太子参多糖的提取纯化及其单糖组分的鉴定

太子参多糖的提取纯化及其单糖组分的鉴定作者：王慧娟乔杨晏薇娜来源：《贵州大学学报（自然科学版）》2017年第03期文章編号1000-5269（2017）03-0025-05DOI：10.15958/ki.gdxbzrb.2017.03.06摘要：目的：通过提取纯化得到太子参精制多糖，并对其单糖组成进行鉴定分析。

方法：水提醇沉后的多糖采用Sevag法除去蛋白，再经Sephadex G￣100凝胶柱层析进一步纯化，透析冻干后制得纯度较高的精制多糖。

高温强酸条件下将多糖进行水解，加入1￣苯基￣3￣甲基￣5￣吡唑啉酮（PMP）溶液衍生化后采用HPLC法分析单糖组成。

结果：精制太子参多糖的含量为82.30%，主要由葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖等单糖组成。

结论：本研究可为太子参药材质量标准的提升完善提供基础。

关键词：太子参多糖；单糖组分；柱前衍生化；高效液相色谱法中图分类号：R284.1文献标识码： A太子参是我国传统中药材，为石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax ex Pax et Hoffm. 的干燥块根。

具有益气健脾、生津润肺的功效，用于脾虚体倦、食欲不振、病后虚弱、气阴不足、自汗口渴、肺燥干咳[1]。

随着人们对太子参研究的不断深入，其应用范围正日益扩大，原药材市场需求量逐年增加。

现代研究表明多糖是太子参的重要活性成份，太子参多糖具有降糖、降脂的作用，对小鼠的免疫功能也起到一定的作用，除此之外，有实验表明太子参多糖对东莨菪碱所致小鼠记忆障碍具有改善作用[2-7]。

本文采用水提醇沉法提取太子参中的多糖，经除蛋白、Sephadex G￣100凝胶柱纯化、透析后得到太子参精制多糖。

由于多糖成分无挥发性并缺少紫外特征吸收基团，难以用GC和HPLC进行分析检测[8]。

本文采用高温强酸水解的方法将太子参多糖水解为单糖[9]，利用PMP对其进行衍生化[10]，将衍生化产物用HPLC分析检测以确定单糖的组成，为太子参药材质控标准的提升完善提供研究基础。

1仪器与材料Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；UV￣5200型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；SHB￣88型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；FA2004 型电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）。

太子参药材（购买于贵州省安顺市百灵制药有限公司中药材基地）；1￣苯基￣3￣甲基￣5￣吡唑啉酮（PMP）（天津科密欧化学试剂有限公司）；Sephadex G￣100凝胶（GE Healthcare Bio￣Sciences AB）；葡萄糖购自成都植标化纯生物技术有限公司，含量≥98.0%；半乳糖购自solarbio公司，含量≥99.0%；鼠李糖、木糖均购自上海源叶生物科技有限公司，鼠李糖的含量≥98.0%、木糖含量≥99.0%；醋酸铵、苯酚、氯仿、氢氧化钠、硫酸、无水乙醇、正丁醇、浓盐酸均为分析纯，乙腈为色谱纯。

2方法与结果2.1太子参多糖的提取纯化2.1.1葡萄糖标准曲线的制备取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖59.8 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.598 mg/mL的葡萄糖对照品溶液。

精密量取对照品溶液2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL分别置100 mL容量瓶中，各加水至刻度，摇匀，精密量取上述溶液各2.0 mL，置于10 mL具塞试管中，另取2.0 mL蒸馏水作空白对照，各管加入4%苯酚试液1.0 mL（临用配制），摇匀，再迅速滴加浓硫酸7.0 mL，40℃水浴保温30 min，取出，冰浴5 min，于490 nm处测定吸光度。

以吸光度A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

结果葡萄糖在2.39～718 μg/mL范围内呈良好线性关系：A=01238C-01265（R2=0.9996）。

2.1.2粗多糖的提取取太子参粉（过60目）500 g，用10倍水加热回流提取3次，提取时间分别为3 h，2 h，1 h，提取液过滤，滤液合并，浓缩至适量，加入无水乙醇，使醇浓度达到80%以上，静置过夜，过滤，将沉淀反复用无水乙醇洗涤，挥去残留乙醇，沉淀加水溶解，加入Sevag试剂（正丁醇∶三氯甲烷=1∶4），充分震荡使蛋白质析出，以3000 r/min离心20 min，除去蛋白乳化层，取上清液重复以上操作，直至两相间无乳白色絮状物。

将上清液浓缩，冷冻干燥，得到太子参粗多糖。

2.1.3粗多糖的纯化取适量Sephadex G￣100凝胶，用蒸馏水室温浸泡24 h后，装柱，由柱上方加入粗多糖样品溶液（0.1 g/mL）1.0 mL，用蒸馏水洗脱，流速控制在7 d/min，以5 mL/管接取柱层析流出液，用苯酚￣硫酸法检测，从有颜色变化的试管开始编号，直至流出液用苯酚￣硫酸法检测无颜色。

