口载入沉降池。用1640培养液分别配制4%和2%的BSA溶液各250ml，同时分别倒入梯度发生器的两个容器中。梯度发生器出液口直接用橡胶软管连接于沉降池的底部尖嘴下口。打开活塞，调整流速，使BSA溶液以15ml min的速度从底部进入沉降池。最终沉降池内的液体从上而下形成2%~4%的BSA连续梯度。整个沉降系统4℃静置3h，以使细胞按不同大小在BSA连续梯度介质中通过自然重力沉降而分层。分层后的细胞溶液从沉降池底部下口用自动收集器收集，控制流速为5ml/min，10ml 管作为1份。1000r min离心10min，沉淀细胞，弃上清。细胞重悬于0.5ml含0 5%BSA的1640培养液中。将各管细胞分别滴片，HE染色，光学显微镜下检测细胞的形态结构特征及均一程度，以确定细胞的类型及纯度。合并同类细胞，取1滴细胞悬液，加10μl0.4%台盼蓝，计细胞总数及死亡细胞百分比。最后调整细胞浓度为106个/ml。滴片，染色。显微镜下任选5个视野，计算细胞纯度。
RNA的分离与纯化
RNA的分离与纯化包括Northern杂交在内的许多分子生物学实验均是以RNA为材料，mRNA的制备也需要一定质量的总RNA样品，RNA的数量、纯度与完整性将直接影响这些实验的结果。
RNA中rRNA的数量最多，占总量的80%～85%；tRNA及核内小分子RNA占15%～20%；mR NA仅占1%～5%。
由于各种rRNA、tRNA及核内小分子RNA的结构与功能已比较清楚，从基因克隆、表达与诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化，主要集中在总RNA 与mRNA上。
一、RNA制备的条件与环境为防止RNase对RNA 的水解，一要全力避免细胞外RNase的污染并抑制其活性，二要尽快地抑制细胞内RNase的活性并极力地去除RNase。
对广泛存在的细胞外RNase，应在RNA制备的全过程中保持高度的警惕，并采取严格的措施以避免其污染和抑制其活性。
从RNA提取的初始阶段开始，就选择性地使用针对RNase的蛋白质变性剂（如酚、氯仿等有机溶剂以及强烈的胍类变性剂）、蛋白的水解酶（如蛋白酶K）和能与蛋白质结合的阴离子去污剂（如SDS、sarkosyl或脱氧胆酸钠等）并联合使用RNase的特异性抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的水解。
另外，在变性液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）等还原剂可以破坏RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。
二、总RNA的分离与纯化由于RNase的影响，为获得完整的RNA分子，就必须在总RNA分离纯化的最初阶段，尽可能快地灭活胞内RNase的活性。
在β-巯基乙醇的协同作用下，高浓度的(异)硫氰酸胍可以极大极快地抑制RNase的活性，能从胰腺等富含RNase的组织细胞中分离出完整的RNA分子，目前已成为常规使用的试剂。
pH8.0的Tris饱和酚用于DNA的制备，但在RNA纯化时，应使用pH4.5～5.5的水饱和酸性酚，这既有利于DNA的变性又有利于RNA的分离。
第七八章-外源基因的表达及其优化策略20201112
略 稳定性 翻 译 的
培养基 环境因素对 受体菌生长 的影响
终止
诱导时间和
密码子
诱导剂量
的选择
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
一 、真核生物基因表达与调控的特点
一 、真核生物基因表达与调控的特点
二 、真核生物基因表达载体的组成特征
基因组DNA的存在形式可影响基因表达 原核DNA序列
转录与翻译不偶联
启动子
调控是多层次的 具有组织和细胞类型特异性
增强子 终止子 内含子 选择标记基因，
对信号分子反应不同
PloyA加尾信号
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
二、真核生物基因表达载体的组成特征
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
根据启动子的功能和作用方式不同，真核基因的表达载体 的启动子可以分为几种类型，每一种类型的优缺点是什么？ 三、真核表达的受体系统 按照宿主细胞的不同，常用外源基因的真核受体系统可大 致分为酵母、职务、昆虫和哺乳动物等受体系统。 每种受体的系统的特征如下表：
原核生物基因表达一般以操纵子为单位 启动子特征：作用要强；必须表现最低水平的基础转录活性；启动
子具有简便和廉价的可诱导性
原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原 特征：SD序列与起始密码子的间距对翻译起始效率影响较大；
