赭曲霉毒素A标准检测规程
黄曲霉毒素国标检测方法
黄曲霉毒素国标检测方法
黄曲霉毒素（AF）是一种由黄曲霉属真菌产生的有毒代谢产物。
它们被广泛分布在食品、饲料和环境中，可能对人类和动物健康造成危害。
因此，对黄曲霉毒素的快速、准确检测成为了保障公众健康的关键。
国家标准委员会制定了黄曲霉毒素国标检测方法，以保证各个检验机构的检测质量和结果一致性。
1. 检测样品的制备
样品制备过程是检测过程的关键步骤。
样品必须被精确称量和混合，以确保最终检测结果的准确性和可重复性。
样品预处理的方法通常包括研磨、切碎、混合和抽样等步骤，具体方法取决于样品的特性，如水分含量、粘度和粒度分布等。
2. 样品提取
样品提取过程中，黄曲霉毒素从样品中被提取到适当的溶剂中。
提取的选择取决于样品的特性和黄曲霉毒素的特性。
一些常见的提取方法包括回收萃取、固相萃取和羧甲基纤维素柱萃取等。
3. 分离和净化
为了获得最终准确的结果，必须分离并净化提取的样品。
对于黄曲霉毒素的分离和纯化方法主要有和阳离子交换树脂和固相萃取等方法。
检测黄曲霉毒素的方法主要包括色谱检测法、酶联免疫检测法、毛细管电泳等方法。
其中酶联免疫检测法已成为广泛使用的检测方法之一。
该方法以特异性抗体为基础，利用抗原抗体相互作用，快速、敏感地检测黄曲霉毒素。
总的来说，黄曲霉毒素国标检测方法是一系列高效准确的方法，可以帮助检验机构检测食品或饲料中的黄曲霉毒素，保证公众健康。
饲料卫生标准饲料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允许量
饲料卫生标准饲料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允许量
（GB 13078.2-2006）
1 范围
本标准规定了饲料中玉米赤霉烯酮（ZEN）和赭曲霉毒素A(OA)的允许量。
本标准适用于配合饲料和玉米。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
GB/T 19539 饲料中赭曲霉毒素A的测定
GB/T 19540 饲料中玉米赤霉烯酮的测定
3 允许量
赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允许量表1
项目适用范围允许量/（ug/kg）
赭曲霉烯酮配合饲料、玉米≤100
玉米赤霉烯酮配合饲料、玉米≤500
4 检验方法
饲料中曲赭霉毒素A检验方法按GB/T 19539的测定方法的规定执行。
饲料中玉米赤霉烯酮检验方法按GB/T 19540的测定方法的规定执行。
赭曲霉毒素A无毒ELISA检测
赭曲霉毒素A无毒ELISA检测裘雪梅;朱立鑫;刘敏;周双铭【摘要】[目的]研究赭曲霉毒素A毒素的替代ELISA检测.[方法]采用噬菌体展示技术筛选赭曲霉毒素A模拟表位,得到赭曲霉毒素A(OTA)模拟表位序列为IR(V)PMV(L)XX(X为任意氨基酸),化学合成法体外合成OTA模拟表位肽,通过化学交联法将OTA模拟表位肽与BSA连接,做成无毒抗原,建立无毒OTA间接竞争ELISA检测方法,同样通过化学交联法将OTA多肽-BSA与HRP相联,建立OTA无毒直接竞争ELISA检测方法.[结果]OTA多肽-BSA间接竞争ELISA检测50％抑制浓度(IC50)为5 ng/ml,OTA多肽-BSA-HRP一步直接竞争ELISA检测法IC50为2.5 ng/ml,二步直接竞争ELISA检测法IC50为2ng/ml.[结论]OTA模拟表位多肽能用于代替OTA毒素作为检测抗原使用,并建立无毒ELISA检测方法.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)031【总页数】3页(P35-37)【关键词】赭曲霉毒素A;模拟表位;ELISA检测【作者】裘雪梅;朱立鑫;刘敏;周双铭【作者单位】江西科技师范大学生命科学学院,江西南昌330013;江西科技师范大学生命科学学院,江西南昌330013;江西科技师范大学生命科学学院,江西南昌330013;江西科技师范大学生命科学学院,江西南昌330013【正文语种】中文【中图分类】S188赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是曲霉属和青霉属的某些菌种产生的有毒次级代谢产物，易蓄积于组织中[1-2]，属于烈性的肾脏和肝脏毒素[3-5]。
