微生物多糖提取与纯化
酸性多糖微生物絮凝剂的提取、纯化与分析
物 絮凝 剂作 为一 种新 型 的絮凝 剂种 类 ， 因其 价廉 、 高 性物 质 的成分 。 效 、 毒 、 二 次污 染 、 凝 对 象 广泛 等优 点 逐 步 受 无 无 絮 ５ ０ｍＬ发 酵液 离心 ， ０ 上清 液减 压浓 缩 至 ５ Ｌ， ０ｍ
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第 ７卷 第 ｌ ２期
２ ６年 １ ０ ０ ２月
环 境 污 染 治 理 技 术 与设 备
Ｔｅ ｈｎｑｕ ｓ ａ ｕｉ ｃ ｉ ｅ ｎｄ Ｅｑ ｐｍｅ ｔｆｒＥｎ ｉｏ ｎ ｏ ｖｒ ｎｍｅ ｔｌＰｏｌ ｔ ｏｎ Ｃｏｎｔｏｌ ｎａ ｌｕ ｉ ｒ
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Ｖｏ ．７ ， １ Ｎｏ．１２
Ｄ ｃ．２００６ ｅ
酸 性 多糖 微 生物 絮凝 剂 的提 取 、 化 与 分析 纯
陈 盛 钱 伟２ 罗 志 敏 佘 晨 兴 马 秀玲
（ ．福 建 师 范 大 学 福 清 分 校 ， 清 ３０ ０ ２ １ 福 ５ ３０； ．福 建 师 范 大 学 地 理 科 学 学 院 ， 州 ３ ０ ０ ； 福 ５０ ７
３ ．福 建 师 范 大 学 化 学 与 材 料 学 院 ， 州 ３０ ０ ） 福 ５０ ７
摘 要 对 一 株链 球 菌发 酵 获 得 的 絮凝 活 性 物 质 进 行 了分 离 和提 取 ， 应 用 Ｄ Ａ ・ｅｈｄｘＡ ５ Ｓｐ ｄｒ ｅ Ｂ凝 胶 色 并 Ｅ ＥＳｐ ａｅ ２ ，ｅｈ ａｏ ｓ４
微生物多糖的研究进展
微生物多糖的研究进展生命科学技术学院08级2班杜长蔓摘要: 就微生物多糖的种类，生物合成、提取与纯化、实现了工业化的微生物多糖及其应用进行了综述, 展望了微生物多糖开发利用的前景。
微生物多糖主要指大部分细菌、少量的真菌和藻类产生的多糖。
微生物多糖由于具有安全性高、副作用小、理化特性独特等优点而使其在食品和非食品工业备受关注,尤其在医药领域具有巨大的应用潜力。
微生物多糖在细胞内主要有三种存在形式: ①黏附在细胞表面上,即胞壁多糖; ②分泌到培养基中,即胞外多糖; ③构成微生物细胞的成分,即胞内多糖。
而其中的胞外多糖具有产生量大、易于与菌体分离、可通过深层发酵实现工业化生产。
一般微生物多糖的生产主要是利用淀粉为碳源,经过微生物的发酵进行生产,也有通过利用微生物产生的酶作用制成的。
能够产生微生物胞外多糖的微生物种类较多,但是真正有应用价值并已进行或接近工业化生产的仅十几种。
近几年,随着对微生物多糖研究的深入,世界上微生物多糖的产量和年增长量在10 %以上,而一些新兴多糖年增长量在30 %以上。
到目前为止,已大量投产的微生物胞外多糖有黄原胶(Xant han gum) 、结冷胶( Gellan gum) 、小核菌葡聚糖(Scleeroglucan) 、短梗霉多糖( Pullulan) 、热凝多糖(Curdlan) 等。
微生物多糖和植物多糖相比较具有以下优势:①生产周期短,不受季节、地域、病虫害等条件的限制; ②具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景; ③应用广泛,例如已作为胶凝剂、成膜剂、保鲜剂、乳化剂等广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域。
据估计,目前全世界微生物多糖年加工业产值可达80 亿左右。
关键词: 微生物多糖; 生物合成; 提取与纯化;开发应用0引言多糖是一种天然的大分子化合物，来源于动物、植物及微生物，在海藻、真菌及高等植物中尤为丰富。
它是由醛糖和（或）酮糖通过糖苷键连接成的聚合物，作为有机体必不可少的成分，同维持生命体机能密切相关，具有多种多样的生物学功能。
1.多糖的提取方法
1.多糖的提取方法生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3大类。
多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。
