树突状细胞的分离纯化
树突状细胞实验报告
一、实验目的1. 了解树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）的基本特性及其在免疫调节中的作用。
2. 掌握DCs的分离、培养和鉴定方法。
3. 学习利用DCs进行免疫调节实验。
二、实验原理树突状细胞是机体免疫系统中重要的抗原提呈细胞，具有摄取、加工和呈递抗原的能力。
DCs在启动、调控和维持免疫应答中发挥着关键作用。
本实验通过分离、培养和鉴定DCs，探讨DCs在免疫调节中的作用。
三、实验材料1. 试剂：胎牛血清、RPMI 1640培养基、DMEM培养基、双抗、TNF-α、IL-4、抗鼠CD14抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG抗体等。
2. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、流式细胞仪等。
四、实验方法1. DCs分离与培养（1）取健康小鼠脾脏，置于DMEM培养基中，剪碎后用200目筛网过滤。
（2）将滤液加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2条件下培养。
（3）培养3天后，加入TNF-α和IL-4，继续培养至第7天。
2. DCs鉴定（1）收集培养的细胞，用抗鼠CD14抗体进行标记。
（2）用FITC标记的羊抗鼠IgG抗体进行二次染色。
（3）流式细胞仪检测细胞表面CD14的表达情况。
3. 免疫调节实验（1）将分离得到的DCs与抗原共同培养，观察DCs对抗原的摄取和呈递能力。
（2）将DCs与T细胞共同培养，观察DCs对T细胞的激活作用。
五、实验结果1. DCs分离与培养：培养7天后，观察到细胞形态呈树突状，符合DCs的形态特征。
2. DCs鉴定：流式细胞仪检测结果显示，细胞表面CD14的表达率为（95±3）%，说明成功分离出DCs。
3. 免疫调节实验：（1）DCs对抗原的摄取和呈递：在抗原刺激下，DCs能够摄取并呈递抗原，说明DCs具有抗原摄取和呈递能力。
（2）DCs对T细胞的激活作用：在DCs与T细胞共同培养条件下，观察到T细胞增殖，说明DCs具有激活T细胞的作用。
树突状细胞体外分离扩增技术研究进展
树突状细胞体外分离扩增技术研究进展彭卫斌１综述；沙卫红２＋审校摘要：树突状细胞（ＤＣ）是目前所知的体内功能最强的专职抗原呈递细胞，是机体免疫反应的始动者，被称为机体防御病原微生物侵袭的重要“哨兵”，在移植排斥、抗肿瘤、抗病毒感染和自身免疫疾病中发挥着重要作用。
获得大量高纯度且表型、功能典型的ＤＣ是上述基础和临床研究的前提。
从直接分离提取到添加细胞因子诱导扩增ＤＣ研究获得很大进展，成为当今免疫学及肿瘤治疗学等相关学科的研究热点。
本文对ＤＣ体外分离、纯化及扩增方法作一简要综述。
关键词：树突状细胞；分离；扩增；细胞培养中图分类号：Ｑ８１３文献标识码：Ａ文章编号：１００４－２３６９１２００９）１１－０６７９－０４ＳｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏＰＥＮＧＷｅｉ－ｂｉｎ。
ＳＨＡＷｅｉ—ｈｏｎｇ”．１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ＧｕａｎｇｚｈｏｕＦｉｒｓｔＰｅｏｐｌｅ，ｓｔｔｏｓｐｉｔａｌ，ＡｆｆｉｌｉａｔｅｄｔｏＧｕａｎｇｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕａｎ磐ｚｈｏｕ５１０１８０．Ｃｈｉｎａ；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，ＧｕａｎｇｄｏｎｇＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１００８０，Ｃｈｉｎａ；‘Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｈ－ｓｈａ＠１６３．ｅｏｍＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌ（ＤＣ）ｗｈｉｃｈｐｌａｙｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎａｌｌｏｇｒａｆｔｒｅｊｅｃｔｉｏｎ，ａｎｔｉ—ｔｕｍｏｒ，ａｎｔｉ—ｖｉｒａｌｉｎ－ｆｅｅｔｉｏｎｓａｎｄａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅｓｉｓｋｎｏｗｎａｓｔｈｅｍｏｓｔｐｏｗｅｒｆｕｌａｎｄｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌａｎｔｉｇｅｎ－ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇｃｅｌｌｉｎｖｉ—ＶＯ．ＨｏｗｔｏｃｕｌｔｉｖａｔｅａｎｄｐｕｒｉｆｙＤＣｗｉｔｈｈｉ。
树突状细胞培养方法
树突状细胞培养方法树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是一类免疫细胞，主要负责识别和激活T细胞，发挥着重要的免疫调节和抗肿瘤等作用。
为了进行树突状细胞的研究，科研人员需要对其进行体外培养。
本文将介绍常用的树突状细胞培养方法。
1.制备树突状细胞前驱细胞：树突状细胞前驱细胞主要存在于外周血和骨髓中。
首先，采集外周血或骨髓，并将其进行红细胞裂解。
然后，用PBS洗涤样品，离心沉淀细胞。
最后，将细胞进行培养。
2.培养基的选择：培养树突状细胞需要选择适宜的培养基。
目前常用的培养基有RPMI1640、DMEM等。
添加10-20%的胎牛血清（FBS）可以提供必要的生长因子和营养物质。
3.添加生长因子：在培养树突状细胞的过程中，可能需要添加一些生长因子来促进细胞的分化和增殖。
常见的生长因子包括GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）和IL-4（白细胞介素4）。
可以将这些生长因子添加到培养基中，以达到最佳生长条件。
4.细胞培养条件的控制：树突状细胞对培养条件非常敏感。
因此，需要对温度、湿度、CO2浓度等参数进行严格控制。
一般来说，将细胞培养在37摄氏度、5%CO2的培养箱中。
5.细胞的分离和传代：在树突状细胞培养过程中，细胞会不断增殖。
为了保证细胞的活力和稳定性，需要定期分离和传代细胞。
可以使用胰酶等消化酶将细胞从培养瓶中剥离，然后进行细胞计数并按照一定比例进行传代。
6.细胞质量的评估：在培养树突状细胞的过程中，需要对细胞质量进行评估。
可以通过使用流式细胞仪等设备来检测细胞表面标记物的表达情况，以及细胞活力、树突状突起的形态等指标来评估细胞的质量。
7.树突状细胞的激活：树突状细胞的主要功能是激活T细胞。
为了使树突状细胞具备充分的抗原递呈能力，可以使用多种促进细胞激活的方法，如脂多糖、TNF-α等。
总结：树突状细胞培养方法包括制备前驱细胞、培养基选择、生长因子添加、细胞培养条件控制、细胞分离和传代、细胞质量评估以及细胞的激活等步骤。
外周血树突状细胞的诱导及其对T细胞的激发效应
