低变性温度共扩增PCR及其衍生技术的研究进展
PCR衍生技术的原理和应用
PCR衍生技术的原理和应用一、PCR的原理PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种在体外扩增DNA片段的技术，其原理是通过反复进行DNA的复制，最终得到大量目标DNA片段。
PCR的原理主要包括以下几个步骤： 1. 反应体系的配制：PCR反应需要包含DNA模板、引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和聚合酶等关键成分。
2. Denaturation（变性）：将PCR反应体系加热至95℃，使DNA双链解开，得到单链DNA。
3. Annealing（退火）：将PCR反应体系温度降至50-65℃，使引物与DNA的互补序列结合。
4. Extension（延伸）：将PCR反应体系温度升至72℃，聚合酶将新的DNA链合成。
5. 重复步骤2-4：以上三步循环反复进行，使DNA分子指数级增加。
PCR的原理基于DNA的双链结构可变性和DNA聚合酶的体外聚合能力，能够在短时间内扩增目标DNA片段。
二、PCR的应用PCR技术已经广泛应用于许多领域，包括医学、生物学、法医学和环境科学等。
下面列举了PCR在不同领域的应用：1.分子诊断•PCR在临床诊断中的应用：PCR技术可以检测病原体、基因突变和单倍体多态性等，用于疾病的早期诊断和基因型鉴定。
•PCR在遗传疾病筛查中的应用：PCR可以检测染色体缺陷、遗传突变和基因变异等，有助于遗传疾病的筛查和诊断。
2.基因工程和遗传学研究•PCR在基因克隆中的应用：PCR可以从复杂的基因组中扩增目标基因，为基因克隆提供模板DNA。
•PCR在DNA指纹技术中的应用：PCR技术可以扩增特定的重复序列，用于DNA指纹图谱的构建和个体鉴定。
•PCR在基因表达研究中的应用：PCR可以检测基因的表达水平和转录变异，从而揭示基因功能和调控机制。
3.药物研发•PCR在药物快速筛选中的应用：PCR技术可以高通量地检测药物对特定基因的影响，用于快速筛选药物靶点和药效评价。
4.环境监测•PCR在微生物污染监测中的应用：PCR技术可以快速检测环境中的微生物污染，例如水源、土壤和食品中的致病菌。
低温变性下复合PCR技术及其应用
Hereditas (Beijing) 2018年3月, 40(3): 227―236 收稿日期: 2017-11-06; 修回日期: 2018-02-02基金项目:深圳市三名工程-出生缺陷防治研究与转化团队(编号：SZSM201406007)，深圳市出生缺陷重点实验室(编号：ZDSYS201504301707152)和深圳市宝安区医疗卫生基础研究项目(编号：2014067，2017JD001)资助[Supported by Sanming Project of Medicine in Shenzhen-Brith Defects Prevention Research and Transformation Team (No. SZSM201406007), Shenzhen Key Laboratory of Birth Defects (No. ZDSYS201504301707152and Science and Technology Plan Project of Baoan District (Nos. 2014067, 2017JD001)]作者简介: 梁卉，硕士，主管技师，研究方向：出生缺陷疾病的遗传学研究。
E-mail: lianghui2016615@陈国杰，博士，主治医师，研究方向：染色质结构和表观遗传调控。
E-mail: chenguojie.hi@梁卉和陈国杰并列第一作者。
通讯作者:熊礼宽，博士，研究员，研究方向：出生缺陷防治与研究。
E-mail: xionglk@DOI: 10.16288/j.yczz.17-369 网络出版时间: 2018/2/8 11:31:42URI: /kcms/detail/11.1913.R.20180208.1131.001.html综 述低温变性下复合PCR 技术及其应用梁卉1,2，陈国杰3，于燕4，熊礼宽1,21. 暨南大学附属深圳市宝安区妇幼保健院中心实验室，深圳 5181022. 深圳市出生缺陷重点实验室，深圳 5181023. 郑州大学附属第一医院消化科，郑州 4500524. 暨南大学附属深圳市宝安区妇幼保健院产科，深圳 518102摘要: 低温变性下复合PCR(co-amplification at lower denaturation temperature-polymerase chain reaction, COLD-PCR)是一种在高丰度野生型序列背景下选择性变性和扩增低丰度突变型序列的方法，可将突变型序列富集10~100倍。