动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，，多糖提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。
水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。
但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。
1．1．2酸提法为了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。
如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH值下难以溶解，可用乙酸或盐酸使提取液成酸性，再加乙醇使多糖沉淀析体是指物质处于临界温度和临界压力以上时的状态，这种流体兼有液体和气体的特点，密度大，粘稠度小，有极高的溶解，渗透到提取材料的基质中，发挥非常有效的萃取功能。
而且这种溶解能力随着压力的升高而增大，提取结束后，再通过减压将其释放出来，具有保持有效成分的活性和无溶剂残留等优点。
由于CO2的超临界条件（TC＝304．6℃，Tp＝7．38MPa）容易达到，常用于超临界萃取的溶剂，在压力为8～40MPa时的超临界CO2足以溶解任何非极性、中极性化合物，在加入改性剂后则可溶解极性化物。
壁内的活性多糖，多糖释放的多少和复合酶的加入量、酶解温度、酶解时间、酶解pH值有直接的关系。
酶解法提取的实质是通过酶解反应强化传质过程。
此法具有条件温和、杂质易除和得率高等优点。
1．3物理强化法1．3．1微波辅助提取法微波萃取是高频电磁波穿透萃取媒质，到达被萃取物料的内部，能迅速转化为热能使细胞内部温度快速上升，细胞内部压力超过细胞壁承受力，细胞破裂，细胞内有效成分流出，在较低的温度下溶解于萃取媒质，通过进一步过滤和分离，获得萃取物料。
多糖的提取分离方法
1.多糖的提取方法生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类。
多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否做预处理。
动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂，释放多糖。
植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前，应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。
1．1溶剂法1．1．1水提醇沉法水提醇沉法是提取多糖最常用的一种方法。
多糖是极性大分子化合物，提取时应选择水、醇等极性强的溶剂。
用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提渗滤，然后将提取液浓缩后，在浓缩液中加乙醇，使其最终体积分数达到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性质，使多糖从提取液中沉淀出来，室温静置5 h，多糖的质量分数和得率均较高。
影响多糖提取率的因素有：水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。
水提醇沉法提取多糖不需特殊设备，生产工艺成本低，安全，适合工业化大生产，是一种可取的提取方法。
但由于水的极性大，容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来，从而使提取液存放时腐败变质，为后续的分离带来困难，且该法提取比较耗时，提取率也不高。
1．1．2酸提法为了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。
如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH 值下难以溶解，可用乙酸或盐酸使提取液成酸性，再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。
由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高，但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂，且酸会对容器造成腐蚀，除弱酸外，一般不宜采用。