OTA还具有强的致癌、致畸和致突变性[6-7]。
产OTA毒素的菌株广泛存在于自然界中，在各种农作物、食品、饲料、人类及动物的组织和血液中均能检测到OTA的污染，对人类健康构成重大威胁[8-9]。
高效液相色谱法(HPLC)等理化分析检测方法可以精确地进行定性和定量分析[10-12]，由于所需设备昂贵、操作复杂以及对样品纯度有较高的要求，导致检测成本高、周期长，无法满足大批量样本快速筛查的需要。
粮油检测粮食中赭曲霉毒素A的测定超高效液相色谱方法编制说明
《粮油检测粮食中赭曲霉毒素A的测定超高效液相色谱方法》行业标准制定编制说明赭曲霉毒素A主要由曲霉属的赭曲霉（Aspergillus ochraceus）、洋葱曲霉(A．alliaceus)、硫色曲霉(A．sulphureus)、蜂蜜曲霉(A．melleus)、孔曲霉(A．ostianus)、佩特曲霉(A．petrakii)和菌核曲霉(A．sclerotiorum)、黑曲霉（A. niger）等, 青霉属的纯绿青霉（Penicillium verrucosum）、震颤青霉（Penicillium palitans）、团青霉（Penicillium commune）、变紫青霉（Penicillium purpursescens）、圆弧青霉（Penicillium cyclopium）等产生，对人、动物具有致病、致癌作用，被WHO的国际癌症研究组织列为2B级可疑致癌物质。
易污染玉米、大麦、小麦、燕麦、高粱、绿咖啡豆、豌豆、豆类、花生、面包、橄榄、啤酒、饲料、肉、奶酪、奶粉、干草、葡萄干、坚果。
我国食品安全国家标准《GB2761-2011 食品中真菌毒素限量》中规定谷物及豆类制品中赭曲霉毒素A限量为5 μg/kg。
目前报道用于检测赭曲霉毒素A的分析方法有酶联免疫法、免疫胶体金试纸法、生物传感器法、高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法、间接竞争免疫分辨荧光免疫分析、薄层色谱法等。
薄层色谱法由于操作复杂，目前应用较少；胶体金和酶联免疫方法用于快速筛查；普通液相色谱方法目前应用较多，但分析速度较慢，耗费溶剂较多，成本增加，环保性不足；液质联用仪检测需要高端的质谱仪。
当前急需建立一种更加灵敏、高效、低溶剂量的赭曲霉毒素A微量快速定量方法。
为了满足当前我国粮食绿色检测、监测定量分析的需要，通过查阅文献，根据范德米特(van Deemeter)方程理论，结合免疫亲和净化手段，基于UPLC分离技术，建立了一种进样量小、分离度高、快速准确、环保的赭曲霉毒素A定量分析方法。
饲料原料中赭曲霉毒素的快速筛查胶体金快速定量法
《饲料原料中赭曲霉毒素的快速筛查胶体金快速定量法》江西省地方标准编制说明一、标准制定意义（一）介绍赭曲霉毒素A是由多种生长在粮食（小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等）、花生、蔬菜（豆类）等农作物上的曲霉和青霉产生的。
动物摄入霉变饲料后，这种毒素也可能出现在猪和母鸡等的肉中。
赭曲霉毒素主要损害动物肝脏与肾脏，引起肝脏和肾脏损伤，大量毒素也可能引起动物肠黏膜炎症和坏死。
有报道指出，食物中的OTA与一种致命的地方性肾脏疾病（balkanendemicnephropathy）有关，且有致癌、致畸作用，近年来引起了人类营养学家的重视。
正常条件下，小麦和玉米受OTA污染的机率较小，约1%～5%，其含量为0.01～5mg/kg；大麦和燕麦被污染的机率较高，约为10%，其含量一般在0.1mg/kg以下，个别样品高达27mg/kg。
赭曲霉毒素包括3种类型，毒性强弱顺序是：OTA>OTC>OTB。
OTB是OTA的脱氯衍生物，OTC是OTA的乙基酯，OTB和OTC的含量一般较低，毒性较OTA小。
因此，饲料检测时可以主要分析OTA含量。
目前，小麦、大麦、玉米等谷类作物中OTA的测定方法有薄层色谱法（TLC）、酶联免疫吸附法（ELISA）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）。