PCR变性,退火,延伸
PCR变性,退火,延伸一、背景PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，通过反复循环的DNA扩增步骤，能够迅速产生大量特定DNA片段。
然而，PCR反应中的高温循环可能导致DNA 的变性，影响PCR的效果。
为了克服这一问题，科学家们开展了各种方法，其中包括退火和延伸步骤。
二、PCR反应中的变性PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA的双链结构通过高温被解开成两条单链。
这是为了使DNA的两条链能够参与下一步的退火和延伸反应。
变性过程中，高温会造成DNA的氢键断裂，使双链结构解开。
这样，DNA的两条链就可以参与下一步的退火和延伸反应。
然而，高温也会导致DNA的链断裂和碱基失活，从而影响PCR反应的效果。
因此，在PCR反应中，变性的温度和时间需要严格控制，以保证DNA的完整性和稳定性。
三、退火步骤在退火步骤中，PCR反应体系的温度会降低，使引物（引导DNA扩增的短DNA片段）能够与目标DNA序列特异性地结合。
引物结合的温度一般为低于目标序列的熔解温度，以确保引物与目标序列稳定结合。
退火步骤通常是PCR反应中最关键的步骤之一。
它决定了引物与目标序列的特异性结合，从而决定了扩增产物的选择性和PCR反应的效率。
四、延伸步骤在延伸步骤中，DNA聚合酶通过引物在目标序列上的定位开始合成新的DNA链。
此过程需要一个适当的温度范围，使DNA聚合酶在引物的引导下能够稳定地合成新的DNA链。
延伸步骤的温度通常比退火步骤高，以保证DNA聚合酶的活性和效率。
同时，延伸时间也需要根据DNA片段的长度进行合理调整，以保证足够的扩增产物生成。
五、总结PCR变性、退火和延伸是PCR反应中的关键步骤。
变性步骤使DNA的双链解开为单链，以供退火和延伸步骤使用。
在退火步骤中，引物与目标序列特异性结合，决定了扩增产物的选择性和PCR反应的效率。
延伸步骤中，DNA聚合酶在适当的温度下合成新的DNA链，生成PCR扩增产物。
PCR技术的基本原理和过程变性实验报告结果
PCR技术的基本原理和过程变性实验报告结果摘要本文旨在探讨PCR（聚合酶链式反应）技术的基本原理和过程，以及变性实验的报告结果。
PCR技术是一种常用于体外合成和扩增DNA片段的方法。
通过PCR技术的原理和步骤的介绍，我们可以更好地理解PCR技术的应用和局限性。
在实验报告结果中，我们描述了PCR过程中DNA的变性和变性试验结果的分析。
介绍PCR技术是一种体外扩增DNA片段的方法，它是由银行衍生的一种复制机制。
PCR 技术的发现和发展在分子生物学和基因工程领域起到了重要的推动作用。
PCR技术的基本原理是通过循环性反应在体外进行DNA片段的扩增，这种反应是由聚合酶催化的。
PCR技术的基本原理PCR技术主要包括三个步骤：变性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Extension）。
变性变性步骤是将DNA双链分离为两个单链的过程。
该步骤需要在较高的温度下进行，以确保DNA双链被完全分开。
分离的过程主要是由于高温对DNA的双键结构产生破坏作用。
退火退火步骤是将引物与已变性的DNA片段结合的过程。
引物是一段小的DNA序列，它是为了将扩增反应限制在特定的DNA片段上而设计的。
退火的温度要低于变性步骤的温度，以确保引物与目标DNA序列的互补结合。
延伸延伸步骤是在合成的引物的作用下，通过聚合酶催化的反应在DNA片段的末端合成新的DNA链。
在延伸的过程中，聚合酶利用游离的核苷酸以及DNA模板，合成与模板DNA相互补的新链。
变性实验报告结果实验方法我们选择了一个特定的DNA片段作为实验对象，并使用PCR技术进行扩增。
实验步骤如下：1.准备PCR反应体系，包括引物和DNA模板。
2.进行PCR反应，包括变性、退火和延伸步骤。
3.将PCR产物进行电泳分析。
4.分析电泳图像并得出结论。
实验结果我们的实验结果表明，经过PCR反应后，我们成功扩增了目标DNA片段。
电泳分析结果显示，在PCR反应后产生了一个清晰的DNA条带，该DNA条带的大小与我们预期的目标DNA片段大小相符。
PCR及其衍生技术
PCR的用途
体外扩增特异DNA片段的技术，能快速、特 异地扩增目的DNA片段。 能通过试管内的数小时反应将特定的DNA 片段扩增数百万倍。 迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生 物学研究提供了强大的工具。