随后将Sephadex G￣100凝胶柱用0.5 mol/L NaOH再生，用蒸馏水将凝胶洗脱呈中性，以备再次上样。

用苯酚￣硫酸法检测各试管内多糖含量时，取洗脱液适量，用蒸馏水补充至2.0 mL，按照“2.1.1 葡萄糖标准曲线的制备”项下，自“加入4%苯酚试液1.0 mL”起，同法操作，测定实验结果见表1。

以试管编号为横坐标，试管内洗脱液中多糖的浓度为纵坐标，绘制Sephadex G￣100凝胶柱的洗脱柱形图，见图2。

随后将浓度较高的流份进行合并，合并液经冷冻干燥，即得纯化多糖。

取纯化多糖0.1 g用1.0 mL蒸馏水溶解，再次用Sephadex G￣100凝胶柱纯化，按上述方法，自“用蒸馏水洗脱，流速控制在7 d/min”起，重复操作，实验结果见表2。

以试管编号为横坐标，试管内洗脱液中多糖的浓度为纵坐标，绘制洗脱柱形图，见图3。

同样将多糖含量高的流份合并，合并液冷冻干燥后，用少量去离子水溶解，装入透析袋中透析，除去其中的金属离子，再次冷冻干燥，即得到精制多糖。

2.1.4精制多糖的含量测定取精制多糖10 mg，置100 mL容量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。

精密量取1.0 mL，补充1.0 mL蒸馏水，置于10 mL具塞试管中，另取2.0 mL蒸馏水作空白对照，按照“2.1.1 葡萄糖标准曲线的制备”项下，自“加入4%苯酚试液10 mL”起，同法操作，测定吸光度值，计算精制多糖的含量为82.30%。

2.2太子参多糖中单糖组分的鉴定2.2.1色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB￣C18（46×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2 mol/L的乙酸铵溶液（19∶81）；检测波长：250 nm；流速：1 ml/min；柱温：35℃；进样量：10 μL。

2.2.2太子参多糖的水解取精制多糖0.01 g置于顶空瓶中，加入1.0 mL蒸馏水使之溶解，加入3.0 mol/L的盐酸溶液1.0 mL，封口，混匀，110℃水解30 min，放冷，氢氧化钠溶液中和，作为太子参多糖水解液备用。

2.2.3对照品溶液的制备取葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖适量，精密称定，用蒸馏水溶解，置于100 mL容量瓶中，配置成每种单糖的含量均为1 mg/mL的对照品混合溶液。

分别取葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、木糖适量，精密称定，分别置100 mL容量瓶中，各加水溶解并稀释至刻度，配置成含量均为1 mg/mL的4种对照品溶液。

2.2.4衍生化反应分别吸取多糖水解液、对照品混合溶液以及4种单糖对照品溶液各1.0 mL，依次加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液和0.2 mol/L的氢氧化钠溶液各0.5 mL，混匀，70℃水浴100 min，冷却，用0.2 mol/L的盐酸溶液中和，加入2.0 mL氯仿离心，弃下层，重复3次，将上清液用微孔滤膜过滤，取续滤液05 mL备用。

2.2.5太子参多糖中单糖的鉴定多糖水解液、对照品混合溶液、空白溶剂以及各种单糖对照品溶液衍生化后分别进样，所得色谱图如下。

由图4可知，太子参多糖主要由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖组成。

3小结本实验首先对太子参多糖的提取纯化进行研究，主要采用水提醇沉法提取太子参中的多糖，并用sevag法除蛋白制得粗多糖，再经Sephadex G￣100凝胶柱层析对粗多糖进一步纯化。

由于多糖在紫外下没有吸收，故辅以苯酚￣硫酸法检测，合并高浓度的多糖，再用透析膜除去其中金属离子得到太子参精制多糖，经测定精制多糖含量达80%以上。

由于Sephadex G ￣100凝胶柱层析每次上样量有限，所以需多次反复操作，才能制备足量的精制多糖，为后续太子参多糖的水解及其单糖的鉴定提供充足的实验原料。

本研究采用酸水解法将所制得的太子参多糖进行水解，此法操作简单，可以将多糖彻底水解。

但在实际操作中发现多糖水解会受到酸的浓度、水解时间以及水解温度等因素的影响。

因此，本文对上述因素进行了考察，最终确定当盐酸的浓度为3 mol/L、110℃条件下水解30 min 时，多糖水解物的衍生化产物用HPLC法测定时，各种单糖的峰面积最大，表明水解完全。

本实验采用柱前衍生化￣HPLC法确定了太子参多糖主要由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖以及木糖组成。

为了确保单糖能够完全被衍生化，在对单糖以及太子参多糖水解物进行衍生化反应时，本研究加入了过量的PMP溶液，所以衍生化后PMP仍有残留，从HPLC色谱图中发现仍有PMP峰出现。

在本文研究成果的基础上，后续可建立太子参药材中多糖及单糖的含量测定方法，从而为今后太子参药材质控标准的提升完善提供依据。

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