因此酸提法也存在一定的不足之处。
1．1．3碱提法多糖在碱性溶液中稳定，碱有利于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，缩短提取时间，但提取液中含有其它杂质，使粘度过大，过滤困难，且浸提液有较浓的碱味，溶液颜色呈黄色，这样会影响成品的风味和色泽。
多糖提取实验报告
一、实验目的1. 了解多糖的基本概念、性质和分类；2. 掌握多糖提取的基本原理和实验方法；3. 学习利用水提法、醇沉法等方法提取多糖；4. 掌握多糖的纯化、鉴定和含量测定方法。
二、实验原理多糖是一类由单糖分子通过糖苷键连接而成的天然高分子化合物，广泛存在于植物、动物和微生物中。
多糖具有多种生物活性，如免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗病毒等。
本实验主要采用水提法、醇沉法等方法提取多糖，并对其纯化、鉴定和含量进行测定。
三、实验材料1. 实验材料：植物样品（如玉米、小麦、胡萝卜等）；2. 实验试剂：蒸馏水、乙醇、丙酮、苯酚、硫酸、蒽酮、葡萄糖标准品等；3. 实验仪器：组织捣碎机、离心机、分光光度计、磁力搅拌器、容量瓶、移液管、试管等。
四、实验方法1. 植物样品预处理：将植物样品洗净、晾干、磨碎，过筛，得到植物粉末。
2. 水提法提取多糖：（1）称取一定量的植物粉末，加入适量的蒸馏水，搅拌均匀；（2）在80℃条件下加热提取2小时；（3）冷却后，用离心机分离溶液和沉淀；（4）取上清液，加入乙醇，使多糖沉淀；（5）离心分离，收集沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀，干燥，得到粗多糖。
3. 醇沉法提取多糖：（1）称取一定量的植物粉末，加入适量的蒸馏水，搅拌均匀；（2）在80℃条件下加热提取2小时；（3）冷却后，用离心机分离溶液和沉淀；（4）取上清液，加入丙酮，使多糖沉淀；（5）离心分离，收集沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀，干燥，得到粗多糖。
4. 纯化多糖：（1）将粗多糖溶解于适量的蒸馏水中；（2）加入适量的苯酚，使多糖与苯酚形成复合物；（3）离心分离，收集沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀，干燥，得到纯多糖。
5. 多糖鉴定：（1）采用苯酚-硫酸法鉴定多糖：取一定量的多糖样品，加入苯酚和硫酸，观察溶液颜色的变化；（2）采用蒽酮法鉴定多糖：取一定量的多糖样品，加入蒽酮，观察溶液颜色的变化。
6. 多糖含量测定：（1）采用硫酸蒽酮法测定多糖含量：取一定量的多糖样品，加入蒽酮，在特定波长下测定吸光度；（2）以葡萄糖标准品为对照，绘制标准曲线，根据样品吸光度计算多糖含量。
多糖的提取分离方法
1、多糖的提取方法生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖3 大类。
多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位,决定在提取之前就是否做预处理。
动物多糖与微生物多糖多有脂质包围,一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液进行回流脱脂,释放多糖。
植物多糖提取时需注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类,在提取前,应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理,目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等。
1.1溶剂法1.1.1水提醇沉法水提醇沉法就是提取多糖最常用的一种方法。
多糖就是极性大分子化合物,提取时应选择水、醇等极性强的溶剂。
用水作溶剂来提取多糖时,可以用热水浸煮提取,也可以用冷水浸提渗滤,然后将提取液浓缩后,在浓缩液中加乙醇,使其最终体积分数达到70 %左右,利用多糖不溶于乙醇的性质,使多糖从提取液中沉淀出来,室温静置 5 h,多糖的质量分数与得率均较高。