发展历程
1953 年 ， Watson 和 Crick 提 出 DNA 双 螺 旋 结构及半保留复制模型。 1958年，Meselson和Stahl用实验证实DNA 半保留复制模型。 70年代以来，人们采用两种思路去尝试建 立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技 术，二是体外扩增技术。
⑥ 减少循环次数；
⑦ 热启动（Hot Start）。即首先将模板变性，然后 在 较 高 温 度 时 加 入 Taq DNA 聚 合 酶 、 引 物 及 MgCl2等一些重要成分，这样使得引物在较高温 度下与模板退火，提高了反应的严谨性，使扩增 更特异；
⑧ 采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来提高 扩增的特异性。
③ 延伸温度与时间：
• Taq DNA聚合酶的生物学活性： 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时，DNA合成几乎不能进行
③ 延伸温度与时间：
• 延伸温度：一般选择在70～75℃之间
– 常用温度为72℃ – 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
• 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定
– 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） – 3～4kb的靶序列需3～4min – 扩增10kb需延伸至15min
• 延伸时间过长会导致非特异性扩增 • 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些
2、循环次数
• 循环次数
PCR技术及其发展和应用
重复30轮后 30 轮扩增 第6轮扩增 2 第5=1,073,741,824 实际拷贝数 =(1+x) 30 1.85 =103,550,417
n 循环次数 n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数
理想拷贝数=2n
PCR技术简史
• 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明 • PCR的完善
引物设计
引物设计常用软件主要有：
Primer Premier 5.0
Oligo 6
primer 3
The Primer Generator
Net Primer
1. 将序列输入软件中
两个方法
（1）新序列
（2）在表中 粘贴序列
（2）打开 原有的序 列文件
选择序列文 件所在位置
在对话框中输入待扩增序列 点击左上角的“Primer”按钮
PCR技术及其发展 和应用
检验系临床生化教研室
主要参考书
1. CW迪芬巴赫 、GS德弗克斯勒［美］主 编 。《PCR技术实验指南》
2. 黄留玉主编。《PCR最新技术原理、方 法及应用》 3. 尹一兵主编。《分子诊断学》
目
录
PCR技术的原理 PCR技术的衍生技术 实时荧光PCR技术 PCR技术的应用
3
5 3 6
OPC
PAGE OPC PAGE
3.20/base
5.80/base 4.60/base 10.00/base
4
7 5 5 5
OPC
PAGE OPC PAGE PAGE
8.00/base
询价 询价 3.50/base 5.00/base
（3）耐热DNA聚合酶
pcr延伸过程
PCR延伸过程PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于DNA的扩增和检测。
它是通过逐渐延伸DNA片段来产生大量的DNA分子。
本文将介绍PCR的延伸过程。
PCR延伸过程主要包括三个步骤：变性、连接和延伸。
变性PCR反应的第一个步骤是变性，这个步骤主要是使DNA的双链解开成为单链，使DNA具备了扩增的条件。
在变性的过程中，PCR反应液的温度一般升至94-98℃，这样高温能够破坏DNA的氢键，使DNA双链分离为两条单链。
这个步骤也被称为“变性”或“解链”反应。
连接PCR反应的第二个步骤是连接，即引入引物。
引物是PCR反应中的两个短单链DNA 片段，它们会特异性地与待扩增的DNA序列的两端互补配对。
引物的作用是为延伸反应提供一个起始点。
在连接的过程中，PCR反应液的温度一般会降至50-65℃，使引物与DNA序列发生互补配对。
延伸PCR反应的第三个步骤是延伸，也被称为扩增或合成步骤。
