腺相关病毒知识
腺病毒知识点总结
腺病毒知识点总结1. 腺病毒的分类腺病毒目前已知包括了六个属，分别为腺病毒属（Mastadenovirus）、阿卡洛病毒属（Atadenovirus）、索哈病毒属（Siadenovirus）等。
其中腺病毒属包括高度致病性的人类腺病毒、犬腺病毒等。
2. 腺病毒的结构腺病毒的外壳由蛋白质构成，内含双链DNA。
典型的腺病毒粒子呈多面体或类似无规则聚合的形状，直径约70-90纳米，表面均匀分布有纤维状的突起。
腺病毒粒子内含有DNA、蛋白质和酶。
3. 腺病毒的感染机制腺病毒通过呼吸道、消化道、眼部粘膜等途径进行感染。
一旦腺病毒进入人体，通过与细胞表面相关受体结合，进入细胞内。
腺病毒感染后，宿主细胞会被利用来合成病毒的DNA 和蛋白质，在宿主细胞内进行繁殖和增殖，破坏并利用宿主细胞的资源。
4. 腺病毒的致病性腺病毒引起的疾病种类繁多，常见的包括呼吸道感染、结膜炎、胃肠道感染、脑膜炎等。
不同种类的腺病毒可引起不同的疾病。
例如，腺病毒D型和E型主要引起呼吸道感染，腺病毒F型主要引起眼部感染。
5. 腺病毒的预防措施目前，预防腺病毒感染的主要措施包括加强个人卫生、保持良好的生活习惯、接种疫苗等。
通过保持清洁卫生，避免接触患者体液，保持良好的生活习惯，如良好的饮食习惯、充足的睡眠等，有助于预防腺病毒感染。
此外，疫苗接种也是预防腺病毒感染的有效手段。
目前，已有一些疫苗用于预防特定种类的腺病毒感染。
总之，腺病毒是一类广泛存在的病原体，对人类和动植物造成了严重威胁。
了解腺病毒的分类、结构、感染机制、致病性和预防措施等知识，有助于人们更好地认识腺病毒，预防和控制腺病毒感染，保障公共健康。
希望通过本文的介绍，读者能够更全面地了解腺病毒及其相关知识。
腺病毒防治知识宣传手册
腺病毒防治知识宣传手册1. 什么是腺病毒？腺病毒是一种DNA病毒，在自然界中分布广泛。
易引起人体呼吸、消化和泌尿等多系统感染，以呼吸道感染较为常见。
目前已知的人腺病毒有A-G共7个组，60多个血清型。
55型腺病毒是由人11型和14型腺病毒重组产生的新型病毒，属于B组B2亚组，普通人群因缺乏免疫力，所以普遍易感。
2. 腺病毒有什么危害？腺病毒引起的急性呼吸道感染、急性角膜结膜炎等可导致人群暴发或流行。
病人多以轻症为主，表现出发热、咳嗽、咽痛、头痛和全身不适等症状，少数有恶心、腹泻。
大部分经过治疗后能够康复。
3. 什么季节易出现55型腺病毒感染暴发流行？冬春季节气温较低，人群多在室内活动，环境相对密闭，通风不畅，易于病毒传播。
因此，冬春季容易出现55型腺病毒感染暴发流行。
4. 腺病毒的传染源是什么？腺病毒感染者和隐性感染者是主要传染源。
潜伏期一般3～8天，潜伏期末至发病急性期传染性最强。
5. 人是如何感染腺病毒的？主要通过空气飞沫传播，如病人打喷嚏或咳嗽传染给健康人。
密切接触（手-鼻）传播也是重要传播途径，如用脏手揉眼睛、鼻子等也可感染。
6. 哪些人容易感染腺病毒？各个年龄人群均可感染腺病毒，但婴幼儿、老年人以及免疫功能低下者较容易感染。
集体生活的幼儿、学生或新兵由于生活环境封闭聚集也容易发生群体性感染。
7. 腺病毒有什么药物可以预防和治疗？疫苗预防：4型和7型腺病毒有口服疫苗，效果较好。
但近年流行的55型腺病毒是一种新型重组病毒，目前尚无针对性疫苗。
药物治疗：目前无特效治疗腺病毒的药物，可口服抗病毒类药物进行预防。
发病后主要采取对症治疗。
8. 55型腺病毒感染与普通感冒、流行性感冒有什么不同？55型腺病毒感染多引起肺部改变，普通感冒多伴有明显的鼻塞、流涕、打喷嚏等上呼吸道症状，胸片无异常，可区别于55型腺病毒感染。
流感多有发热、头痛、乏力，伴肌肉酸痛等全身症状，与55型腺病毒感染不易区分，需经实验室检测确诊。
腺相关病毒操作技巧——轻松入门剖析
rep
ITR Replication