影响多糖提取率的因素有:水的用量、提取温度、浸提固液比、提取时间以及提取次数等。
水提醇沉法提取多糖不需特殊设备,生产工艺成本低,安全,适合工业化大生产,就是一种可取的提取方法。
但由于水的极性大,容易把蛋白质、苷类等水溶性的成分浸提出来,从而使提取液存放时腐败变质,为后续的分离带来困难,且该法提取比较耗时,提取率也不高。
1.1.2酸提法为了提高多糖的提取率,在水提醇沉法的基础上发展了酸提取法。
如某些含葡萄糖醛酸等酸性基团的多糖在较低pH 值下难以溶解,可用乙酸或盐酸使提取液成酸性,再加乙醇使多糖沉淀析出,也可加入铜盐等生成不溶性络合物或盐类沉淀而析出。
由于H＋的存在抑制了酸性杂质的溶出,稀酸提取法提取得到的多糖产品纯度相对较高,但在酸性条件下可能引起多糖中糖苷键的断裂,且酸会对容器造成腐蚀,除弱酸外,一般不宜采用。
因此酸提法也存在一定的不足之处。
1.1.3碱提法多糖在碱性溶液中稳定, 碱有利于酸性多糖的浸出,可提高多糖的收率,缩短提取时间,但提取液中含有其它杂质,使粘度过大,过滤困难,且浸提液有较浓的碱味,溶液颜色呈黄色,这样会影响成品的风味与色泽。
黑木耳多糖的提取与纯化
验,发现保持小苗周围空气湿润,通气良好且保湿良好的栽培基质和适宜的温度是丽格海棠试管苗移栽成功的关键[7]。
3 小结311 试验结果表明:最佳愈伤组织及分化培养基为:①MS +K T 1.00mg ΠL +NAA0.10mg ΠL ;②MS +6-BA 0.50mg ΠL +2,4-D0.10mg ΠL ;③MS +6-BA 1.00mg ΠL +NAA 0.10mg ΠL ;④MS +6-BA 0.50mg ΠL +NAA 0.10mg ΠL ;继代增殖以同样的培养基为好。
生根培养以在1Π2MS +NAA0.50mg ΠL 和1Π2MS +I BA 0.10mg ΠL 培养基上的效果最好[10]。
312 从试验中注意到,在四个花色品种中易成苗的依次为粉色品种、橙色品种、黄色品种红色品种,对此需进一步研究[10]。
313 将不同外植体分别接种于不同的培养基上,培养1w 后,茎尖外植体首先明显膨大,长出愈伤组织块;3w 后,叶片外植体绝大多数都长出了愈伤组织块。
愈伤组织继续长大,呈黄绿色,颗粒状,较疏松.观察发现3种不同外植体都能被诱导出愈伤组织,只是茎尖最容易脱分化,叶柄次之。
这2种外植体脱分化诱导率均为100%;叶片的诱导率也达到88.3%。
这表明叶片组织分化强度和叶柄与茎尖组织的分化程度差别不大,这与远凌威等人的报道略有不同,需要进一步研究。
参考文献:[1]达克东,张松,姜璐琰,等.丽格海棠离体叶片培养不定芽发生和微繁研究[J ]1山东农业大学学报(自然科学版),2002,33(1):93-951[2]王利琳,庞基良,胡江琴.丽格海棠的离体快繁[J ]1生物技术,2001,11(5):46-481[3]林德钦,李梅,张文珠.富丽华贵的丽格海棠[J ]1厦门华侨亚热带植物引种园,2001,621[4]杜启兰,宋仪农.丽格海棠的微体快速繁殖[J ]1山东林业科技,2002,(5):16-171[5]田代科,管开云,郭瑞贤,等.变色秋海棠的繁殖栽培[J ]1广西植物,2001,21(4):375-3801[6]周鑫,韩建军.丽格海棠的组织培养[J ]1中国林副特产,2001,2(1):471[7]石贵玉,邓欢爱,周巧劲.高压静电场对蟆叶秋海棠愈伤组织生长的效应[J ]1广西科学,1999,6(4):296-2981[8]李景秀,管开云,孔繁才1长翅秋海棠的叶片培养和快速繁殖[J ]1植物生理学通讯,2000,36(5):439-4401[9]王发林,赵秀梅,刘芬.丽格海棠的叶片离体培养技术[J ]1甘肃农业科技,2001,(5):46-471[10]远凌威,袁正仿,张苏锋.丽格海棠的组织培养与快速繁殖研究[J ]1信阳师范学院学报(自然科学版),2002,15(2):219-2211黑木耳多糖的提取与纯化孔祥辉1,2,张介驰2,戴肖东2,李景鹏13(11东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030;21黑龙江省科学院应用微生物研究所,黑龙江哈尔滨150010)摘要:黑木耳干子实体经复合酶解结合热水浸提法提取,超过滤,鞣酸法去蛋白,DE AE -52和Sephacryl S -400分子筛柱层析纯化得到精多糖(AAP1)。