核生物的启动子，催化所有RNA的合成 mRNA-rRNA的互补区域越长，基因翻译的概率越大；SD序列与起始
第八章 外源基因表达产物的分离纯化
四 、合适分离纯化介质的选择 1 、分离纯化蛋白质的材料 理想的蛋白质分离纯化应具有以下几个方面的性质： 对目标蛋白具有较高的分离效率；在分离纯化过程中不 会造成目标蛋白的变性；化学性能和机械性能稳定，重 复性好；价格低廉，成本低。
哺乳动物细胞分离纯化
金属螯合层析色谱
纯化示例
120KD 90KD 60KD 40KD 30KD
20KD
14KD
金属螯合层析色谱
纯化示例1
结合缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，pH7.4 洗脱缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4 样品： OTIG细胞培养上清 层析柱： Chelating (Ni2+) S Fast Flow
*蛋白A的分子结构
*典型的IgG结构
蛋白质A层析色谱
分离操作
结合缓冲液：20mM磷酸纳，pH7.0 洗脱缓冲液：100mM甘氨酸/100mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH3.0 中和缓冲液：1M Tris-HCl，pH9.0 1. 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 2. 用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 3. 上样，流速为0.5ml/min（1ml的柱子），收集流穿片段。 4. 用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合 物质都被冲洗出柱子（紫外检测器在280nm波长检测）。 5. 用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。洗脱液立即用中和缓冲液 （0.06ml~0.2ml 1M Tris-HCl，pH9.0每毫升馏分）中和至中性。 6. 立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子 。
表达位置对层析的影响
表达位置
分泌表达
优点
1. 样品预处理简单。 2. 预处理过程短不会引入外源性 内毒素，一般不会对目标蛋白 结构造成破坏。 3. 大量杂质留在细胞内，样品成 分相对纯净。
缺点
1. 某些蛋白可能会受到培养基 成分的影响。 2. 培养基营养成分未完全消耗， 长时间放置容易感染细菌。 3. 样品体积较大，需要较长的 浓缩时间。 需要细胞破碎，离心等处理。 细胞破碎过程中易引入外源 性内毒素，破碎过程比较剧 烈，可能会破坏蛋白质结构。 细胞破碎后释放较多杂质， 增大纯化难度。
Loading Buffer煮细胞抽提总蛋白Protocol mRNA的分离纯化
Loading Buffer煮细胞抽提总蛋白Protocol1.细胞计数（约1×106的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）；2.预冷1×PBS 500ul重悬洗一次，转至500ul EP管（2000rpm×5min）；3.去上清，后甩一次，将上清去尽；4.按每1×106的细胞加50ul loading buffer 加入2×loading；5.Vortex一下，煮10～15min一次×2～3次直至无粘丝；6.每次煮好将其放于冰上，静置约2min，Vortex一下，再甩一下；7.三次后用枪吸起，如没有粘丝，即可；8.每次上样约5ul（50ug/ul蛋白）RIPA裂解抽提总蛋白Protocol1.细胞计数（约1×107的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）；2.预冷1×PBS 1ml重悬洗2次，转至1.5ml EP管（2000rpm×5min）；3.去上清，后甩一次，将上清去尽；4.按照如下比例加入裂解试剂：RIPA：300ul/1×107细胞PMSF：3ul(1:100)Cocktail ：0.3ul(1:1000)5.吹打均匀，冰上放置30-40min，中间每10分钟Vortex一次；6.4℃预冷离心：10000rpm ×10min；7.收集上清，转移至已预冷新EP管，即为总蛋白。
