泥蚶血细胞耐饥饿及抗菌力特性的研究

经饥饿处理后 ,泥蚶血细胞随着时间的迁移 ,出现细胞形态不规则 、胞质色泽变浅 、胞质颗粒物减少 、胞
膜边缘光滑度减小等现象 。血细胞对大肠杆菌 、奥斯陆莫拉氏菌 、脲放线杆菌均具较高的噬菌率 ,噬菌
实验过程中血细胞形态结构以及细胞组分不断产生变化 。细胞抗菌活性检测结果表明 :血细胞对三者
都具有一定的抗菌活性 ,活性依次为 :大肠杆菌 >奥斯陆莫拉氏菌 >脲放线杆菌 。
根据着色性质和颗粒大小不同 ,胞质中的颗粒 物质可分为 3类 :小颗粒 、中颗粒 、大颗粒 。目前认 为存在 2种不同的噬菌机制 : ( 1)血细胞在吞噬反 应中释放溶酶体酶类物质 。Coles等采用电镜细胞 化学法将贻贝血细胞中的溶酶体酶类物质 ———酸 性磷酸酶定位于大颗粒物质中 [ 11 ] 。 ( 2 )血细胞由 呼吸作用释放有解毒功能的高活性氧化代谢产物 。 张峰等对贝类血细胞活性氧体内防御作用研究结 果表明 :当血细胞接触外来异物后 ,活性氧成分伴 随吞噬作用产生 ,这些活性氧成分可直接对外来生 物起到杀伤作用 [ 13 ] 。Coles等采用电镜细胞化学法 将贻贝血细胞中的过氧化物酶定位于小颗粒物质 中 [ 11 ] 。 Pipe等采用免疫细胞化学法显示贻贝血细 胞中过氧化氢酶和超氧化物歧化酶 ,分别定位于小 颗粒物质和大颗粒物质中 [ 12 ] 。贝类血细胞胞质中 的小颗粒很可能为过氧化物酶体 ,并栉孔扇贝血细 胞酶电镜细胞化学研究 [ 14215 ]也支持这一结论 。泥 蚶血细胞胞质中的小颗粒物质参与细胞吞噬过程 , 并且发挥了重要作用 ;大颗粒物质基本上无吞噬作 用 。初步认为泥蚶血细胞小颗粒物质的噬菌作用 与其作为过氧化物酶体是密切相关的 。过氧化物 酶体是生物氧化的重要场所 ,能消除细胞内的氧 , 将有毒物质转变成无毒物质 ,并产生细胞所需要的 某些代谢物 。血细胞抗菌活性大小因菌种而异 ,是 与菌体表面所含有或释放的物质参与或辅助血细 胞对异物的识别 、黏附 、摄入 、降解 、破坏 、清除过程 有关 。而贝类血细胞噬菌 、抗菌作用的具体生化机 理以及与颗粒物质的关联还有待进一步深入研究 。
大肠杆菌 、奥斯陆莫拉氏菌 、脲放线杆菌用液 体培养基于 37 ℃培养 24 h。分别取 3种菌体培养 液 10 m l,以 8000 r/m in离心 15 m in,弃上清液 ,以 0. 1 mol, pH 6. 4的无菌磷酸钾缓冲液作为底物 ,将 3种菌配成一定浓度 (OD570 nm≈ 0. 1) 。
2. 2 抗菌活性检测结果 血细胞对大肠杆菌 、奥斯陆莫拉氏菌 、脲放线
杆菌均有较高的抗菌活性 ,其检测结果见表 1。由 表 1可见 :泥蚶血细胞对 3类细菌的抗菌活性大小 依次为 :大肠杆菌 (U平均 : 0. 2881 ) >奥斯陆莫拉氏 菌 (U平均 : 0. 2157) >脲放线杆菌 (U平均 : 0. 1143) 。
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水 产 科 学
第 26卷
的趋向性 (图 325, 6) 。
图 2 血细胞噬菌实验对照 噬菌实验对照组 : 1. 奥斯陆莫拉氏菌 : 2. 脲放线杆菌 : 3. 大肠 杆菌 : a. 吞噬初期 : b. 吞噬晚期
图 3 大肠杆菌的血细胞噬菌实验过程
3 讨论