多糖提取与纯化技术应用进展
作者简介：朱晓霞（１９８２－），女（汉），硕士研究生，从事天然生物大分子研究。
糖类物质是地球上数量最多的一类有机化合物，是生命物质的组成成分之一。
糖类物质广泛地存在于生物界，特别是植物界。
糖类物质按干重计占植物的８３％～９０％，占细菌的１０％～３０％，动物的小于２％。
大量药理及临床研究证实：多糖有调节免疫、抗癌、抗肥胖、控制血糖、降胆固醇、降血脂等生理功能，可广泛应用于医药、保健品及功能食品，作为绿色生物医药产品具有广阔的市场前景。
目前多糖产品开发相当热门，也卓有成效。
多糖的生理功能与其纯度和化学结构有着重要的关系，多糖的提取纯化是其研究的基础。
因此科学高效地从动植物及微生物中提取、纯化其中的多糖成分是目前的核心问题。
本文对多糖制备常用提取与纯化方法，特别是一些新技术的应用进展进行了综述。
１多糖的提取纯化１．１常规方法提取１．１．１原料预处理提取前，必须破坏或抑制共存的水解酶，可采用丙酮、乙醚、乙醇等低极性溶剂，以破坏水解酶并分离脂溶性杂质。
１．１．２浸提一般采用不同温度的水或稀碱溶液提取。
浸提参数中，温度是影响多糖提取的主要因素，另外浸提固液比、浸提时间均影响提取率，可根据需要选取最佳工艺参数。
１．１．３过滤或离心分离提取液有的可以直接过滤，有的因提取液较黏稠不易过滤，往往用离心法除去不溶物。
１．１．４有机溶剂沉淀提取所得的滤液或上清液浓缩，加２～５倍量的有机溶剂，得粗多糖沉淀。
常用有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇及丙酮。
现有很多植物多糖的提取研究都是采取的常规水提法：大麦［１］中活性多糖提取、大枣［２］多糖提取、老头草［３］中多糖的含量测定、乌龙茶［４］多糖提取等。
朱晓霞，罗学刚（西南科技大学材料科学与工程学院，四川绵阳６２１０１０）多糖提取与纯化技术应用进展摘要：多糖由于它们独特的功能和低毒性，在保健食品和药品发展方面具有广阔的应用前景。
提取和纯化是制备多糖的关键。
目前用的提取方法有：常规水提法、超声波、微波辅助提取、超临界流体萃取；分离纯化技术有：色谱、膜分离。
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黄原胶是新型多糖类发酵产品， 1961 年首先 由美国Kelco公司投入工业化生产，目前被广泛应 用于食品、石油、地矿、陶瓷、纺织、印染、医 药、造纸、灭火、涂料、化妆品等20多个行业， 用 作 3 0 - 4 0 多 个 品 种 。 黄原胶被誉为“工业味精”，是目前世界上生 产规模最大且用途极为广泛的微生物多糖。
微生物多糖的种类多样，性质各异。根据多糖种类、 水提醇沉法 性质的不同，可以采用不同的提取纯化方法。 A、胞内和胞壁多糖的提取 先破碎细胞，然后在80一
微生物多糖的提纯方法
100℃下以水(或氢氧化钠、氢氧化钾水溶液)为溶剂反复提 取2一3次。将得到的多糖溶液进行离心除去不溶物质，减 压浓缩后合并上清溶液，然后用乙醇或异丙醇沉淀多糖； 再次离心后用丙酮、乙醇等有机溶剂洗涤，再冷冻干燥得 到多糖粗制品。
微生物多糖于20世纪50年代起备受人们的关注，人们对其 进行了大量科学研究。微生物多糖主要由真菌多糖和细菌 脂多糖两大类组成。 20世纪50年代，Jeanes等人筛选、 获得了许多黄原胶(Xanthan gum)的产生菌。1964年，原 田等人从土壤中分离到产凝结多糖(Curdlan，又称热凝多 糖)的细菌，后发现农杆菌(Agrobacterium sp.)也可以产生 该多糖.1975年，美国人生产制造了产生于少动鞘脂类单 胞菌(Sphingomonas paucimobilis，旧称伊乐藻假单胞菌) 的结冷胶(Gellangum，又称胶联多糖)。随后，小核菌葡聚 糖(Scleeroglucan)、短梗霉多糖(Pullulan，又称普鲁蓝)、 透明质酸(Hyaluronic acid)、壳聚糖(Chitasan)等微生物多 糖又相继被人们发现
B、胞外多糖的提取
离心发酵液除去菌体得到上清，然后用有机溶剂沉 淀多糖，静置、离心、干燥就可以得到多糖粗制品了. 粗多糖中常含有蛋白质等杂质，常用Sevage法、三氟 三氯乙烷法和三氯乙酸法、酶法去除，这四种方法各
