哺乳动物细胞分离纯化
简述细胞培养一般步骤
简述细胞培养一般步骤
细胞培养一般包括以下步骤:
1. 准备工作:准备细胞培养所需的器材、设备、培养基等。
2. 细胞筛选:选择适合培养的细胞类型,如哺乳动物细胞、植物细胞等。
3. 细胞预处理:对细胞进行清洗、消毒、pH 值调整等预处理,使细胞处于适宜培养的状态。
4. 细胞接种:将预处理后的细胞导入培养皿或培养基中,并轻轻振动培养皿,使细胞均匀分布。
5. 维持细胞生长:通过控制温度、光照、营养供应等因素,维持培养环境的稳定性,促进细胞生长。
6. 培养和观察:将培养皿放入培养箱中,维持合适的培养条件,等待细胞生长和分裂。
通过观察细胞形态、增殖、分化等特性,可以确定细胞培养的效果。
7. 分离和纯化:通过离心、过滤等操作,将培养细胞分离出来,进行进一步处理和纯化,以便用于实验或生产。
细胞培养是一项复杂的过程,需要经过多次实验和调整,才能培养出符合要求的细胞。
实验一-哺乳动物基因组DNA的提取及纯化
二、实验原理 基因组DNA的特性：分子量较大、易断
如何保证DNA分子的完整性
DNA抽提思路：
破碎组织细胞 去除细胞内杂质
匀浆或液氮研磨 蛋白、多糖、脂类、RNA和小分子物质
所提取的DNA片段的大小：100 ～150kb
纯化DNA
、实验原理
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
鲁东大学 生命科学学院 四、操作步骤
基因组DNA的提取：
School of Life Sciences
0.1g猪肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎 转入玻璃匀浆器中，加入1mL匀浆液，匀浆至无组织块（冰上操作） 将匀浆液转入1.5 mL小指管， 加入蛋白酶K20 uL（20mg/mL），颠倒混匀 650C 恒温水浴锅中水浴30min 12000rpm，离心5min，取上清移入另一离心管
超净台中干燥后加 100～200uL TE, 40C溶解过夜，-200C保存 （可进一步通过凝胶电泳检测所获取基因组DNA质量）
鲁东大学 生命科学学院
五、注意事项
1.肝的处理时间不宜过长；
School of Life Sciences
2.加入细胞裂解液前，细胞需均匀分散，以减少DNA团块形成； 3.提取的DNA不宜过分干燥，否则会导致DNA溶解困难。
DNA纯化
加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置10min 40C，12000rpm离心10min，用扩口枪头取出上清
鲁东大学 生命科学学院
School of Life Sciences
上清加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀 40C,12000rpm，离心10min，用扩口枪头取上清 上清加1/10体积的3mol/L NaAc（pH5.2)和加2倍体积的无水乙醇 慢慢混匀，-200C静置20min 12000rpm离心10min，弃上清 沉淀用1mL 70%冷乙醇洗两次，每次12000rpm离心10min，弃上清
长白猪精原细胞的分离和纯化
1、实验动物
长白种系公猪，2月龄，由北京养猪中心苇沟现代化猪场提供。取活体睾丸，立即放入1640营养液中，待分离细胞。
2、主要试剂及材料
胶原酶（CLS，Sigma），胰蛋白酶（Sigma），脱氧核糖核酸酶（DNase,Promega），牛血清白蛋白（BSA，中国医学科学院天津血液研究所），胎牛血清（FBS，Gibco），RPMI 1640培养基（Gibco，临用前配制，加链霉素及青霉素至终浓度分别为100mg L及80IU ml，调pH至7 3），其他化学试剂均为国产分析纯。800ml容量的细胞沉降池（定做）。实验用金属及玻璃器皿用前均清洗干净并高压灭菌处理。
间质细胞和支持细胞在体外培养时容易贴壁。我们将BSA重力沉降分离后获得的精原细胞（其中少量的杂细胞主要为支持细胞，还有个别间质细胞）接种于培养瓶中，6~8h后，支持细胞和间质细胞贴壁生长而精原细胞仍呈悬浮状态。利用此选择性贴壁法可将精原细胞进一步纯化。收集悬浮精原细胞并经HE染色，在光学显微镜下任选5个视野，细胞纯度分别为93%、94%、96%、93%及95%，平均值为94.2%，高于沉降分离后91%的纯度。