cap
Capsid ITR
过表达
pHBAAV-CAG-MCS-T2A-mcherry pHBAAV-CAG-DIO-MCS-T2A-ZsGreen pHBAAV-CAG-DIO-MCS-T2A-mCherry pHBAAV-hsyn-MCS-T2A-ZsGreen pHBAAV-hsyn-MCS-T2A-mCherry pHBAAV-CamkII-MCS-T2A-ZsGreen
4.8 kb
● 组织特异性-拥有DIO元件载体系统和最全的组织特异性启动子工具箱，如心脏、肝脏、 肌肉以及各种神经元特异的启动子等； ● 病毒产品全部经过无菌、无支原体、无内毒素检测，让实验安全放心。
＋
汉恒生物AAV主要载体及现货列表
1、汉恒生物AAV主要载体列表（表1）
（部分组织特异性启动子如心脏、肝脏、肌肉等没有在表中列出，欢迎咨询定制。）
CMV（人巨细胞病毒启动 子），广谱，强
EYFP mcherry EYFP EYFP EYFP mcherry
Gi- DREADD
pHBAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry
mCherry
是
Gq-DREADD
pHBAAV-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry
mCherry
否
● 常规基因的过表达和干扰定制（载体列表见“七、载体构建”部分）； ● 组织特异性启动子过表达定制（载体列表见“七、载体构建”部分）； ● 常规启动子和组织特异性启动子驱动的AAV-Cas9定制； ● AAV介导的光遗传、化学遗传载体现货及改造服务等（见表3）； ● 双标、单标LC3自噬流监测工具（见表5）； ● 组织特异性AAV-DIO载体的定制（原理见附件1）。
腺相关病毒操作手册--汉恒生物
汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 1汉恒生物---腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector ，AAV ）简介腺相关病毒属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。
AA V 的基因组约 4700bp ，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有 3 个启动子(P5、P19 和 P40) 和 2 个开放阅读读框(ORF)，rep 和 cap ，如图 1 所示。
rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白，即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，其中 Rep78 与 Rep68 参与 AA V 的复制与整合，Rep52 和 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性，与 Rep78、Rep68 共同参与单链基因组的复制；cap 编码的 VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在 AA V 病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图 1. AA V 基因组结构二、腺相关病毒的优点1. 安全性高：迄今从未发现野生型A A V 对人体致病，重组A A V 基因组序列上去除了大部分的野生型A A V 基因组元件，进一步保证了安全性；2. 