外周血树突状细胞的诱导及其对T细胞的激发效应邱悦;邱玉华;蔡杰;邢卫星;何炎;季剑【期刊名称】《苏州大学学报（医学版）》【年(卷),期】2001(021)003【摘要】目的建立外周血树突状细胞(Dendritic Cell,DC)的分离和培养方法,研究DC对T细胞的刺激效应.方法首先从外周血分离出非T细胞,再经贴壁和Metrizamide分离纯化去除巨嗜细胞、单核细胞及B细胞等,加入GM-CSF、TNF-α和IL-4培养.收获DC与异体T细胞混合培养.用MTT法检测T细胞的增殖,ELISA法测定培养上清中IL-2、IL-6及IFN-γ的分泌量.结果来源于外周血的DC前体细胞经细胞因子诱导培养后,其总量可扩增18.34±6.26倍,可促进异体T 细胞的增殖及细胞因子分泌.结论来源于外周血的DC,其数量和浓度均较高,而且是一种功能性DC.【总页数】3页(P263-265)【作者】邱悦;邱玉华;蔡杰;邢卫星;何炎;季剑【作者单位】苏州大学医学院解剖学教研室暨神经细胞生物学研究室;苏州大学生命科学院免疫学研究室,;苏州大学医学院解剖学教研室暨神经细胞生物学研究室;苏州大学医学院解剖学教研室暨神经细胞生物学研究室;苏州大学医学院解剖学教研室暨神经细胞生物学研究室;苏州大学医学院解剖学教研室暨神经细胞生物学研究室【正文语种】中文【中图分类】R392.11【相关文献】1.黏蛋白1基因磁转染树突状细胞诱导细胞毒性T细胞抗膀胱肿瘤免疫效应的研究[J], 孙璇;夏昕晖;廖育芬;张东方;王固新;罗刚2.树突状细胞与肿瘤细胞融合后诱导T细胞介导的抗肿瘤效应 [J], 李坚;藏磊;许化溪;马斌;邵起祥3.树突状细胞与细胞融合后诱导T细胞介导的抗肿瘤效应 [J], 王全楚;申德林;许丽芝;冯志华;周永兴4.人外周血单核细胞来源树突状细胞转染重组腺相关病毒诱导特异性T细胞的效应[J], 吴自勍;黄浩;尤长宣;罗荣城;Yong Liu;Paul L．Hermonat5.zVAD-fmk对未成熟树突状细胞诱导初始性CD4^+T细胞分化为调节性T细胞影响的体外研究 [J], 骆志清;王毅;钱坤;罗志刚;郭军华;屈小勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
结核分支杆菌感染后树突状细胞发挥的免疫学作用
少部分细胞 为 ｃ 未 Ｄ 以及 ｃ 矗 Ｄ 。在这些表达 的表 面分子 中， 最 早表达 的为 Ｃ ， Ｄ 和 ｃ ｌ 分子（ Ｄ ｃ， 。 ＤＪ ｂ 仅一整夜培养 即表达 ） ， 而 Ｔ Ｆ 的出现以及 ｃ 加、 Ａ Ｎ． Ｄ Ｉ ｂ表达水平 的上调则要在 培养 － ４ ８ｈ后。培养后期才 出现 Ｃ 帅与 Ｃ ％ 原 的表 达 。从肺 泡 Ｄ Ｄ抗 组织 中分离 出的树 突装 细胞 细研究表 明， 大部分 的树 突状细
些细胞并不表达 Ｃ Ｃ ，以及淋 巴相 关的 Ｃ 。， Ｄ Ｄ Ｄ 而低水 平 表达髓系标记 Ｆ／ ０ 中到高水平表达 ＭＡ ３抗原 ， ４８ ， Ｃ 几乎所 有 细胞都高水平表达 Ｃ ，ＤＩ ， Ｄ Ｃ ８以及 Ｃ 抗原 ， Ｄ Ｃ Ｃ 。 Ｄ０ ｂ Ｄ 极
身组织与脏器 ， 然仅 占人外周单 个核细胞 的 １ ， 有着 其虽 ％ 但 不容忽视 的作 用。Ｄ ｓ根 据 其来 源 分 为 两 类 ： 系 来 源 的 Ｃ 髓 Ｄ １和淋 巴系来源 的 Ｄ ２ 。树 突状 细胞是 专职抗原提呈细 Ｃ Ｃ… 胞 ， 主要 功能是 抗原 的摄 取 、 理加 工 和递 呈。未 成熟 的 其 处 Ｄｓ Ｃ 受到外源刺激后 即向淋 巴结迁徙 。其迁 徙的过程还伴 随 着它功能和表型 的成熟 Ｊ包括 ：．细胞 表面分 子表达增加 ， ， １ 其中最明显 的就是主要组织相容性 复合体 Ⅱ（ ａｏ ｈｓ ｃｍ— ｍ ｊ ｉ ｏｏ ｒ ｔ
可 以通过阿拉伯甘露糖脂 （ Ａ 配体抑制 巨噬细胞 对 Ｉ Ｆ Ｌ Ｍ） Ｎ一
树突状细胞
树突状细胞的生物学功能的研究进展树突状细胞(dendritic cells，DC)是目前人体内最活跃，功能最强大的专职抗原呈递细胞,是人体对免疫原产生免疫应答的重要细胞之一。
DC 广泛存在于血液、淋巴、肝脾及皮肤黏膜等组织，能激活功能性淋巴细胞，并产生细胞毒作用，提高机体免疫水平。
DC对抗原和弱抗原都有很高的呈递效率，只需少量的抗原及DC即可激活T细胞，因此成为抗肿瘤和抗病毒免疫研究中的热点。
1DC的来源与分化发育DC 的产生分两个阶段：从祖细胞分化为未成熟DC和未成熟DC受外界刺激( 如细菌产物、坏死物及及各种细胞因子) 分化成熟。