5、细胞的沉降分离
固定沉降池并保持水平状态，池底下口周围加数十粒硅化玻璃珠。10mlPBS及10ml待分离的单细胞悬液按先后从底部下口载入沉降池。用1640培养液分别配制4%和2%的BSA溶液各250ml，同时分别倒入梯度发生器的两个容器中。梯度发生器出液口直接用橡胶软管连接于沉降池的底部尖嘴下口。打开活塞，调整流速，使BSA溶液以15ml min的速度从底部进入沉降池。最终沉降池内的液体从上而下形成2%~4%的BSA连续梯度。整个沉降系统4℃静置3h，以使细胞按不同大小在BSA连续梯度介质中通过自然重力沉降而分层。分层后的细胞溶液从沉降池底部下口用自动收集器收集，控制流速为5ml/min，10ml 管作为1份。1000r min离心10min，沉淀细胞，弃上清。细胞重悬于0.5ml含0 5%BSA的1640培养液中。将各管细胞分别滴片，HE染色，光学显微镜下检测细胞的形态结构特征及均一程度，以确定细胞的类型及纯度。合并同类细胞，取1滴细胞悬液，加10μl0.4%台盼蓝，计细胞总数及死亡细胞百分比。最后调整细胞浓度为106个/ml。滴片，染色。显微镜下任选5个视野，计算细胞纯度。
细胞培养技术中的细胞纯化和分离
细胞培养技术中的细胞纯化和分离随着生物技术和生物医学研究的不断发展，细胞培养技术也越来越成为一种重要的研究手段。
在进行细胞培养实验时，不仅需要在培养基中提供适宜的营养条件，还需要考虑如何保证细胞的纯度和分离。
因为如果细胞混合在一起，可能会对实验结果产生干扰，影响科学研究成果的准确性。
细胞纯化和分离技术的发展，为细胞培养实验提供了有力的支持。
一、细胞纯化技术所谓细胞纯化，即是指将同一类型的细胞从混合物中分离出来，获得纯种的细胞。
这种技术应用广泛，例如在干细胞研究中，需要将干细胞从其他细胞中纯化出来。
目前常用的细胞纯化技术主要有以下几种。
1.差速离心这种方法的原理是依靠细胞的不同沉降速度，在其它细胞和细胞碎片中分离出要纯化的细胞种类。
比如对于混合的细胞，进行差速离心后，重的细胞如肝细胞等就可以在离心管的底部沉淀下来；而轻的细胞比如造血干/祖细胞则可以在上层沉淀。
这种方法虽然方便快捷，但是由于离心速度的不同，有时会把不同的细胞类型离心到一个位置，分离效果并不理想。
2. 细胞排序技术细胞排序技术是一种可接受的方法。
这种方法利用一种叫做细胞分选仪（FACS）的设备来实现，FACS通过运用激光束可以捕捉到被染色的细胞，然后在细胞上打标签，这样细胞分选仪就能帮助实验人员将目标细胞分选出来。
不仅如此，FACS还可以根据设定的特定标记，为不同细胞类型分类和分选。
但是，这种方法价格昂贵，需要训练技能，限制了它的使用。
二、细胞分离技术与细胞纯化技术不同，细胞分离技术是将混合物中的不同细胞种类分离的过程。
这种技术在体外培养单一细胞的物种和组织研究中应用广泛。
1. 磁珠细胞分离技术这种技术广泛应用在制备纯化细胞的过程中。
基本原理是通过对细胞标记来实现磁性分离。
首先，将细胞和磁性珠以特定的方式结合在一起，对此进行特别处理，这样可以使细胞在磁场中受到磁力吸引。
然后，将细胞和磁珠贴附在磁性离心离心机上，以达到将细胞分离的目的。
生物学中的分离和纯化技术
生物学中的分离和纯化技术生物学是一门十分综合的学科，它囊括了生物在不同细胞和组织层次的多种结构和功能。
要研究具体的生物物质，必须进行分离和纯化，这是生物学研究中不可或缺的技术。
本文将对分离和纯化技术在生物学中的应用进行介绍和探讨。
一、离心分离技术离心分离技术是一种基于不同颗粒物质重量或密度差异的分离技术。
这种技术通常用于分离细胞和组织等样本中的细胞器、膜组分和其他分子。
例如，离心分离可以分离细胞中的线粒体、叶绿体和内质网等细胞器。
这种技术的原理是将细胞样本在离心机中离心，通过重力分离使得不同颗粒物质在不同的区域沉淀，从而实现分离。
二、电泳技术电泳技术是一种基于分子电荷和大小差异的分离技术。
这种技术通常用于分离和鉴定蛋白质和核酸等生物大分子。
例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将蛋白质按照分子大小和电荷进行分离。