免疫原性低：AA V2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA 技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；三、重组腺相关病毒载体系统简介汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 2AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System ）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。
腺病毒感染科普宣传PPT
腺病毒感染的误区
不需隔离
有些人认为腺病毒感染不需要隔离，实际上传播 性较强，感染者应适当隔离。
尤其是在家庭或学校环境中，避免交叉感染。
腺病毒感染的误区
疫苗误区
目前尚无针对腺病毒的特效疫苗，公众需了解这 一点。
预防措施依然是抵御腺病毒感染的主要手段。
谢谢观看
腺病毒感染科普宣传
演讲人：
目录
1. 什么是腺病毒？ 2. 腺病毒感染的症状有哪些？ 3. 如何预防腺病毒感染？ 4. 腺病毒感染的治疗方法 5. 腺病毒感染的误区
什么是腺病毒？
什么是腺病毒？
定义
腺病毒是一种常见的病毒，属于腺病毒科，能够 引起多种感染。
腺病毒主要影响呼吸系统、消化系统和眼睛等部 位。
腺病毒感染的常见症状包括发热、咳嗽、喉咙痛 、流感样症状等。
部分患者可能还会出现腹泻、呕吐等消化系统症 状。
腺病毒感染的症状有哪些？
严重症状
在某些情况下，腺病毒感染可能导致严重的肺炎 或其他严重并发症。
特别是在免疫力低下的人群中，风险更高。
腺病毒感染的症状有哪些？
儿童感染
儿童感染腺病毒的风险更高，症状可能更为明显 。
可饮用清水、淡盐水或电解质饮料。
腺病毒感染的治疗方法
就医建议
如症状严重或持续不改善，建议及时就医，进行 相关检查。
医生会根据具体情腺病毒感染的误区
非空气传播
很多人误认为腺病毒是通过空气传播的，实际上 它主要通过接触传播。
保持环境卫生和个人卫生是预防的关键。
如何预防腺病毒感染？
健康生活
保持健康的生活方式，增强免疫力，保证充足的 睡眠和均衡的饮食。
适度锻炼和减压也有助于提高身体抵抗力。
知识分享：腺相关病毒（AAV）表达系统
知识分享：腺相关病毒（AAV）表达系统【维真⽣物】提供AAV现货和AAV包装服务，已助⼒多位客户在顶级期刊发表⽂章。
产品说明书【详见维真⽣物官⽹→（腺相关病毒包装+腺相关病毒制备+腺相关病毒案例分享+腺相关病毒技术⼿册），或联系官⽹在线客服索要相关内容的链接。
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腺相关病毒安全操作规范1. 请在BL2⽣物安全⼆级⽣物安全柜中操作病毒。
2. 操作病毒和转染细胞时，请务必穿着实验服，佩戴⼝罩和⼿套。
3. 请⼩⼼操作，避免产⽣⽓雾或飞溅。
被病毒污染的超净⼯作台，请⽴即⽤70%⼄醇加1% SDS溶液擦拭⼲净。
接触病毒的枪头、离⼼管、培养板、培养液请使⽤新鲜配制的10％漂⽩粉进⾏消毒操作后丢弃。
4. ⽤显微镜观察细胞感染情况时，请先拧紧培养瓶或盖紧培养板，⽤70%⼄醇擦拭培养瓶外壁后，显微镜下观察拍照。
观察完毕，请⽤70%⼄醇再次擦拭显微镜实验台。
5. 离⼼病毒时，应使⽤密封性好的离⼼管，或⽤封⼝膜封⼝后进⾏离⼼，请尽量使⽤组织培养室内的离⼼机。
6. 实验完毕脱掉⼿套后，请⽴即⽤肥皂和⽔清洗双⼿。
个⼈保护措施1. 使⽤⼀次性⼿套。
2. 在注射病毒或是其后的解剖时，使⽤⼀次性⼿术服或是相当的⾐物，如果是感染细胞时，可以穿着实验服。
3. 佩戴护⽬镜或是⾯罩。
4. 所有的操作应当是在 Class II ⽣物安全柜中进⾏。
如果实验条件不能满⾜，则应当在空⽓稳定的空间中操作，减少操作时间和病毒与外界接触的时间。