1.1DC的分化体内DC 起源于多能造血干细胞，按来源其分化途径分为两条: ①髓系分化途径。
称为髓系DC( myebiod，DC1) ，最终分化为朗格汉斯细胞和间质DC两个亚群。
DC1 由髓样干细胞在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子( granulocyte-macrophagecolony stimulati ng factor，GM-CSF) 、肿瘤坏死因子α刺激下诱生为DC。
亦有来源于外周血单核细胞，也称为DC1 前体细胞，在GM-CSF、白细胞介素4( interleukin-4，IL-4) 作用下或穿越内皮细胞并吞噬异物后分化为DC。
②淋巴系分化途径。
为淋巴系DC( lymphoid，DC2) ，最终分化为类浆细胞DC。
DC2 的前体细胞不表达髓系抗原，也无吞噬、吞饮抗原能力，低表达GM-CSF，高表达IL-3 受体，在IL-3 刺激下分化为DC2。
目前对DC 亚群及分化的研究主要来源于体外培养的方法，体内天然DC 亚群的分类仍有待于进一步研究［1］。
1.2DC的表型变化DC的发育分为成熟与未成熟阶段，两者具有不同的生物学特征和细胞表型。
正常情况下，体内多数DC 处于未成熟阶段，其广泛分布于全身各外周组织，高表达吞噬相关受体( Fc 受体、补体受体、甘露糖受体) ，而不表达或低表达共刺激分子和黏附分子( CD14、CD54、CD40、CD80) 。
树突状细胞培养与鉴定
树突状细胞的培养与鉴定【摘要】目的研究利用磁珠分离方法获取单核细胞，用细胞因子gm-csf和il-4联合诱导使之分化为树突状细胞（dendritic cells, dcs）的方法，并对培养的细胞从形态，表型，功能等三个方面进行鉴定，从而探索出一套较成熟的dcs的培养方法。
方法通过密度梯度离心的方法获取白细胞悬液中的白膜层，然后通过磁珠分离的方法，收集高纯度的单核细胞。
在细胞因子gm-csf和il-4的刺激下，将细胞培养至7天左右，收集细胞进行流式分析，并进行淋巴细胞增殖实验，鉴定细胞是否为树突状细胞。
结果在倒置显微镜下观察，细胞培养第7天，大部分细胞呈单个悬浮，并有明显的毛刺样突起。
流式分析发现细胞高表达dc表面特异性抗原cd80，cd86，hla-dr，并且不再表达单核细胞表面抗原cd14，细胞纯度约为93.12%。
淋巴细胞增殖实验显示dcs可明显刺激初始型淋巴细胞增殖。
结论通过磁珠分离的方法获得单核细胞并利用gm-csf和il-4细胞因子诱导可成功培养出纯度高的树突状细胞。
【关键词】树突状细胞；磁珠；流式molecular and functional characteristics of dendritic cells differentiated from highly purified blood monocytes. 【abstract】 objectives：to develop a simple and efficient method to generate human dendritic cells (dcs) from highly purified cd14 + monocytes from human peripheral blood. methods：monocytes were purified by negatively sortingperipheral blood mononuclear cells (pbmc) with dynal magnetic negative isolation kit. monocytes were then differentiated into immature dendritic cells stimulated by the combination of interleukin-4 (il-4) and granulocyte-macrophagecolony-stimulating factors (gm-csf) for 7days. cells were analyzed for phenotype by flow cytometry。