这种技术的原理是将样本经过电泳，电荷带正的物质向负极移动，电荷带负的物质向正极移动，从而实现分离。
三、层析技术层析技术是一种基于分子相互作用的分离技术。
这种技术通常用于分离和纯化蛋白质、核酸等生物分子。
例如，离子交换层析可以将带电荷的分子与带相反电荷的分离柱上的离子进行竞争结合，从而实现分离。
这种技术的原理是将样品通过某些介质（如凝胶、树脂、硅胶等）让目标分子和其他分子之间相互作用，利用吸附性、离子交换、大小排异等原理进行分离和纯化。
四、亲和层析技术亲和层析技术是一种基于生物分子间特异性结合作用的分离技术。
这种技术通常用于分离和纯化某些具有特殊亲和力的生物分子，如酶、抗体、蛋白质、DNA等。
例如，亲和层析可以利用对应亲和物质如互补的DNA序列、配体、抗体来捕获目标分子。
这种技术的原理是利用生物分子之间特定的化学反应结合，在某些介质上捕获目标分子，从而实现分离和纯化。
五、过滤技术过滤技术是一种基于分子大小的分离技术。
这种技术通常用于分离和纯化蛋白质和其他生物分子。
例如，凝胶过滤可以根据分子大小筛选分子，大分子无法进入凝胶孔径而被过滤，从而实现分离。
小鼠肝实质细胞的分离、鉴定及原代培养
小鼠肝实质细胞的分离、鉴定及原代培养陈阳洁;高柯欣;王智豪;李峰;张琳琳;刘娇;陈晓光【摘要】为分离、培养高纯度原代小鼠肝实质细胞,并鉴定其纯度及生物活性,试验采用原位两步循环灌流法及多次低速差速离心法分离纯化肝实质细胞,促贴壁培养基原代培养,台盼蓝检测其存活率,PAS反应检测其糖原合成能力,免疫荧光化学检测细胞中CK18表达情况.结果表明:每只小鼠可获取约1.5×106个细胞,存活率>97％;镜下发现细胞在接种后6 h开始贴壁,72 h贴壁细胞生长状态良好,胞体变大、不规则,细胞间相互靠拢呈岛状或条索状连接;肝细胞出现成片紫红色糖原颗粒,CK18在细胞中均匀分布;糖原反应联合CK18免疫荧光显示细胞纯度在90％以上.说明该试验所用方法分离出肝实质细胞数量和存活率高,促贴壁培养基培养的肝实质细胞纯度高,为细胞代谢、细胞毒性等的研究奠定了基础.【期刊名称】《畜牧与饲料科学》【年(卷),期】2019(040)004【总页数】5页(P7-11)【关键词】小鼠;肝实质细胞分离;原代培养;细胞鉴定【作者】陈阳洁;高柯欣;王智豪;李峰;张琳琳;刘娇;陈晓光【作者单位】河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023【正文语种】中文【中图分类】Q813.11肝脏是哺乳动物机体内重要的解毒和代谢器官［1］。
当肝脏受到物理、化学或生物性损伤时，会产生肝肿瘤、中毒性肝病、肝硬化、急性重型肝炎等各种肝病［2］，而阐明各种肝病的发生机理是预防和治疗肝病、寻找开发新药物的第一步。
目前，将肝细胞分离、纯化并进行体外原代培养已成为探索肝病发病机制常用手段［3］，并在肝病相关研究中起着越来越重要的作用。
哺乳动物组织基因组DNA提取实验报告
哺乳动物组织基因组DNA提取实验报告实验目的：
实验原理：
本实验采用了离心提取法，将细胞破裂并使DNA高度纯化。
实验步骤：
1.将肝脏样本放在冰上并迅速离心5分钟，将上清液移至50ml离心管中。
2.加入10ml EDTA-Triton X-100 Buffer，彻底混合。
3.离心15分钟，室温25°C，10000转/分钟。
4.用管钳将上清液倒入新的50ml离心管中。
6.将上清液倒出，加入70%的乙醇混悬液中。
8.将上清液倒出，将离心管底部置于吸水纸上20秒钟。
9.加入DEPC水，在室温25°C下彻底溶解DNA。
实验结果：
实验分析：
1. 相比较其他方法，离心提取法是一种较高质量的DNA提取方法。
2. 在实验中，我们需要密切注意样本放在冰上的时间，以确保样本不被污染。
3. 在实验中，我们需要适当地离心时间，以保证DNA的纯化程度。
4. 在提取后，我们需要用DEPC水进行溶解DNA，以确保DNA完全溶解。
细胞纯化过程
细胞纯化过程细胞纯化是一种重要的生物技术，用于从混合物中分离和纯化特定类型的细胞。
它是在实验室中进行的一项关键技术，广泛应用于生物医药研究和生产中。
细胞纯化的目的是获得高纯度和活性的特定细胞，以便进一步研究其功能和应用。
细胞纯化的过程通常包括以下几个步骤：1. 细胞培养和增殖：首先，需要从细胞源中获得特定类型的细胞，并进行培养和增殖。