在延伸的过程中，PCR 反应液的温度一般会升至72℃，这是因为在此温度下，常用的PCR聚合酶（如Taq聚合酶）的最佳工作温度。
在延伸过程中，PCR聚合酶使用单链DNA为模板，将其与dNTP （脱氧核苷酸三磷酸）结合，通过DNA链合成作用，在引物的基础上合成出新的DNA 链。
延伸步骤会持续进行多轮，每一轮都会在前一轮扩增产物的基础上产生更多的DNA 分子。
这样反复进行多轮延伸，就能够获得大量的目标DNA。
在PCR的延伸过程中，需要注意保持PCR反应液的各种成分的浓度和适宜的温度。
此外，反应液的pH也是影响PCR反应的一个重要因素。
不同的引物序列和PCR聚合酶也会对PCR的效果产生影响。
总结一下，PCR的延伸过程包括变性、连接和延伸步骤。
通过这一过程，我们可以在短时间内获得大量的DNA分子。
PCR技术的快速、高效和高灵敏度使其成为现代生物学研究和临床诊断中不可或缺的工具。
以上就是PCR延伸过程的简要介绍，希望能对您有所帮助！。
pcr衍生技术的原理与应用
PCR衍生技术的原理与应用1. 简介PCR (Polymerase Chain Reaction) 是一种生物技术方法，可以在实验室中迅速复制DNA片段。
PCR衍生技术是PCR技术的一种应用，它通过PCR反应产生的DNA片段进行进一步的分析和应用。
本文将介绍PCR衍生技术的原理和常见的应用。
2. PCR衍生技术的原理PCR衍生技术的原理和PCR技术的原理基本相同，只是在PCR反应的基础上进行了进一步的操作和分析。
下面是PCR衍生技术的原理：2.1. PCR反应PCR反应是PCR衍生技术的起点，它包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。
在PCR反应中，通过一个特定的引物序列在DNA模板上进行多次循环的扩增，从而复制出大量的目标DNA片段。
2.2. PCR衍生技术在PCR反应中产生的DNA片段可以用于多种PCR衍生技术，包括但不限于以下几种：•限制性片段长度多态性（RFLP）分析：通过PCR反应产生的DNA 片段可以被限制性内切酶切割成不同长度的片段，然后使用凝胶电泳分离这些片段，从而得到不同样品之间的差异。
•序列特异性扩增反应（PCR-SSP）：通过PCR反应可以扩增出具有特定DNA序列的片段，然后可以使用简单的凝胶电泳等方法来分析不同样品中特定DNA序列的有无。
•分析重复序列（STR）：PCR反应在重复序列周围产生可变长度的DNA片段，通过测量这些片段的长度差异，可以实现个体间的DNA分型，用于鉴定、亲子关系确认等。
•倒转录聚合酶链反应（RT-PCR）：PCR反应与逆转录酶联合反应，可以将RNA转录成DNA，从而实现对RNA的扩增和分析。
3. PCR衍生技术的应用PCR衍生技术在生物医学研究、遗传学、生物学、医学检测等领域广泛应用。
以下是一些常见的应用：3.1. 遗传病检测PCR衍生技术可以用于检测许多遗传病的基因突变或缺陷。
通过PCR-SSP、RFLP等技术，可以确定个体是否携带特定的突变基因，从而为遗传病的诊断和预测提供依据。
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低变性温度共扩增PCR及其衍生技术的研究进展王清【摘要】低变性温度共扩增PCR(COLD-PCR)技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、成本低廉等优点.该技术及其衍生技术能够优先富集高野生背景下已知或未知的少量突变,在肿瘤个体化诊断、无创性产前诊断、HBV基因型耐药监测等领域具有广泛的应用前景.本文对此类技术及应用进展作一综述,旨在为其临床及实验室应用提供参考.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2016(034)002【总页数】4页(P140-143)【关键词】低变性温度共扩增PCR;突变;检测【作者】王清【作者单位】福建医科大学第一临床医学院,福州350005【正文语种】中文【中图分类】R446.9目前，用于临床突变检测的分子诊断技术很多，包括Sanger 测序法、线性反向探针杂交技术(INNO-LiPA法)、限制性片断长度多态性分析等，但这些技术普遍存在灵敏度较低(一般为5%～20%)的缺点。
临床上常用的Sanger 测序法检测 HBV 耐药突变时，只有当突变型HBV比例>20%才可检出，即灵敏度仅为20%，因无法发现低比例的早期耐药突变，使慢性乙型肝炎患者无法获得及时的药物调整，最终导致病毒学和血清学发生改变[1]。