不慎接触病毒时的急救1. 病毒飞溅或是⽓溶胶与⼈体接触–眼，⽪肤或是粘膜⽤⼤量清⽔冲洗眼睛或是其他接触的部位⾄少15 分钟。
腺病毒和腺相关病毒有哪些区别
腺病毒和腺相关病毒有哪些区别？腺病毒和腺相关病毒（AAV）是用于基因传递的两种不同类型的病毒载体。
这两个重组病毒系统都具有感染广泛宿主的能力，包括分裂和非分裂细胞，而无需与宿主基因组整合。
它们两之间有几个主要区别：包装能力、水平，基因表达的起效和持续时间以及免疫应答。
腺病毒简介腺病毒有约8.5千碱基的容量，具有高水平的蛋白质表达和瞬时基因表达。
表达的发作时间可早于感染后16-24小时。
腺病毒系统的局限性主要在于靶细胞的高免疫应答。
尽管如此，由于它们对大多数组织有高效转导作用，仍被广泛用于研究中。
腺病毒不能整合至宿主基因组，仅能瞬时表达。
它可以对分裂期及非分裂期细胞进行感染。
其包装片段至多8 kb，浓缩滴度至多为1011-1012TU/mL，片段越大，滴度越低，表达水平还是比较高的。
腺病毒优势宿主范围广：能够感染分裂期细胞与静止期细胞；对上皮细胞有高度嗜性，尤其适用于感染原代细胞、悬浮细胞等难转染细胞类型感染效率高：优于其他病毒载体和转染系统的高感染能力，能达到近100%的效率包装容量大：最高可插入7.5 kb的外源片段表达水平高：1-2d即开始高水平表达安全系数高：去除病毒蛋白编码序列，降低细胞毒性和免疫反应；双质粒转染系统，生物安全性高无整合风险：无插入致突变性腺相关病毒简介AAV的包装容量约为4.5千碱基，蛋白质表达水平相对较低，有长效基因表达的潜力。
AAV的趋向性也可以通过不同的血清型增强。
AAV的主要缺点是其对目的基因的包装容量较小，并且表达起效较晚（体外2-7天，体内3-21天），然而，该传递系统所产生的免疫应答水平却非常低。
腺相关病毒可以稳定整合至宿主基因组，并且可以在特定基因产物存在的条件下整合至人类19号染色体中的特定位点。
它能对分裂期及非分裂期细胞进行感染。
其包装片段至多8 kb，浓缩滴度至多为1011-1013TU/mL，片段越大，滴度越低。
腺相关病毒可以应用Tet-on等诱导表达系统，表达水平也是比较高的。
腺相关病毒知识(汇编)
第一节AAV病毒的生活周期腺病毒伴随病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一。
这一家族成员是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。
病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4. 7~6kb之间的线状单链DNA基因组。
从昆虫到人类都已分离到微小病毒。
AAV病毒属于依赖性病毒类（De pendovirus），最初是在纯化的腺病毒液中发现的一种污染成分（Atchinson et al. 1965）, 顾而得名。
从鸟类到许多哺乳动物包括人的体内都分离到各种血清型的AAV病毒。
大多数成年人都感染过AAV病毒，但尚未发现该病毒是任何疾病的致病因素。
在多数情况下，AAV在培养的正常细胞中不发生产毒性感染，只有在有辅助病毒包括腺病毒或疱疹病毒共同感染时才发生产毒性感染（Hoggan et al. 1966; Buller et al. 1981）。
因此，AAV病毒长期以来被认为是一种缺陷性病毒。
进一步的研究发现AAV病毒并非缺陷性病毒，而是在正常细胞中偏向于建立潜伏感染,仅在宿主细胞受到刺激时才被诱发进行感染性增殖。
AAV的生活周期有两种不同的胞内期。
在无辅助病毒存在时，AAV病毒颗粒进入细胞，脱衣壳后AAV的调节蛋白发生有限的表达，并抑制病毒基因的进一步表达和病毒DNA的复制。
这种负调节作用的结果是促进病毒基因组整合到宿主的基因组中建立潜伏感染。