这可以通过组织样本、血液或细胞系等多种方式来实现。
在培养过程中，需要提供适当的培养基和条件，以确保细胞的健康和增殖。
2. 细胞分离：在细胞培养达到一定数量后，需要将目标细胞与其他细胞分离开来。
这可通过物理手段（例如离心、过滤）或化学手段（例如抗体标记、分子筛）实现。
分离的目的是去除杂质细胞，使目标细胞更纯净。
3. 细胞提取：在细胞分离后，需要进一步提取目标细胞。
这可以通过细胞裂解、超声波处理或化学处理等方法来实现。
提取的目的是破坏细胞膜，释放细胞内的目标物质。
4. 细胞纯化：在细胞提取后，需要对目标细胞进行纯化，以获得高纯度的细胞。
这可以通过离心、过滤或亲和层析等技术来实现。
纯化的目的是去除残余的杂质和非目标细胞，使目标细胞更纯净。
5. 细胞保存：在细胞纯化后，需要对细胞进行保存，以便后续的研究和应用。
常用的细胞保存方法包括冷冻保存和液氮保存。
保存的目的是保持细胞的活性和功能。
细胞纯化是一项复杂而精细的技术，需要熟练的实验操作和专业的知识。
在整个过程中，需要注意细胞的健康和活性，避免对细胞造成损伤。
此外，还需要严格控制实验条件和操作环境，以确保实验结果的准确性和可重复性。
细胞纯化在生物医药研究和生产中具有重要的应用价值。
它可以用于研究细胞功能和信号传导机制，开发新药物和治疗方法，以及生产生物制品和疫苗等。
通过细胞纯化，可以获得高纯度和活性的细胞，为科学研究和应用提供了重要的基础和支持。
细胞纯化是一项关键的生物技术，用于从混合物中分离和纯化特定类型的细胞。
它包括细胞培养和增殖、细胞分离、细胞提取、细胞纯化和细胞保存等步骤。
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纯化分离的目的
去除表达产物中非目的基因表达的杂蛋白以及非蛋白组分的 杂质，以得到单一条带的目的蛋白。 去除内毒素；蛋白酶；核酸等污染物。 浓缩目的蛋白至较高的浓度。 保存目的蛋白到合适的缓冲液中，去除对蛋白质功能或保存 有影响的试剂。
纯化的方法
原则：利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染， 而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。 常用方法： 1. 色谱层析 2. 沉淀 3. 透析 4. 电泳 5. 差速离心
色谱层析
常用的色谱层析： 1. 免疫亲和色谱：蛋白质与特异性配基配对到色谱基质上， 且蛋白质与配基间具有可逆的相互作用。 2. 离子交换色谱：利用不同的蛋白质表面净电荷的差异进行 分离。 3. 疏水相互作用色谱：蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白质 与疏水层析介质疏表面可逆的相互作用来进行分离。 4. 凝胶过滤色谱：利用分子通过凝胶填料大小不同对其进行 分离。
破碎上清 流穿样品 洗脱样品1 MK 洗脱样品2 洗脱样品3 洗脱样品4
120KD 90KD 60KD
40KD 30KD 20KD
14KD
金属螯合层析色谱
注意事项
1. 咪唑在280nm处有吸收，当监测吸光度时，需要以洗脱缓冲液作为空 白。 2. 在较低的pH值的条件下，金属离子的丢失是非常明显的。如果是对同 样的蛋白质进行纯化，在每次纯化之间没有必要将柱子剥离，进行 5~10次纯化后，需要对色谱柱进行剥离和再充电。 3. NaOH和Ni2SO4会反应发生沉淀，需注意剥离Ni离子后才能冲洗NaOH。
金属螯合层析色谱
纯化示例
120KD 90KD 60KD 40KD 30KD
20KD
14KD
金属螯合层析色谱
纯化示例1
结合缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，pH7.4 洗脱缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4 样品： OTIG细胞培养上清 层析柱： Chelating (Ni2+) S Fast Flow
MK 120KD 培养上清 流穿样品 洗脱样品1 洗脱样品2
90KD
60KD
40KD
30KD 20KD
金属螯合层析色谱
纯化示例2