人子宫蜕膜树突状细胞DEC-205 +HLA-DR +CD11c +的分离纯化与鉴定
ｎ ｅｎ ｅｔ ｔ ｅ ｓ ａ ｄｔｌ ａｃ ｅｆ ｕ ． Ｍｅｈ ｄ Ｔ ｅｆ ｓ ａ ｙ ｇｓ ｔ ｎ ｒ～ ２ｗ ｅｔｔ ｎ ｄ ｃ ｕ ｌ ｓ ｅｗ ｓｄｓｅｓｄ ｏｒ ｏｈ ｔ ｔｏ ｓ ｈ ｅｈ ｅｒ ｅｔ ｉ ７ １ ｋ ｇ ｓ ｉ ） ｅｉ ａ ｔｓ ａ ｉ ｒ ｒ ｌ ａ ｏ ａ ｏ ｄ ｕ ｉ ｐ ｅ
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（． １ 深圳 市龙 岗区 妇幼保 健 院妇科 ，广东 深 圳 ５ ８ ７ ；２ 深圳 市疾 病控 制 中心 ，广 东 深圳 ５ ８ ２ ） １ １２ห้องสมุดไป่ตู้． １ ０ ０
［ 摘 要 ］ 目的 ：探 讨人 子 宫蜕膜 树突 状细 胞 的分 离方 法和 诱 导培 养的 最佳 条件 ， 为研 究 树突 状细 胞 在母 胎 免 疫耐 受 中
ｔｅ ｇ ｎ ｒｔｄ ｃ ｌ ｒ ｄ ｎ ｉ ｅ ｙ ｐ ｅ ｏｙ ｉ ｎ ｕ ｃｉ ｎ ｌｍｅｈ ｄ ． Ｒｅｓ ｌ Ａ ｏ ｌｏ ．— ３ ｌ ｈ ｅ ｅ ａｅ ｅｌ ｗｅｅ ｉｅ ｔｆ ｄ ｂ ｈ ｎ ｔｐ ｃ ａ ｄ ｆ ｎ ｔ ａ ｔｏ ｓ ｓ ｉ ｏ ｕｔ ｓ ｔｔ ｆ １０ ．× ０ ａ
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• 免疫法：淘汰法、流式细胞术法、磁性细 胞分离术
免疫磁珠技术原理
• 免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠 的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相 连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞 由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不 在磁场中停留，从而使细胞得以分离。 • 免疫磁珠法分为阳性分离法和阴性分离法： 阳性分离法－磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞 阴性分离法－磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细 胞为所需细胞
CD4+ 血液树突状细胞的直接 、阳性选择
1.将富含树突状细胞的悬液离心 1.将富含树突状细胞的悬液离心 2.加磁珠标记的CD4单克隆抗体 2.加磁珠标记的CD4单克隆抗体 3.离心 3.离心 4.分离柱冲洗 4.分离柱冲洗 冲出即为CD4标记的树突状细胞 冲出即为CD4标记的树突状细胞
•
用FITC 标记HLA-DR, 与表达HLA-DR 细胞结合,通过与 对照组相比去除假阳性率 M1, M2为所测样本阳性细胞百 分比。在 PBMC 中HLA-DR+细胞占13%左右( 图1) ,而在 纯化的CD4+DC细胞中HLA-DR 的表达率达到80%以上 (图1) 。
•谢谢
DC的应用
• 通过不同形式的肿瘤抗原致敏的DC体内注 射后 可诱导出特异性抗肿瘤免疫应答 ,但肿 瘤患者DC功能均存在一定缺陷 ,应用肿瘤 的各种抗原 ,诸如肿瘤特异性抗原、肿瘤相 关抗原及完全性细胞抗原 ,以各种手段修饰 DC制成疫苗 ,以此免疫荷瘤宿主 ,可产生抗 肿瘤免疫。
DC分离纯化方法
Steinman
Steinman因他在“树突状细胞及其在适应性 免疫系统方面作用的发现”取得成就，获 得2011年诺贝尔生理学或医学奖的1/2.