研究表明，Sanger测序法对使用拉米夫定后临床怀疑耐药却未检出突变患者的检测灵敏度较低，应选用灵敏度较高的方法，如等位基因特异性实时荧光定量PCR(RT-ARMS-qPCR)，才可检出YVDD或YIDD 突变[2-3]。
因此，研发具有高灵敏度的突变检测方法，并促进其在临床推广应用实属必要。
近年来出现的低变性温度共扩增PCR(Co-amplification at lower denaturation temperature-PCR，COLD-PCR)具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，且能够优先富集高野生背景下已知或未知的少量突变，且对突变类型和突变位置无特殊要求[4]。
相对传统PCR而言，COLD-PCR仅需调整循环条件和变性温度即可极大提高检测的灵敏度，因此具有广泛的临床应用前景。
COLD-PCR是基于杂合DNA双链存在碱基不匹配导致其稳定性下降的原理，在关键变性温度(Tc)下能选择性扩增含有突变的杂合DNA双链，而抑制纯野生型DNA双链的扩增。
该技术的关键点是Tc值的确定：首先确定产物的熔解温度(Tm)；再选定一个Tx值(Tx代表测试和调整的温度，初始Tx值一般高于Tm值1～2 ℃)，以Tx值为基础进行一系列温度递减的PCR(每次降低0.5～1 ℃)，当温度降至PCR反应不能检测到产物时，该温度的前1个温度即为Tc值。
DNA序列中单个核苷酸的改变会导致Tc值的变化，杂合DNA双链的变性温度低于纯合DNA双链；基于此，COLD-PCR通过设置Tc值为DNA的变性温度，实现从高野生型DNA模板中富集低浓度的DNA突变。
COLD-PCR分为完全COLD-PCR (full-COLD-PCR )和快速COLD-PCR(fast-COLD-PCR)，两者各有优势，前者可富集所有突变，后者只能富集Tm值下降的突变，但后者比前者操作简便，在实际应用中可根据不同的需要对两者进行选择。
COLD-PCR通过富集少量已知和未知突变，极大提高下游检测技术(高分辨率熔解曲线、Sanger测序法、TaqMan探针等)的灵敏度，实现了对少量突变的高灵敏度检测。
在此基础上，由传统COLD-PCR改良的ice-COLD-PCR(improved andcomplete enrichment COLD-PCR)及TT-COLD-PCR(Temperature-tolerant COLD-PCR)技术可实现对突变位点的多重检测，进一步体现了其在分子诊断中的应用优势。
以下对此两种技术原理及优缺点。
2.1 改良型完全富集COLD-PCR(improved and complete enrichment COLD-PCR, ice-COLD-PCR) 是基于传统COLD-PCR的ice-COLD-PCR技术，其在循环中引入一条3′去磷酸化的野生型特异性寡核苷酸参考序列(reference sequence，RS)，同时，此序列比目的扩增子稍短以确保其在循环中不扩增，在扩增的早期阶段RS与突变型扩增子形成杂合双链，在Tc循环条件下杂合双链优先变性扩增，而野生型纯合双链扩增被抑制；其热循环过程类似于完全COLD-PCR，但比后者富集能力更佳，可将突变模板比例提高至50%以上，该方法检测灵敏度达到0.1%[4-6](图1)。
Alexandre等[7]基于ice-COLD-PCR建立了E-ice-COLD-PCR(Enhanced-ice-COLD-PCR)，该方法在RS序列中引入锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)，在缩短RS序列的同时保证其高Tm值，显著提高该方法的特异性；同时该方法具有标本用量少，操作简便等优势。
2.2 温度耐受性COLD-PCR(Temperature-tolerant COLD-PCR,TT-COLD-PCR) 该技术在传统COLD-PCR基础上，对Tc值做一个2.5～3 ℃的温度梯度，在每个Tc值下完成一个COLD-PCR循环，保证一定Tm值(Tm值相差2.5～3 ℃)范围内的突变型模板优先扩增，突破了传统COLD-PCR严格的Tc值限制[Tc值在±(0.2～0.3 ℃)]，实现对所有突变模板的富集[8]。
经实验证明，此种温度耐受的条件在所有形式的COLD-PCR均能实现(full、fast、ice-COLD-PCR)，同时通过加入二甲基亚砜(DMSO)可解决Tm值范围过宽的问题。
然而，该方法相对传统COLD-PCR而言，其富集突变模板的量较少，且由于循环数的增加易形成引物二聚体以及反复的变性易使聚合酶失活而导致扩增效率的下降。