TLC法繁琐费时，且灵敏度、特异性较差，提取过程中所需有机溶剂品种多且量大，易污染环境，对人体有较大危害。
ELISA法测定结果受试剂盒差异、实验温度、仪器灵敏度等条件影响较大。
GC、GC-MS、HPLC和HPLC-MS法普遍存在着样品前处理过程复杂，灵敏度易受样品的净化、浓缩等步骤的影响，耗时，检测设备昂贵，并要求有专业的技术人员及较长的分析周期。
同时，这些检测方法无一例外要求在检测过程中使用毒素标准溶液，给环境和检测人员的安全造成风险。
本标准项目是通过化学合成法制备赭曲霉毒素A人工抗原，利用此抗原免疫实验动物制备赭曲霉毒素A单克隆抗体，基于此原料基础上开发赭曲霉毒素A快速检测试纸条，再通过胶体金读数仪进行大米、玉米、小麦等样品中赭曲霉毒素的定量分析。
食品安全国家标准食品中真菌毒素限量葡萄酒及咖啡中赭曲霉毒素A编制说明
《葡萄酒和咖啡中赭曲霉毒素A限量》（征求意见稿）编制说明一、标准起草的基本情况根据《食品安全法》和《食品安全国家标准管理办法》有关规定，为进一步完善我国食品安全国家标准《食品中真菌毒素限量》（GB 2761-2011），受国家卫生和计划生育委员会（原卫生部食品安全综合协调与卫生监督局）委托，由中国食品发酵工业研究院与天津科技大学共同承担食品安全国家标准《葡萄酒和咖啡中赭曲霉毒素A限量》的制定工作。
《葡萄酒中赭曲霉毒素A限量》标准主要起草单位为中国食品发酵工业研究院，参与单位有中国酒业协会葡萄酒分会，宁波进出口检验检疫局，河北科技大学，西北农林科技大学和相关葡萄酒企业等。
主要起草人：熊正河，钟其顶，邢江涛，王祖明，陈树兵，殷居易，李艳和王华。
《咖啡中赭曲霉毒素A限量》标准起草单位为：天津科技大学；主要起草人：王硕、王俊平、朱华平、石楠、白茹、陈煜润。
二、标准的重要内容及主要修改情况1.葡萄酒。
起草工作组根据葡萄酒赭曲霉毒素A普查数据，结合我国葡萄酒膳食调查数据，依照国际膳食暴露点评估模型，开展了我国葡萄酒赭曲霉毒素A的暴露量评估，结果表明我国葡萄酒高消费人群的赭曲霉毒素A暴露量应引起关注，但总体食品安全风险是可控的。
经起草工作组会议研究，综合考虑到国际葡萄酒组织（OIV）和欧盟地区法规中规定葡萄酒中赭曲霉毒素A限量标准μg/kg，提出我国葡萄酒中赭曲霉毒素A限量标准为μg/kg。
2.咖啡。
目前我国的咖啡市场的市售咖啡90%来自于进口，国产咖啡只有10%。
进口咖啡货源分布广泛，亚洲地区主要来源于越南和印尼，中南美地区只要进口自哥伦比亚、古巴、巴西牙买加等地，非洲地区主要来源于肯尼亚、埃塞俄比亚等国家。
由于赭曲霉污染主要发生在咖啡原料生产过程，未烘干的咖啡豆由于水分含量较高，较容易滋生霉菌、另外产地潮湿也容易产生霉菌污染，从而导致咖啡受到毒素污染。
根据上述情况，样本按照三大类产品进行采集，即咖啡豆、咖啡粉和速溶咖啡。
真菌毒素限量标准
真菌毒素限量标准
真菌毒素的限量标准因不同的毒素和食品类型而异。
以下是一些常见的真菌毒素及其限量标准：
黄曲霉毒素B1：在饲料中，黄曲霉毒素B1的限量标准根据饲料类型和动物种类而异。
例如，在奶牛饲料中，黄曲霉毒素B1的限量标准为50μg/kg；在猪饲料中，其限量标准为100μg/kg。
赭曲霉毒素A：在配合饲料中，赭曲霉毒素A的限量标准为100μg/kg。
脱氧雪腐镰刀菌醇：在猪、犊牛和泌乳期复合饲料中，脱氧雪腐镰刀菌醇的限量为1mg/kg；在牛、禽饲料中，其限量标准为5mg/kg。
T-2毒素：在猪、家禽饲料中，T-2毒素的限量为1mg/kg。
以上信息仅供参考，如有需要，建议查阅相关网站。
全自动免疫亲和在线净化—高效液相色谱法快速测定粮食中赭曲霉毒素A
霉毒素A的方法，增加了免疫亲和柱的使用次数，提 高了检测的自动化水平和检测效率，降低了检测成
本,以满足大规模样品准确定量的需求。
第34卷第6期 谢 刚等 全自动免疫亲和在线净化一高效液相色谱法快速测定粮食中赭曲霉毒素A 115
1材料与方法
1.1仪器与 Spark通用全自动高效液相色谱，配RIDA®