结合缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，pH7.4 洗脱缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4 样品： 2SXA细胞培养后细胞破碎 层析柱： Chelating (Ni2+) S Fast Flow
表达位置对层析的影响
表达位置
分泌表达
优点
1. 样品预处理简单。 2. 预处理过程短不会引入外源性 内毒素，一般不会对目标蛋白 结构造成破坏。 3. 大量杂质留在细胞内，样品成 分相对纯净。
缺点
1. 某些蛋白可能会受到培养基 成分的影响。 2. 培养基营养成分未完全消耗， 长时间放置容易感染细菌。 3. 样品体积较大，需要较长的 浓缩时间。 需要细胞破碎，离心等处理。 细胞破碎过程中易引入外源 性内毒素，破碎过程比较剧 烈，可能会破坏蛋白质结构。 细胞破碎后释放较多杂质， 增大纯化难度。
蛋白质A层析色谱
纯化示例
结合缓冲液：PBS,pH7.4 洗脱缓冲液：0.1M Glycine,pH3.0 样品：ANTPD-A/ANTPD-B 层析柱：Protein A Sepharose Fast Flow
细胞培养液
MK 120KD 90KD 60KD 40KD 30KD
流穿样品
洗脱样品
20KD
重力柱的应用
注意事项
1. 细胞项目进行重力柱实验时可能会同时进行多根，为避免弄混样品， 一定要做好相应标记，摆放重力柱和上样液以及相应收集液的顺序要 一一对应。每完成一个收集液，立即做好标记，以免收集液过多混肴。 2. 细胞项目多为亲和层析，为防止非特异性吸附，样品里一定要加入尽 可能高浓度的NaCl以提高洗脱纯度；同时上样后的平衡液要尽可能加 大平衡的体积，以便冲洗掉非特异性吸附的杂蛋白。 3. 哺乳细胞表达的蛋白存在糖基化修饰问题，所以SDS-PAGE表观分子 量可能会偏大，或者有多条偏大的条带都有可能是目标蛋白，检测判 断时IgG结构
蛋白质A层析色谱
分离操作
结合缓冲液：20mM磷酸纳，pH7.0 洗脱缓冲液：100mM甘氨酸/100mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH3.0 中和缓冲液：1M Tris-HCl，pH9.0 1. 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 2. 用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 3. 上样，流速为0.5ml/min（1ml的柱子），收集流穿片段。 4. 用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合 物质都被冲洗出柱子（紫外检测器在280nm波长检测）。 5. 用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。洗脱液立即用中和缓冲液 （0.06ml~0.2ml 1M Tris-HCl，pH9.0每毫升馏分）中和至中性。 6. 立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子 。
重力柱的应用
装柱和分离过程
1. 2. 3. 4. 装入下筛板并用去离子水润洗空柱体。 接好下堵头，取合适体积的填料并用移液器吹打均匀，加入空柱体。 继续加入去离子水让填料沉降完全，装入上筛板。 保持一定的液面高度，盖上盖子完成装柱。
1
2
3
4
重力柱的应用
分离操作SOP
FC亲和标签实验流程 样品预处理： 20ml培养上清补加20mMPB，调pH至7.4. Buffer A：PBS, pH7.4 Buffer B：0.1M Glycine，pH3.0 Protein A填料载量比较低，1ml填料可以结合2mg左右FC标签蛋白，根据 表达量选用合适的Protein A亲和柱。（不可用NaOH来控内毒或者清洗） PBS平衡后上样，收集流出液。上样完毕，再用平衡液平衡亲和柱（尽可 能提高平衡体积，至少10ml）。平衡后用buffer B洗脱，分别收集洗脱液。 洗脱液的收集管预先加入一定量的1M Tris，pH9.0调节pH值，洗脱完成后 用Buffer A重新平衡柱子。 收集方法：0.2ml重力柱：每个梯度分开收集：0.2ml，0.8ml，0.5ml 0.5ml重力柱：每个梯度分开收集：0.5ml，1.5ml，1ml