【为了浓缩蛋白，加RIPA的量改为200ul或者更低，可稍微延长冰上裂解时间，而RIPA（1）＋PMSF（1：100）＋Cocktail（1：1000）的比例不变】核，浆蛋白抽提Protocol一.收核-浆蛋白收浆蛋白1.细胞计数（约1.5×107的细胞），离心收集细胞（1100rpm×5min）；2.用4℃预冷的PBS重悬，转至1.5mL的EP管中，离心（4000rpm×5min，4℃）；3.去上清，加入A Buffer1mL/1×107 cell，重悬，4℃放置10min，离心（2500rpm×3min，4℃）；4.去上清，加入A’ Buffer 250uL/1.5×107 cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×1min，4℃），吸取上清（上清是浆蛋白）；收核蛋白5.再用A’ Buffer 500uL/1.5×107 cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×1min，4℃），吸走上清，12000rpm×30sec，把上清完全吸干净；6.剩余沉淀中加入B’Buffer (或者RAPI)50uL，重悬（振荡），4℃放置40min（每隔10min振荡一次）；7.离心（12000×10min，4℃），取上清即为核蛋白，－80℃保存。
生物制药复习题（有答案）
生物制药复习题（有答案）《生物技术制药》习题（课后作业）一、下列概念：⑴生物制药：⑵生物药物：包括生物技术药物，天然生化药物，微生物药物，海洋药物和生物制品。
(3)生物技术制药：采用现代生物技术,借助某些微生物、植物、动物生产医药品。
(4)生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。
（5）现代生物技术：以现代生命科学为基础, 把生物体系与工程学技术有机结合在一起，按照预先的设计，定向地在不同水平上改造生物遗传性状或加工生物原料, 产生对人类有用的新产品(或达到某种目的)之综合性科学技术。
（6）基因表达：⒈转录：在RNA聚合酶的催化下以DNA为模板合成mRNA的过程。
2、翻译：以mRNA为模板,tRNA作为运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程（7）质粒的分裂不稳定：基因工程菌分裂时产生一定比例不含质粒的子代菌的现象,即重组分子从受体细胞中逃逸。
（8）质粒的结构不稳定：DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
重组DNA分子某一区域发生变异，导致表观生物学功能的丧失；（9）显微注射：显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。
经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。
（10）悬浮细胞：（11）补料分批培养：是指分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。
（12）连续培养行下去的一种培养方法。
（13）接触抑制：细胞在生长分裂时达到相互接触而停止分裂的现象,称为接触性抑制（14）单克隆抗体：由一个抗原决定簇刺激的、单一的B细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、高度均一的抗体。
（15）多克隆抗体：一种抗原具有多个抗原决定簇,每个抗原决定簇都能刺激一个B细胞产生一种抗体。
这样所获得的免疫血清是多种抗体的混和物。
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并且几乎不需要再次加载金属，如果是纯化用同样的HIS6标记的融合 蛋白。
金属螯合层析色谱
MK 120KD 90KD
培养上清 流穿样品 洗脱样品1 洗脱样品2
60KD
40KD 30KD 20KD
金属螯合层析色谱
纯化示例2
结合缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，pH7.4 洗脱缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4 样品： 2SXA细胞培养后细胞破碎 层析柱： Chelating (Ni2+) S Fast Flow
1
2
3
4
重力柱的应用
分离操作SOP
FC亲和标签实验流程 样品预处理： 20ml培养上清补加20mMPB，调pH至7.4. Buffer A：PBS, pH7.4 Buffer B：0.1M Glycine，pH3.0 Protein A填料载量比较低，1ml填料可以结合2mg左右FC标签蛋白，根据 表达量选用合适的Protein A亲和柱。（不可用NaOH来控内毒或者清洗） PBS平衡后上样，收集流出液。上样完毕，再用平衡液平衡亲和柱（尽可 能提高平衡体积，至少10ml）。平衡后用buffer B洗脱，分别收集洗脱液。 洗脱液的收集管预先加入一定量的1M Tris，pH9.0调节pH值，洗脱完成后 用Buffer A重新平衡柱子。 收集方法：0.2ml重力柱：每个梯度分开收集：0.2ml，0.8ml，0.5ml