• 拉尔夫·斯坦曼于麦吉尔大学学习生物学和化学获 得学士学位后，曾就读于美国哈佛大学医学院， 并于1968年获得医学博士学位。1970年起就职于 洛克菲勒大学，他在1973年提出了树突状细胞的 概念，其时他在赞威尔·A·科恩的实验室做博士后。 1988年起任该大学免疫学教授，同时担任其免疫 学和免疫疾病中心主任 。 • 虽然专家并不同意斯坦曼依靠自己的治疗方案把 寿命延长了4.5年这种说法，但斯坦曼实验室的同 事这样相信（好同事呀……）。斯坦曼得的是胰 腺癌，一般说来，只有不到5%的人能够多活1年。
DC的来源和分布
DC分布全身各组织脏器（除脑组织外）。 langgerhans cells（LC） ，分布于表皮、胃肠道上皮 interstitial DC，分布于心、肝、肺、肾等脏器 follicular dendritic DC（FDC），分布于淋巴结滤泡区 interdigitating cell（IDC ），胸腺依赖区和胸腺髓质
Discussion
斯坦曼获得诺贝尔医学奖说明了现在科学 界对通过免疫治疗各种疾病是十分有信心 的。 免疫磁珠方法选择性很强，但选择性强的 话干扰就变大了，我们可以在这一方面入 手。
References
• 唐岩，唐军民，李银生，伊焕发，戴燕。 免疫磁珠技术在分离人外周血树突状细胞 中的应用。解剖学通报，2003 • 陈向荣，石汉平。树突状细胞的分离纯化 与鉴定。上海免疫学杂志，2001 • 伊焕发，唐 岩，甄昱，唐军民，孙红亚。 人外周血 CD4+树突状细胞的纯化及鉴定。 解剖科学进展，2003
免疫磁珠的分离原理
抗CD3磁球 磁球 加入B和 细 加入 和T细 胞中 磁球结合T细 磁球结合 细 胞 磁架进行分离
正向选择 负向选择
人外周血树突细胞分离纯化
T细胞 NK细胞 单核细胞的去除
CD4+ 血液树突状细胞的直接 、阳性选择
T细胞 NK细胞 单核细胞的去除 NK细胞
1.取新鲜的人抗凝外周血 , 用密度梯 1.取新鲜的人抗凝外周血 度离心法从中分离获得单个核细胞 2.加入阻断剂及连有半抗原的抗体 2.加入阻断剂及连有半抗原的抗体 3.MACS磁珠标记的抗半抗原抗体 5.细胞分离柱冲洗 5.细胞分离柱冲洗
树突状细胞
• 树突状细胞(dendritic cell , DC)是Steinman 在 1973 年首先发现 ,是目前所知的功能最 强的抗原提呈细胞（APC）。它的表面表 达丰富的与抗原呈递有关的MHCⅠ 类和 Ⅱ 类分子以及多种共刺激分子 ,可能高效地摄 取、加工处理和呈递抗原。 成熟DC能有效激活初始型T细胞，DC处于 启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。