根据常规贝类血细胞分类法 ,血细胞分为颗粒 细胞和透明细胞 [ 1 ] 。细胞吉姆萨染色结果表明 :泥 蚶血细胞多为颗粒细胞 ,透明细胞较少 ,初步认为 与血细胞具有较强的耐饥能力密切相关 。目前 ,贝 类血细胞的研究结果表明 :过氧化氢酶 、超氧化物 歧化酶和酸性磷酸酶等酶类物质大多位于颗粒细 胞内的颗粒物质中 [ 11212 ] 。过氧化物酶体自身能产 生细胞新陈代谢所需的物质 ,饥饿状态下它可作为 物质来源 ,维持细胞新陈代谢 。由此推断 ,泥蚶血 细胞耐饥能力由颗粒物质成分引起 。
用 pH 7. 0, 0. 1 mol/L 无菌 PB S反复冲洗并稀 释血细胞至 1. 0 ×107个 /m l。各菌液与细胞悬液以 5∶1混合 ,对照组用无菌磷酸钾缓冲液代替菌液 ,每 隔 2～3 m in观察细胞噬菌现象 。
按文献 [ 3 ] ,取 5 m l该菌液于试管 ,置于冰浴 中 ,再加入 100μl血细胞悬液 ,混匀 ,用 Cary100型 分光光度计检测试液在 570 nm 波长处的光密度 ( A0 )值 。然 后 将 试 液 移 入 37 ℃水 浴 , 恒 温 30 m in,取出后立即置于冰浴内 10 m in,以终止反应 , 测其经水浴后的试液在 570 nm 波长处的光密度 ( A )值 。抗菌活力 Ua按下述公式计算 :
收稿日期 : 2006 - 01 - 19;修回日期 : 2006 - 05 - 18. 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30371095). 作者简介 :潘沙芳 (1981 - ) ,女 ,在读研究生 , 研究方向 :海洋生物学 ; . E - mail: panshafang@163. com. 通讯作者 :李太武 ( 1955 - ) ,
和大肠杆菌 (图 221a, 1b) 。 以大肠杆菌为例 ,每隔 2～3 m in对血细胞不同
噬菌阶段进行显微观察 (见图 3 ) ,研究发现 ,对照 组细胞形状规则且明显 ,细胞核多居中 ,细胞质色 泽较深 ,胞质中小颗粒物质丰富 ,黑色大颗粒物质 较少 (图 321) ;细胞吞噬初期 ,细胞形态结构 、组分 与对照组十分接近 (图 322) ;随着细菌降解 ,细胞变 小 ,胞质中的小颗粒物质逐渐减少 ,部分细胞出现 颗粒物质外渗现象 (图 323, 4) ;细胞吞噬晚期 ,细胞 质内的小颗粒物质减少到一定程度 ,胞质中的大颗 粒物质在细胞核周围呈现聚集现象 ,大颗粒物质减 少趋势者较少 ,并且细胞核出现向细胞膜边缘移动
细胞形状完全不规则 ,细胞核的位置凌乱 ,有的位
表 1 泥蚶血细胞抗菌活力测定结果
组别
大肠杆菌
1
2
3
奥斯陆莫拉氏菌
1
2
3
脲放线杆菌
1
2
3
抗 A o 0. 9244 0. 9377 0. 9250 0. 5608 0. 6023 0. 6385 0. 5619 0. 5663 0. 5832
菌 活A
0. 8479 0. 8620 0. 9963 0. 5376 0. 5898 0. 5940 0. 5564 0. 5609 0. 5711
力 U a 0. 3004 0. 2963 0. 2675 0. 2277 0. 1456 0. 2737 0. 0994 0. 0981 0. 1455
2. 3 噬菌作用观察结果 血细胞首先识别附着其表面的外来异物 ———
男 ,教授 ,博士生导师 , 研究方向 :海洋生物学 ; E - mail: litaiwu@ nbu. edu. cn.