有优缺点。
Sevage法是根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变 性的特点，将糖溶液和Sevage液(V氯仿:V正丁 醇=3:1一5:1)混合后剧烈震荡10min～3omin， 静止或离心后除去水层和溶剂交界处的变性蛋 白。此法除蛋白效率不高，但多糖不易降解。 三氟三氯乙烷法是将多糖溶液与三氟三氯乙烷 等比混合后搅拌、离心，如此重复几次即得到 无蛋白糖溶液，但三氟三氯乙烷易挥发不宜大 量使用。
灵芝菌深层培养产物菌丝体和发酵液由提取方 法 （1）、发酵液胞外多糖的提取：发酵液离心， 取上清液80～90℃浓缩后流水透析至无还原糖， 然后加入95%乙醇5-10℃下静止沉淀12h以上， 沉淀物分别以无水乙醇、丙酮、乙醚、洗涤后 真空干燥。此提取物多糖含量为69.2%，杂蛋 白含量为20.6%
（2）、菌丝体胞内多糖的提取：
鲜香菇碱提: 鲜香菇50g 加蒸馏水50ml 打浆,再 加0. 4mol/ L 的NaOH 100ml ,5 ℃浸提24h ,过 滤,滤液浓缩后加甲醇等同三氯乙酸浸提。鲜香 菇酸提: 鲜香菇50g 加蒸馏水50ml 打浆,再加入 2mol/ L 的乙酸100ml ,5 ℃浸提24h ,过滤,滤液 浓缩后加甲醇等处理同三氯乙酸浸提。
保肝、降压作用。
灵芝多糖的提取与纯化工艺
灵芝多糖的分离：
目前灵芝多糖的生产主要从野生或人工栽 培的灵芝子实体和灵芝菌深层培养产物菌 丝体和发酵液中提取。对从子实体中提取 灵芝多糖进行比较研究，研究表明，灵芝 子实体经水浸，沸水煎煮30min，反复收 集滤液，浓缩，过离子交换柱，透析，真 空干燥，可得多糖含量为80%的提取产物。 该产物较其他方法有明显的抗肿瘤作用， 可明显抑制B16BL6肿瘤细胞在鼠体内的生 长，降低S180接种小鼠的死亡率。
微生物多糖广泛的应用价值
2 、医药领域
大多数真菌多糖具有抗肿瘤、免疫调节、 抗衰老、抗感染等生物学功能
3 、环境保护(污水处理) 微生物代谢产物处理废水是一 个极具应用前景的废水处理方式，多糖是该代谢产物的主 要成分，因它所带的负电荷基团可以和二价阳离子结合而 在生物絮凝和重金属处理中起着非常重要的作用
香菇多糖的提取与纯化工艺
香菇(Lentinus edodes)是侧耳科(Pleara taco) 的担子菌，含有多种有效药用成分。尤其是香菇 多糖(Lentinan，LNT)，是一种宿主免疫增强剂 (Host defense—tiator，HDP)，它具有抗病毒、 抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能。 1969 年日本学者千原率先证实了香菇热水提出 物的抗肿瘤活性,羽田、佐木进一步研究证实其有 效成份是香菇多糖,Coro Chi2hara 从香菇子实 体中浸提出6 种香菇多糖,并证明其中一种具有明 显的抗肿瘤作用, 定名为Lentinan 。1980 年恂 二等确认香菇多糖为Th 细胞激活剂,它使机体免 疫功能得到恢复和提高而杀灭肿瘤细胞,可用于辅 助癌症治疗。
微生物多糖的提取与纯化
一、微生物多糖简介 二、微生物多糖功能简介 三、微生物多糖的提取与纯化工艺介绍 （一） 真菌多糖的提纯 （1）、灵芝多糖的提取与纯化 （2）、香菇多糖的提取与纯化 （二） 细菌性脂多糖的提取 （1）、大肠杆菌O157：H7脂多糖 提取 （2）、肠炎沙门氏菌脂多糖提取 四、参考文献
香菇粗多糖纯化
取干燥粗多糖称量后加重量体积比(W ∶V) = 1 ∶50 的蒸馏水溶解,再加等体积0. 15mol/ L 的CTAB 与硼酸O硼砂缓冲液处 理,离心,取沉淀用2mol/ L 乙酸溶解,离心 去沉淀,取上清加入等体积甲醇,静置24h , 离心,沉淀用甲醇洗涤2 次,冻干即为纯化多 糖。
香菇多糖提取
三氯乙酸浸提: 香菇粉10g 加0. 2mol/ L 三氯乙 酸200ml ,5 ℃浸提24h ,过滤。滤液浓缩至 100ml 后加100ml 甲醇,充分混匀,静置24h ,离 心,取上清浓缩至100ml 后加入200ml 甲醇,静置 24h ,离心得沉淀,甲醇、乙醚洗涤后,自然风干得 粗香菇多糖,称重,备用(设有3 个平行实验,下同) 。 热水浸提/ 超声波处理: 香菇粉10g 加200ml 蒸 馏水浸提2h 后100 ℃水浴1h ,超声波处理1h , 静置20h 后过滤,滤液浓缩后加入甲醇等后续处理 步骤同上述三氯乙酸浸提。