3. 哺乳细胞表达的蛋白存在糖基化修饰问题，所以SDS-PAGE表观分子 量可能会偏大，或者有多条偏大的条带都有可能是目标蛋白，检测判 断时要注意辨别。
纯化示例
120KD 90KD 60KD 40KD 30KD 20KD
14KD
金属螯合层析色谱
纯化示例1
结合缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，pH7.4 洗脱缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4 样品： OTIG细胞培养上清 层析柱： Chelating (Ni2+) S Fast Flow
破碎上清 流穿样品 洗脱样品1 MK 洗脱样品2 洗脱样品3 洗脱样品4
120KD 90KD 60KD
40KD
30KD
20KD
14KD
金属螯合层析色谱
注意事项
1. 咪唑在280nm处有吸收，当监测吸光度时，需要以洗脱缓冲液作为空 白。
2. 在较低的pH值的条件下，金属离子的丢失是非常明显的。如果是对同 样的蛋白质进行纯化，在每次纯化之间没有必要将柱子剥离，进行 5~10次纯化后，需要对色谱柱进行剥离和再充电。
分离。
表达位置对层析的影响
表达位置 分泌表达
优点
缺点
1. 样品预处理简单。 2. 预处理过程短不会引入外源性
内毒素，一般不会对目标蛋白 结构造成破坏。 3. 大量杂质留在细胞内，样品成 分相对纯净。
Байду номын сангаас
1. 某些蛋白可能会受到培养基 成分的影响。
2. 培养基营养成分未完全消耗， 长时间放置容易感染细菌。
3. 对于一些抗体，比如小鼠IgG，当使用蛋白质A进行纯化时，可能需要 向结合缓冲液中加入3M的氯化钠，达到最有效的结合，例如1.5M的甘 氨酸和3M的氯化钠，pH为8.9。
4. 洗脱完成后，立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子避免柱子 保存在低pH的环境中。
金属螯合层析色谱
常用的亲和色谱层析：金属螯合层析（Chelating Sepharose Fast Flow） 原理：螯合的Sepharose，当带有Ni2+离子时，如果形成氨基酸残基的复 合物，特别是组氨酸残基被暴露在蛋白质表面时，可以选择性的结合蛋白 质。(His)6融合蛋白可以很容易的结合到亲和柱上，然后用含有咪唑的缓 冲液进行洗脱。
3. 样品体积较大，需要较长的 浓缩时间。
胞内表达
1. 样品可以选择合适的缓冲体系。1. 需要细胞破碎，离心等处理。
2. 完全去除培养基成分的影响， 2. 细胞破碎过程中易引入外源
可以保存较长时间。
性内毒素，破碎过程比较剧
3. 细胞破碎后体积较小，回收时
烈，可能会破坏蛋白质结构。
间短。
3. 细胞破碎后释放较多杂质，
物质都被冲洗出柱子（紫外检测器在280nm波长检测）。 5. 用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。洗脱液立即用中和缓冲液
（0.06ml~0.2ml 1M Tris-HCl，pH9.0每毫升馏分）中和至中性。 6. 立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子 。
蛋白质A层析色谱
纯化示例
结合缓冲液：PBS,pH7.4 洗脱缓冲液：0.1M Glycine,pH3.0 样品：ANTPD-A/ANTPD-B 层析柱：Protein A Sepharose Fast Flow
色谱层析
常用的色谱层析： 1. 免疫亲和色谱：蛋白质与特异性配基配对到色谱基质上，
且蛋白质与配基间具有可逆的相互作用。 2. 离子交换色谱：利用不同的蛋白质表面净电荷的差异进行
分离。 3. 疏水相互作用色谱：蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白质
与疏水层析介质疏表面可逆的相互作用来进行分离。 4. 凝胶过滤色谱：利用分子通过凝胶填料大小不同对其进行
*蛋白A的分子结构
*典型的IgG结构
蛋白质A层析色谱
分离操作
结合缓冲液：20mM磷酸纳，pH7.0 洗脱缓冲液：100mM甘氨酸/100mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH3.0 中和缓冲液：1M Tris-HCl，pH9.0 1. 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 2. 用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 3. 上样，流速为0.5ml/min（1ml的柱子），收集流穿片段。 4. 用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合