第 1期
潘沙芳等 : 泥蚶血细胞耐饥饿及抗菌力特性的研究
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Ua =
Ao - A A
于细胞中间 ,有的位于细胞一侧 ,细胞颗粒呈透明 状 ,细胞膜边缘呈锯齿状 (图 126) 。
1 材料与方法
1. 1 材料 泥蚶采自浙江乐清养殖场 ,均为 2 龄 ,养于室
内充气水箱内 ,水温为 18～24 ℃。 1. 2 方法 1. 2. 1 Giem sa染色
对照组泥蚶隔天用微藻投喂试验组泥蚶用过 滤灭菌海水饥饿处理 ,隔天换水 、取样观察 。经饥 饿处理后 ,泥蚶血窦取血 ,血细胞涂片并加热烤干 , 用固定液 —甲醇 ∶冰醋酸 ( 3 ∶1)固定后 , pH 7. 6 的 Giem sa液常规染色 30 m in,冲洗 、干燥后 , O lympus BX - 60显微镜下观察并拍照 。 1. 2. 2 抗菌活性检测及噬菌现象观察
关键词 : 泥蚶 ; 血细胞 ; 噬菌作用
中图分类号 : S968. 314
文献标识码 : A
文章编号 : 100321111 (2007) 0120022204
贝类血细胞作为体内免疫防御系统之一 ,具有 吞噬 、包囊 、损伤修复等功能 [ 122 ] 。其中吞噬作用是 一种基本和原始的防御机制 ,主要包括 : 异物的识 别 、黏附 、摄入 、降解 、破坏 、清除 6 个阶段 [ 3 ] 。目 前 ,关于贝类血细胞分类 、噬菌作用 、亚显微结构 、 细 胞 生 化 等 已 有 报 道 。 Cheng 等 将 硬 壳 蛤 (M ercena ria m ercena ria) 的血细胞分为透明细胞 、 颗粒细胞 、和成纤维细胞三类 ,并发现当蛤在受细 菌刺激时 ,会使活跃吞噬的血细胞将溶酶体释放到 血清中 [ 425 ] 。孙虎山等将栉孔扇贝 ( Cham ys fa rreri) 血细胞分为 6类 ,对革兰氏阴性和阳性细菌均有吞 噬能力 [ 3, 627 ] 。Moore等对帘蛤血细胞的吞噬作用进 行了研究 ,结果显示 :帘蛤血细胞不仅对革兰氏阴 性和阳 性 细 菌 有 吞 噬 作 用 , 而 且 可 吞 噬 酵 母 细 胞 。 [ 8210 ]
有关泥蚶 ( Teg illa rca g ranosa L innaeus) 血 细 胞的显微结构 、耐饥能力和抗菌作用方面的研究 , 国内外均未见报道 。笔者通过吉姆萨染色显微观 察泥蚶血细胞噬菌作用以及不同饥饿状态下其形 态结构的变化 ,以期了解血细胞吞噬过程和机制以 及饥饿条件对血细胞形态结构的影响作用 ,为细胞 生物学和贝类免疫学研究提供基础 。
当贝类动物受到外界抗原物质刺激时 ,血细胞 主要表现为吞噬反应 ———能够清除细菌 、病原体 、 大分子物质及无机颗粒等 。本试验观察到泥蚶颗 粒细胞具有较强的吞噬能力 ,与孙虎山 [ 627 ]等人的
观点一致 。Oubella等观察到细菌可使蛤血淋巴中 颗粒细胞的数量显著增加 ,为贝类颗粒细胞具有较 强吞噬能力提供了证据 。由此可见 ,泥蚶血细胞吞 噬作用主要由颗粒细胞完成 。
细菌 ,然后细胞伸出伪足将细菌包围 ,形成吞噬泡 进入血细胞内部 。接着 ,血细胞通过不同的噬菌机 制 ,逐渐使细菌降解或破裂 (见图 2 ) 。由图 2 可 见 :一个血细胞可吞噬多个细菌 。吞噬作用后 ,血 细胞和菌体混合液中的细菌数量显著减少 ,细胞的 结构形态也发生较大变化 ,胞质色泽变浅 ,细胞呈 透明状 。由各种细菌噬菌现象的前后对照图可知 , 泥蚶血细 胞对大 肠杆 菌的 吞噬 率较 大 (图 223a, 3b) 。奥斯陆莫拉氏菌对血细胞的形态影响程度最 大 (图 221a, 1b) ,其次是脲放线杆菌 (图 222a, 2b)