采用热酚水法提取肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O157:H7 的脂多糖(LPS)，经浓缩酶解， 离心分离得纯化LPS。 O157:H7 菌体的获得：对保藏菌株活化后， 玻片凝集法鉴定其血清型，再采用平皿划 线培养法挑取单菌落，转接至营养肉汤培 养基，3 7 ℃下摇床培养。收集对数生长期 菌体，离心沉淀(3500r/min，15min)后， 用4 倍体积生理盐水洗剂2次，蒸馏水洗剂 1 次，用无热原水按1:3 比例(1g 湿菌体悬 浮于3ml 无热原水中)悬浮。
三氯乙酸法是向多糖溶液中滴加三氯乙酸 至不再继续出现混浊为止，离心除去沉淀 即得到无蛋白的多糖溶液，但此法会引起 多糖的降解。 酶法去除蛋白条件最温和，不易引起多糖 的降解，但不同的酶作用于不同的蛋白， 所以要先进行不同酶除蛋白能力的探索， 最后才能确定最佳的除蛋白酶法。
得到的多糖可能是多种多糖的混合样 品，还要采用分部沉淀法、季胺盐沉 淀法、柱层析法、超滤法、制备性区 域电泳等方法进一步分离纯化。
大肠杆菌(EHEC)O157:H7 的脂多糖(LPS)的 提取纯化
大肠杆菌 O157:H7 引起的感染自1982年于美国 暴发流行以来，该菌被正式确定为食源性肠道致 病菌，引起全世界的广泛关注，其检测及预防治 疗措施一直是科学工作者的研究重点。脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)又称细菌内毒素，作 为革兰氏阴性菌细胞壁外膜的重要组分之一，是 菌株血清分型的主要依据，同时协同产Vero 毒 素的大肠杆菌感染寄主，在发病机制中起着重要 作用。对其结构特性及其特异性免疫保护的研究 常需制备大量高纯度的L P S 抗原。
微生物多糖具有广泛的应用价值，已 作为乳化剂、增稠剂、稳定剂、胶凝 剂、悬浮剂、润滑剂、食品添加剂、 抗癌医药品等应用于石油、化工、食 品、医疗、制药保健等多个领域。因 此研究其提取与纯化方法有着重要意 义 。
1、食品工业 黄原胶、结冷胶、小核菌葡聚糖、短梗霉多 糖、热凝多糖等 ，可以作为食品添加剂、凝结剂、保鲜 剂等
肠炎沙门氏菌脂多糖的提取与制备
沙门氏菌菌体裂解后可释放内毒素，英美 学者认为内毒素就是脂多糖 (Lipopolysaccharides LPS)。提取肠炎 沙门氏菌脂多糖是检测肠炎沙门氏菌工作 的第一步。
LPS 的提取与制备
采用热酚水法制备： 细菌收集物按每1 g 细菌加3 mL 蒸馏水进行悬浮, 然后反复 冻融3～ 5 次, 按每250 mL 菌液加45% 酚水作用5m in, 再 加等量的95% 的酚, 在水浴68 ℃中不断搅拌, 作用20～ 30 m in, 取出, 在水浴中冷却到10℃左右, 7 000 r/min 离心45 m in, 离心后分三层, 分别是水层、酚层、不溶层。上层水相 含L PS, 中层为变性蛋白, 下层为沉淀。小心吸取上层水相, 下层沉淀依上法反复提取, 至少2 次。将水层溶液混在一起装 透析袋, 流水冲洗48 h, 然后用蒸馏水透析2 d, 每天换水数次。 聚乙二醇20000 浓缩为原来体积的1/4, 提取液加DNA ase 50μ g/ml 和RNA ase 50μ g/ml , 37℃作用4 h, 然后100 ℃水浴10m in 后, 冷却至常温。冷却至室温后离心（1 500 r/m 离心30 m in）。 弃沉渣, 收集上清, 置4 ℃保存。
LPS 粗品的制备：菌悬液反复冻融三次后，与等 量9 0 % 苯酚共同加热至68℃后混合，剧烈搅拌 30min 后，冰浴至2。酚相加等体积无热原水重复洗涤2 次， 收集水相溶液装于透析袋中，流水透析12h去酚， 再蒸馏水透析60h(FeCl3 检测无紫色出现为止)， 可用50% 聚乙二醇6000 浓缩至1/4，即得LPS 粗品。 LPS 的纯化：浓缩后粗LPS中加DNase和 RNase各50μ g/ml，37℃下酶解4h，100℃水 浴加热10min，冷却至室温后离心(1500r/min， 30min)，弃沉淀，于上清中加2 倍体积丙酮，沉 淀后既可获得纯化LPS 。