AAV病毒偏向于整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置（Kotin et al. 1990,1991,1992; Samulski et al. 1993）。
研究被AAV病毒潜伏感染的细胞发现，AAV对细胞表型往往有微弱影响，并影响细胞对刺激的反应能力（Yalkinoglu et al. 1988; Yakobson et al. 1987,1989; Bantel-Schaal et al. 1992, 1991）。
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第一节AAV病毒的生活周期腺病毒伴随病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一。
这一家族成员是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。
病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4. 7~6kb之间的线状单链DNA基因组。
从昆虫到人类都已分离到微小病毒。
AAV病毒属于依赖性病毒类（De pendovirus），最初是在纯化的腺病毒液中发现的一种污染成分（Atchinson et al. 1965）, 顾而得名。
从鸟类到许多哺乳动物包括人的体内都分离到各种血清型的AAV病毒。
大多数成年人都感染过AAV病毒，但尚未发现该病毒是任何疾病的致病因素。
在多数情况下，AAV在培养的正常细胞中不发生产毒性感染，只有在有辅助病毒包括腺病毒或疱疹病毒共同感染时才发生产毒性感染（Hoggan et al. 1966; Buller et al. 1981）。
因此，AAV病毒长期以来被认为是一种缺陷性病毒。
进一步的研究发现AAV病毒并非缺陷性病毒，而是在正常细胞中偏向于建立潜伏感染,仅在宿主细胞受到刺激时才被诱发进行感染性增殖。
AAV的生活周期有两种不同的胞内期。
在无辅助病毒存在时，AAV病毒颗粒进入细胞，脱衣壳后AAV的调节蛋白发生有限的表达，并抑制病毒基因的进一步表达和病毒DNA的复制。
这种负调节作用的结果是促进病毒基因组整合到宿主的基因组中建立潜伏感染。
AAV病毒偏向于整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置（Kotin et al. 1990,1991,1992; Samulski et al. 1993）。
研究被AAV病毒潜伏感染的细胞发现，AAV对细胞表型往往有微弱影响，并影响细胞对刺激的反应能力（Yalkinoglu et al. 1988; Yakobson et al. 1987,1989; Bantel-Schaal et al. 1992, 1991）。
AAV生活周期的另一种胞内期是产毒性感染，往往在有辅助病毒（腺病毒或疱疹病毒）感染时发生。
辅助病毒的感染可以在AAV感染之前、同时或之后进行。
腺病毒（Ad）和单纯疱疹病毒（HSV）中与辅助功能有关的基因都已确定。
腺病毒中参与提供辅助功能的基因包括E1a, E1b, E2a, E4和VA RNA（Muzyczka 1 992），但不包括与腺病毒DNA复制直接相关的E2b基因产物（DNA聚合酶和末端酶）。
1型单纯疱疹病毒（HSV-1）提供辅助功能的情形则有些不同,不仅涉及与HSV病毒基因调节有关的基因包括ICP0和ICP4，还需要HSV病毒DNA复制的所必需的基因产物包括HSV螺旋酶－引物酶复合物（UL5，UL8，UL52）和主要DNA结合蛋白UL29的参与（Weindler F et al. 1991）。
这种在辅助功能方面的不同可能反映了腺病毒感染和疱疹病毒感染期间对宿主DNA合成机制的不同影响。