哺乳动物细胞分离纯化
纯化分离的目的
去除表达产物中非目的基因表达的杂蛋白以及非蛋白组分的 杂质，以得到单一条带的目的蛋白。 去除内毒素；蛋白酶；核酸等污染物。 浓缩目的蛋白至较高的浓度。 保存目的蛋白到合适的缓冲液中，去除对蛋白质功能或保存 有影响的试剂。
纯化的方法
原则：利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染， 而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。 常用方法： 1. 色谱层析 2. 沉淀 3. 透析 4. 电泳 5. 差速离心
细胞培养液 MK 流穿样品 洗脱样品 120KD 90KD 60KD
40KD
30KD
20KD
14KD
蛋白质A层析色谱
注意事项
1. 样品需要离心（10000g/20min）去除细胞和细胞碎片。离心下来的上 清经过一个0.45μm的滤膜过滤。
2. 来自多数物种的IgGs和亚类，在接近生理pH值和离子强度的条件下， 可以结合到蛋白质A上。如果蛋白质和配基之间的互相作用较弱，应 该避免过度冲洗，因为这样可能会减少最终的产量。
*组氨酸融合蛋白与Ni2+螯合后填料的结合示意
金属螯合层析色谱
分离操作
镍溶液：0.1M Ni2SO4 结合缓冲液：20mM磷酸纳，0.25M NaCl，pH7.4 洗脱缓冲液：20mM磷酸纳，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4 1. 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 2. 加入0.5个柱体积的0.1M Ni2SO4。 3. 用10倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 4. 上样，流速为1-4ml/min（1ml的柱子），收集流穿片段。 5. 用5~10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合
0.5ml重力柱：每个梯度分开收集：0.5ml，1.5ml，1ml
重力柱的应用
分离操作SOP
His亲和标签实验流程 样品预处理：20ml培养上清加入20mM PB,500mM NaCl调节pH至7.5。 Buffer A：20mM PB,500mM NaCl, pH7.5 Buffer B：20mM PB,500mM NaCl,500mM Imizadole,pH7.5 根据样品中含有目标蛋白的量来确定使用的His柱类型（理论上1mlHis填 料至少可以结合10mg蛋白）：通常20ml细胞液用0.2ml填料的重力柱，如 果目标表达很好，可以增加填料体积，或改用1ml预装柱。用buffer A平衡 缓冲液处理。上样，收集流出液。上样完毕，再用平衡buffer平衡柱子 （至少10ml）。平衡后用含有50mM、500mM的咪唑缓冲液洗脱，并分别 收集洗脱液。 收集方法：0.2ml重力柱：每个梯度分开收集：0.2ml，0.8ml，0.5ml
0.5ml重力柱：每个梯度分开收集：0.5ml，1.5ml，1ml
重力柱的应用
注意事项
1. 细胞项目进行重力柱实验时可能会同时进行多根，为避免弄混样品， 一定要做好相应标记，摆放重力柱和上样液以及相应收集液的顺序要 一一对应。每完成一个收集液，立即做好标记，以免收集液过多混肴。
2. 细胞项目多为亲和层析，为防止非特异性吸附，样品里一定要加入尽 可能高浓度的NaCl以提高洗脱纯度；同时上样后的平衡液要尽可能加 大平衡的体积，以便冲洗掉非特异性吸附的杂蛋白。
3. NaOH和Ni2SO4会反应发生沉淀，需注意剥离Ni离子后才能冲洗NaOH。
重力柱的应用
装柱和分离过程
1. 装入下筛板并用去离子水润洗空柱体。 2. 接好下堵头，取合适体积的填料并用移液器吹打均匀，加入空柱体。 3. 继续加入去离子水让填料沉降完全，装入上筛板。 4. 保持一定的液面高度，盖上盖子完成装柱。
增大纯化难度。
蛋白质A层析色谱
常用的亲和色谱层析：蛋白质A(Protein A Sepharose Fast Flow) 原理：蛋白质A来自金黄色葡萄球菌属，包含5个区域，可以用来结合 IgG的Fc区域。作为一个亲和配基，蛋白质A偶联到Sepharose上，使得这 些区域可以结合游离的IgG分子。一分子的蛋白质A可以至少结合两分子的 IgG。