胞内表达
1. 样品可以选择合适的缓冲体系。 1. 2. 完全去除培养基成分的影响， 2. 可以保存较长时间。 3. 细胞破碎后体积较小，回收时 3. 间短。
蛋白质A层析色谱
常用的亲和色谱层析：蛋白质A(Protein A Sepharose Fast Flow) 原理：蛋白质A来自金黄色葡萄球菌属，包含5个区域，可以用来结合 IgG的Fc区域。作为一个亲和配基，蛋白质A偶联到Sepharose上，使得这 些区域可以结合游离的IgG分子。一分子的蛋白质A可以至少结合两分子的 IgG。
*组氨酸融合蛋白与Ni2+螯合后填料的结合示意
金属螯合层析色谱
分离操作
镍溶液：0.1M Ni2SO4 结合缓冲液：20mM磷酸纳，0.25M NaCl，pH7.4 洗脱缓冲液：20mM磷酸纳，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4 1. 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 2. 加入0.5个柱体积的0.1M Ni2SO4。 3. 用10倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 4. 上样，流速为1-4ml/min（1ml的柱子），收集流穿片段。 5. 用5~10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合 物质都被冲洗出柱子。 6. 用5倍柱体积的较低咪唑浓度（50mM）的洗脱缓冲液进行预洗脱。 7. 重复步骤6，使用更高的咪唑浓度直到目的蛋白都被洗脱下来。 8. 用10倍体积的结合缓冲液冲洗柱子，亲和柱可以进进行新一轮的纯化， 并且几乎不需要再次加载金属，如果是纯化用同样的HIS6标记的融合 蛋白。
14KD
蛋白质A层析色谱
注意事项
1. 样品需要离心（10000g/20min）去除细胞和细胞碎片。离心下来的上 清经过一个0.45μm的滤膜过滤。 2. 来自多数物种的IgGs和亚类，在接近生理pH值和离子强度的条件下， 可以结合到蛋白质A上。如果蛋白质和配基之间的互相作用较弱，应 该避免过度冲洗，因为这样可能会减少最终的产量。 3. 对于一些抗体，比如小鼠IgG，当使用蛋白质A进行纯化时，可能需要 向结合缓冲液中加入3M的氯化钠，达到最有效的结合，例如1.5M的甘 氨酸和3M的氯化钠，pH为8.9。 4. 洗脱完成后，立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子避免柱子 保存在低pH的环境中。
金属螯合层析色谱
常用的亲和色谱层析：金属螯合层析（Chelating Sepharose Fast Flow） 原理：螯合的Sepharose，当带有Ni2+离子时，如果形成氨基酸残基的复 合物，特别是组氨酸残基被暴露在蛋白质表面时，可以选择性的结合蛋白 质。(His)6融合蛋白可以很容易的结合到亲和柱上，然后用含有咪唑的缓 冲液进行洗脱。
重力柱的应用
分离操作SOP
His亲和标签实验流程 样品预处理：20ml培养上清加入20mM PB,500mM NaCl调节pH至7.5。 Buffer A：20mM PB,500mM NaCl, pH7.5 Buffer B：20mM PB,500mM NaCl,500mM Imizadole,pH7.5 根据样品中含有目标蛋白的量来确定使用的His柱类型（理论上1mlHis填 料至少可以结合10mg蛋白）：通常20ml细胞液用0.2ml填料的重力柱，如 果目标表达很好，可以增加填料体积，或改用1ml预装柱。用buffer A平衡 缓冲液处理。上样，收集流出液。上样完毕，再用平衡buffer平衡柱子 （至少10ml）。平衡后用含有50mM、500mM的咪唑缓冲液洗脱，并分别 收集洗脱液。 收集方法：0.2ml重力柱：每个梯度分开收集：0.2ml，0.8ml，0.5ml 0.5ml重力柱：每个梯度分开收集：0.5ml，1.5ml，1ml