目前的关于AAV工作模式有以下要点：（1）AAV是一种生活周期以潜伏感染为主的病毒；（2）通过潜伏感染, 病毒基因组得以同细胞共存；（3）只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；（4）如果细胞受到刺激，细胞内环境发生改变而表达应激基因；（5）导致细胞应激反应基因表达的调节状况也使得AAV基因表达，从而使AAV病毒复制；（6）产生子代病毒并释放，又感染新的正常宿主细胞，建立新的潜伏状态。
用某些可损伤基因的因素如紫外线照射、γ射线照射、各种化学致癌剂或某些代谢抑制剂处理某种类型的哺乳动物细胞，可使之在无辅助病毒存在的情况下能够发生AAV产毒性感染。
虽然这种情形比有辅助病毒存在时每个细胞产生AAV病毒的量要低几个数量级，但上述实验提示AAV病毒并不是一种缺陷性病毒，而是一种强烈偏向于潜伏的病毒。
返回标题第二节AAV病毒的基因组结构和功能人2型腺病毒伴随病毒（AAV-2）的基因组为4681 个核苷酸的单链DNA，全部序列已测定。
正链和负链DN A均可被包装到AAV病毒颗粒中。
AAV-2基因组的结构如图3-1所示。
基因组的两末端为145bp的倒转末端重复序列（inverted terminal repeat, ITR）。
ITR序列之间为AAV病毒的编码区，左侧的ORF编码4种Re p蛋白；右侧的ORF编码3种Cap蛋白。
一．ITR的结构和功能AAV 病毒ITR的序列和结构见图3-2。
每个ITR长145bp。
其中前125bp可形成一个T形的发夹结构，由两个小回纹结构（palindrome）（图2 B和C）组成，旁边为一个较大的回纹结构（A）。
ITR的序列可有两种构型：flip（B回纹接近3’端）或flop（C回纹接近3’端）。
一个特定分子AAV的两个末端形成flip或flop 的机率都相等。
单链形式的AAV ITR容易形成如图2所示的T型发夹结构，还可能形成另外的构型。
ITR序列是AAV病毒的复制、整合、拯救和包装所必需的顺式作用元件。
二．Rep基因的结构和功能Rep基因编码至少4种非结构蛋白：Rep78, Rep 68, Rep 52, Rep 40。
由p5启动子起始的2种mRNA翻译成Rep78和Rep68；p19启动子起始的2种mRNA翻译成Rep52和Rep40（图3.1）。
Rep52和Rep40蛋白C末端的氨基酸序列分别与Rep78和Rep68相同。
Rep 78和Rep68蛋白与AAV基因表达的正负调控有关。
这两种蛋白都可以和ITR中的特定序列( 5’-GCTCGCTCGCTC-3’)结合。
类似的序列在AAV的3个启动子上游均可找到。
当ITR自我折叠时可加强这种结合作用。
Rep78/Rep68具有ATP酶和螺旋酶的功能。
当其与ITR结合时便成为在124位点核苷酸处特异切割的缺口酶,识别的位点是5’-T/TGG。
这两种蛋白对于AA V生活周期的每一时期都是必需的。
在非允许条件下（没有辅助病毒和刺激因素），Rep蛋白只有微量表达，这种表达又能抑制其进一步的表达。
另外，在非允许条件下Rep的表达似乎可抑制AAV基因组以直接方式复制。
近来的研究证明Rep蛋白的表达对位点特异性整合是必需的。
相反，在允许条件下，Rep蛋白的表达对AAV病毒从整合状态的拯救、各种AAV基因的表达和AAV DNA的复制都是必需的。
Rep52和Rep40参与了病毒的装配，它们在病毒双链DNA合成中是不需要的，但在单链DNA和病毒颗粒的累积中则是必需的。
三．Cap基因的结构和功能Cap基因编码衣壳蛋白，其转录从p40启动子开始，形成约2.6kb和2.3kb mRNA,拼接后分别编码三个结构蛋白VP1、VP2和VP3(图2) ，分子量分别为87、73和61kDa,在成熟毒粒中的比例为1:1:10。
没有VP1时，VP2和VP3就可以包装子代单链DNA。