基于上述缺陷， Milbury等[9]发明了一种新型TT-fast-eCOLD-PCR(Temperature-Tolerant- fast-COLD-PCR in Emulsion)技术，其PCR反应在油水乳化液中进行，由于引物对间相互作用减弱，避免了引物二聚体的形成。
Castellanos-Rizaldos等[10]基于TT-COLD-PCR建立了多重fast-TT-COLD-PCR技术，该技术通过使用寡核酸“尾巴”经平末端连接反应连接到所有预扩增的DNA扩增子的两端，修饰后的扩增子经通用引物即可完成突变的富集。
其优势为通过在PCR反应中引入修饰的核苷酸(dITP/dDTP代替dGTP/dATP)能够富集Tm值升高的突变，富集效率与full-COLD-PCR相一致。
目前，COLD-PCR及其衍生技术与高分辨率熔解曲线(HRM)分析、TaqMan探针、Sanger测序法等下游检测技术结合在肿瘤监测、无创性产前诊断、HBV基因型耐药检测等领域得到广泛应用。
3.1 COLD-PCR在肿瘤检测中的应用肿瘤患者体内存在的少量突变的识别和检测，对肿瘤起源和进化的理解，辅助肿瘤风险的评估、治疗方案的选择和疗效的监测等方面具有重要意义[11-12]。
COLD-PCR具有高灵敏度的优势，能显著提高下游检测技术的灵敏度。
例如COLD-PCR与HRM结合，用于检测肿瘤常见突变(TP53、KRAS、IDH1等)，其灵敏度比单一HRM提高了3～6倍，比Sanger测序法提高了100倍[8, 13-15]。
由于灵敏度获得了极大的提高，从而实现了对消化道常见肿瘤的少量突变(TP53、KRAS、IDH1、EGFR、H-ras)的检测，为阐明突变在促进肿瘤发生和发展、疾病诊断、个体化治疗和肿瘤预后中的作用提供了大量的证据[2, 11, 16-20]。
KRAS基因突变与许多肿瘤密切相关，包括肺癌、结肠癌、胰腺癌和造血系统肿瘤等。
EGFR和KRAS突变与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者对酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors，TKIs)的疗效密切相关。
EGFR突变的NSCLC患者与TKIs药效呈正相关，而KRAS突变的NSCLC患者与TKIs药效呈负相关[21]。
因此，EGFR和KRAS突变的早期检测对于药物的个体化治疗具有重要价值。
研究表明，COLD-PCR能显著提高EGFR 和KRAS等突变检测的灵敏度，可用于指导抗肿瘤药物的合理利用及探讨交界性肿瘤(介于良性和恶性之间的肿瘤)与癌症之间是否具有相关性[22-24]。
抑癌基因TP53编码的蛋白质是一个多功能的转录因子，其具有调控细胞生长、凋亡和DNA修复等功能，然而突变的TP53基因却与肿瘤的形成相关。
用TT-fast-eCOLD-PCR成功实现对TP53第6到第9外显子4个突变的早期多重检测，为癌症的早期诊断提供了有力的证据[9]。
少量W515突变的早期发现，对于骨髓增生性白血病早期阶段的诊断、提供预后信息、实现风险分层及调整治疗策略具有重要价值。
COLD-PCR结合微阵列芯片技术能显著提高W515突变检测的灵敏度(0.1%)，实现半定量，并可同时对多个样本进行分析，极大的提高了突变检测效率[25]。
肿瘤患者的标本来源困难且形式多样，限制了传统PCR的应用，而COLD-PCR 有望解决这一难题。
研究表明，用COLD-PCR技术对黑色素瘤患者BRAF V600突变进行检测，结果显示该技术对3种类型标本(冰冻切片、福尔马林固定石蜡包埋的标本、血浆)均能检测，其灵敏度为0.01%，该突变的早期发现对于黑色素瘤进展阶段的及时治疗和个体化用药具有重要意义[26-28]。
在肿瘤治疗期间，对患者液体标本中少量循环DNA突变的检测，为肿瘤患者的分子特征、诊断和药效学监测方面发挥着十分重要的作用。
Richardson等[29]用ice-COLD-PCR结合二代测序、数字PCR等对液体标本中少量突变进行检测，解决了标本中循环DNA过少和标本量不足的问题。
3.2 COLD-PCR在无创性产前诊断中的应用传统的绒毛膜取样、羊膜腔穿刺术等侵入性产前诊断对母体和胎儿的安全均构成威胁。
COLD-PCR对标本类型要求不高，对于传统PCR检测不出的突变标本(如标本含量不足或背景细胞过多)，COLD-PCR更能发挥其高灵敏度的优势，可在一定程度上解决临床标本来源困难的问题[5, 30-31]。
研究表明，COLD-PCR能在高母体血清DNA的背景下检测少量游离的胎儿DNA，两者结果具有良好的一致性，为无创性产前诊断提供了新的思路[30, 32]。
应用COLD-PCR对胎儿遗传性疾病进行筛查，在降低流产风险和孕后期检查伤害方面具有重要价值[5, 30]。