常用的OTA检测方法主要有胶体金试纸条 法［一7］、酶联免疫法或免疫传感器⑹、生物传感器 法［］、间接竞争免疫分辨荧光免疫分析 ［0］、液相色谱 法或液质联用法［1一15］等方法。薄层色谱法由于操 作复杂，目前应用较少。胶体金和酶联免疫方法用 于快速筛查。液质联用仪检测需要高端的质谱仪。 离线净化的普通高效液相色谱方法目前应用较多， 但存在净化过程操作繁琐、分析速度较慢等问题。
摘 要 建立了全自动免疫亲和在线净化-高效液相色谱法快速测定粮食中赭曲霉毒素A( Ochtatoxin A,OTA)的方法。玉米、小麦样晶经乙睛-水(60：40，卩:卩)提取,3% Tween - 20 (m/卩)水溶液10倍稀释后， 用自动进样器注入RIDA® CREST在线固相萃取系统，经赭曲霉毒素A免疫亲和小柱净化后，以乙睛-2%乙 酸水(50：50,卩:卩)为流动相，流速为1.0 mL/min,C18色谱柱(150 mm X 3.5 mm ,3.5 "m)分离，荧光检测器测 定。根据3倍信噪比的峰响应值，确定赭曲霉毒素A的检出限为0.24 Rg/kg,在0.012 5 ~0.5^g/L范围内呈 线性相关,值为0.999 8；在玉米、小麦样晶中加标回收率为80. 1% -106.9%，变异系数为2.4% ~8.2% 0 本方法一次装柱可检测60个样—,24 h可检测100个样—，满足谷物中赭曲霉毒素A快速准确定量检测的 需要。
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赭曲霉毒素A标准操作规程
1、目的
为了规范亲和柱净化样本中赭曲霉毒素A的操作流程，特制订本操作规程。
2、范围
本标准适用于粮食、饲料、食品中赭曲霉毒素A的检测。
3、检出限和定量限
项目
岛津安捷伦
样本检出限
（µg/kg）
样本定量限
（µg/kg）
样本检出限
（µg/kg）
样本定量限
（µg/kg）
OTA 0.28 0.84 3.6 11.9 4、职责
部门名称部门职责
质量管理部1、负责本制度的实施。
2、负责本制度的监督执行。
5、程序
5.1 原理
测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体内，样品经过提取、过滤后，缓慢的通过赭曲霉毒素A免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。
用2%乙酸甲醇洗脱赭曲霉毒素A，然后注入到高效液相色谱仪中用于检测。
5.2 溶液配制
5.2.1 提取液Ⅰ（用于粮食类样品及酱油、醋类样品的提取）：80%甲醇-水溶液（V甲
醇: V水=80 : 20）：取800mL甲醇，加入去离子水定容至1L。
5.2.2 提取液Ⅱ（用于酒类样品的提取）：称取150g氯化钠、20g碳酸氢钠溶于约950mL
水中，加水定容至1L。
5.2.3 清洗缓冲液（用于酱油、醋类样品净化步骤的洗涤）：称取12.5g 氯化钠、2.5g 碳
酸氢钠溶于水中，加0.1mL吐温-20，用水定容至1L。
5.2.4 冲洗液（用于酒类样品净化步骤的洗涤）：称取25g 氯化钠、5g碳酸氢钠于约
950mL水中，加水定容至1L。
5.2.5 洗脱液（甲醇: 乙酸=49 : 1）：取1ml乙酸加入到49ml甲醇中混匀即可。
5.2.6 赭曲霉毒素A标准工作液：用色谱级甲醇将储备工作液分别稀释到20 ng/ml、10
ng/ml、5ng/ml、2 ng/ml、1 ng/ml。
5.3 样品前处理
5.3.1 粮食类
----20g±0.01g样品（固体样品需粉碎，并过2mm分样筛），5g氯化钠于三角瓶中，加入100mL的提取液Ⅰ（见5.2.1）；
----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；
----取10mL滤液加入40mL去离子水稀释，混匀；
----用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；
----取25mL上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数：1
5.3.2 酒类
----取脱气的酒类样品（含二氧化碳的酒类样品，使用前先搅拌或超声脱气）或不含二氧化碳的酒类样品20g±0.01g，加入提取液Ⅱ（见5.2.2）定容至25mL；