但这样的毒粒感染性较低，提示VP1在病毒颗粒的稳定性或感染性上是需要的。
VP2在病毒样空颗粒的装配中起重要作用。
VP3 似乎需要与其它两个中的一个一起，完成核定位任务。
返回标题第三节重组AAV的产生原理及常规制备、检测方法在基因治疗研究中，重组逆转录病毒和重组腺病毒在基因转移载体中一直占主导地位。
但近年来这一情况有所改变，用AAV作基因转移载体已成为基因治疗研究的热点。
这是由于AAV具有以下特点：（1）安全性好。
迄今从未发现野生型AAV对人体致病;重组AAV去除了野生型AAV基因组的96%，进一步保证了安全性；（2）宿主范围广。
不仅可转导分裂细胞，而且可转导静止期细胞；（3）野生型AAV可整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置,利用这一特点,有可能研制出具有特异性整合功能的AAV载体;（4）AAV-2的基因组仅4681个核苷酸, 便于用常规的重组DNA技术进行操作；（5）物理性质稳定。
在60°C不能被灭活, 能抗氯仿;（6）重组AAV（rAAV）可长期稳定地表达外源基因。
一．重组AAV的产生原理目前在基因治疗研究中所用的AAV载体均由2型AAV改造而来。
AAV-2的ITR中包含了复制、包装、拯救及整合的信号，这使rAAV的产生成为可能：外源基因表达盒可完全取代AAV的编码序列，rep和cap基因产物则可由另一个质粒反式提供。
参照野生型AAV的生活周期，表达外源基因的rAAV的产生需要4种成分参与：1. 载体DNA。
载体DNA质粒包括了145bp的AAV ITR序列，外源基因的表达单位（通常由转录启动子、目的基因和多聚腺苷酸序列组成）位于两个ITR之间。
2. AAV的复制蛋白(Rep)和外壳蛋白(Cap)。
通常由携带它们相应基因的质粒（称为包装质粒）反式提供。
3. 宿主细胞。
多种细胞可用作产生重组AAV的宿主细胞，包括293细胞、HeLa细胞和KB细胞等，其中29 3细胞用磷酸钙转染的效率最高，因此最常用。
4. 辅助病毒。
常用的辅助病毒为腺病毒，疱疹病毒则较少用到。
腺病毒的辅助功能由E1a、E1b、E2a、E4 orf6和VA RNA基因提供；HSV-1的辅助功能由UL5、UL8、UL52和UL29等基因提供。
在辅助病毒存在的条件下，Rep蛋白可以将含有外源基因表达单位的rAAV基因组从载体质粒上拯救出来，并加以复制，得到大量复制形式的rAAV DNA。
随后，Cap蛋白可将单链的rAAV基因组包装成感染性的病毒颗粒。
二．重组AAV的常规制备及纯化方法rAAV载体的常规制备过程见图3.3。
通常采用磷酸钙共转染的方法，将载体质粒和包装质粒共转染经腺病毒感染的HeLa或293细胞(Hermonat and Muzyczka, 1984; Samulski et al., 1987,1989)。
当细胞在腺病毒感染下完全病变后（通常为感染后48-72 h），收集细胞，低速离心、去上清。
此时绝大部分rAAV存在于细胞内，去掉上清没有明显损失。
将细胞团块冻融3~4次，裂解液在55~60°C加热30~60min以灭活腺病毒。
低速离心去除细胞碎片后，将rAAV的粗提物用若干次氯化铯平衡梯度离心进行纯化。
如果rAAV基因组与野生型AAV基因组的大小一致，则密度为1.41 g/cm3,可以与密度为1.35 g/cm3的腺病毒明显分离。
对于转导培养的细胞，用rAAV的粗提物即可；但如果用于动物实验，则需进行若干次氯化铯平衡梯度离心进行纯化，因为即使污染了很少量的腺病毒（无论灭活与否）都能造成病毒接种部位的局部炎症反应。
在rAAV制备过程中，需注意以下问题：1．rAAV 的基因组长度（包括两个ITR在内）应接近野生型AAV基因组4681bp的长度，即外源基因表达盒（包括启动子、目的基因及多聚腺苷酸序列）不超过4.3 kb。