----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用微纤维滤纸过滤至滤液澄清，并收集滤液作为上样液；
----取1mL上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数：1.25
5.2.3 酱油、醋类样品
----取样品25g±0.01g，加入提取液Ⅰ（见5.2.1）定容至50mL；
----高速均质（≥10,000r/min）1min（或用摇床200r/min～300r/min剧烈振荡20min）；----用快速定性滤纸过滤，收集滤液；
----移取10mL滤液用水定容至50mL；
----用微纤维滤纸过滤至滤液澄清，并收集滤液作为上样液；
----取25mL上样液过免疫亲和柱净化。
稀释倍数：0.4
5.4 净化
5.4.1 上样
----取出免疫亲和柱，将上方塞子取出斜剪断，再插回亲和柱上；(3mL的免疫亲和柱去
掉上方塞子，安装上转接头，将转接头另一端与针筒固定后使用)
----将柱子与气控操作架上的针筒连接固定，取适量处理后的溶液上样；
----去掉亲和柱下方堵头，调节开关，使液体以1~2滴/秒的速度流出；
5.4.2 洗涤
----待液体排干；
----净化样品为粮食类时，用10mL去离子水淋洗免疫亲和柱，流速2~3滴/秒；
----净化样品为酱油、醋类时，依次用10mL清洗缓冲液（见5.2.3），10mL去离子水淋洗免疫亲和柱，流速2~3滴/秒；
----净化样品为酒类样品时，依次用10mL冲洗液（5.2.4），10mL去离子水淋洗免疫亲和柱，流速2~3滴/秒；
5.4.3 洗脱
----待液体排干后，更换新针筒，上样2mL洗脱液（见5.2.5），用试管接洗脱液，流速1滴/秒，收集洗脱液并定容至2mL；
----洗脱液用0.22μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶用于HPLC分析。
* 每次上样前都要将上次液体完全排干。
* 也适用于GB 23502-2009。
5.5 液相测定
5.5.1 液相色谱条件
C18柱：250mm（长）×4.6mm（直径），填料粒径5μm；
流动相：55%乙腈45%水（水：乙酸=99:2）
流速：1.0 mL/min；
柱温：40℃；
进样体积：20µL
荧光检测器：
激发波长：333nm
发射波长：477nm
5.5.2 色谱定量
分别取相同体积样液和标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积），以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线，将未知样本中赭曲霉毒素A的峰面积带入标准曲线，得到试样中赭曲霉毒素A的浓度，标准品色谱图参考下图：
数据文件名:ota-10ppb.lcd 样品名:ota-10ppb
0.0
2.5 5.07.5
10.0min
05
mV
检测器A Ex:333nm,Em:477nm
O T A
附图：OTA-10ppb 标准品液相图谱
5.6 注意事项
----使用前，免疫亲和柱需回至室温（22～25℃）。
----亲和柱2～8℃储存，不得冻存。
----不要使用过了有效日期的免疫亲和柱。
----取样量：根据需要可以适当增加或减少取样量，注意提取液量要相应改变。
----柱容量：柱容量是100ng ，当样本中待检毒素的含量除以稀释倍数高于柱容量时，需要适当降低上样液的体积，重新检测。
----pH ：亲和柱的上样溶液pH 需在6～8之间，若偏离此范围需要用盐酸或氢氧化钠调节pH 。
----上机检测时的溶剂与流动相保持一致可以消除溶剂效应的影响。
----赭曲霉毒素可致癌，应戴手套操作。
----使用过的容器及标准品溶液最好用次氯酸钠溶液（5%V/V ）浸泡过夜。
6、
相关文件
《免疫亲和柱检验标准》 《免疫亲和柱检验操作规程》 《岛津液相色谱仪标准操作规程》 《安捷伦液相色谱仪标准操作规程》 7、
相关记录 N/A 8、
附件 N/A 9、
修改历史记录
编号
变更类型
修改条款及主要内容
修改人
修改日期
01 A N/A 魏丹丹2016.3.16
变更类型：A –新起草M - 修订。