枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
枯草芽孢杆菌试验方案
枯草芽孢杆菌浓度测定试验方案一、材料准备（1）实验仪器培养皿、烧杯、天平、玻璃棒、移液枪（5ml 1ml 200ul）、枪头（黄、蓝）、电子天平、250ml锥形瓶、15ml试管、涂布棒、酒精灯、记号笔、封口膜、灭菌锅、漩涡震荡仪（2）实验试剂NA培养基：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水、盐酸、氢氧化钠、无菌水枯草芽孢杆菌（不同浓度梯度）：101、102、103、104、105（3）培养基配方牛肉膏（3g）、蛋白胨（5g）、琼脂（20g）、水（1000ml）、无菌水（100ml）、盐酸、氢氧化钠（调节PH7.0-7.2），121°C下灭菌30 min。
二、实验步骤（1）制备菌液称取1.0g枯草芽孢杆菌转移至灭菌试管中，用移液枪分别移取9ml无菌水至试管，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为①；用移液枪从①中移取1ml混匀菌液至一新试管，用移液枪分别移取9ml 无菌水，并用漩涡震荡仪震荡20-30秒保证完全混匀，标记为②；同理，分别进行稀释，得到③-⑧;（2）进行涂板向每个培养皿中倒入约12ml50℃左右的灭菌的NA培养基，排除气泡；待培养基凝固后，用移液枪分别从①-⑧中吸取200ul菌液，加至已灭菌的培养皿中，用涂布棒进行均匀涂抹，并标记；每个样品做两个处理，每个稀释度重复3次；将密封后的培养皿倒置于36℃的恒温培养箱内培养18h—24h，观察记录实验结果。
（3）菌落计数以平板上出现30个——300个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数：当只有一个稀释度，其平均菌落数在30个-300个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数；若有两个稀释度，其平均菌落数30个-300个之间时，应按两者菌落总数之比值来决定。
若其比例小于2应计数两者的平均数，若大于2则计数其中稀释较小的菌落总数；若三个稀释度的平均菌落数大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数；若三个稀释度的平均菌落数小于300个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。
混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测方法
混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测方法
混合型饲料添加剂中枯草芽孢杆菌的检测是确保饲料添加剂的质量和安全性的重要环节。
以下是一种常用的检测方法：
1.样品准备：从混合型饲料添加剂中取得适当的样品量，确
保样品代表性。
将样品进行适当处理，如研磨或稀释等，以便后续的分析操作。
2.菌落计数：使用枯草芽孢杆菌特异性培养基（如PYG，
Plate Count Agar等），将样品接种于培养基表面，利用平板计数法进行枯草芽孢杆菌的菌落计数。
3.PCR检测：使用枯草芽孢杆菌的特异性引物和探针进行
PCR（聚合酶链式反应）检测，通过扩增枯草芽孢杆菌的DNA片段来确认其存在。
4.实时荧光定量PCR：使用荧光探针和枯草芽孢杆菌特异性
引物进行实时荧光定量PCR（qPCR），检测和定量枯草芽孢杆菌的DNA，同时可以根据标准曲线计算样品中的枯草芽孢杆菌数量。
5.基因测序：对样品进行基因测序，通过分析样品的DNA
序列来确认枯草芽孢杆菌的存在和鉴定特定菌株的种属。
需要注意的是，枯草芽孢杆菌的检测方法可以根据实际需要进行选择，并结合相关标准和法规要求。
同时，实验室应该有足够的设备和技术来执行这些检测方法，并参考相关的操作指南和质量控制要求，以确保检测的准确性和可靠性。
枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
目的：建立枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定标准操作规程范围：本方法适用于的枯草芽孢杆菌活芽孢的测定责任人：内容：1.仪器与工具：电子天平、生物显微镜、摇床、18×180mm试管、500ml三角瓶、10ml 刻度吸管、1ml刻度吸管2．试剂与试液：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、无菌蒸馏水、等。
3.检测培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂16g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，调至PH7.2，121℃灭菌30min。
4.检测步骤：4.1 菌液制备：采样量不少于500g，从所采的样品中精确称取10.00g试样，加入已灭菌的带玻璃珠（玻璃珠在80个左右）的500ml锥形瓶中，加入90ml已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动60min，即成母液的菌悬液。
4.2 用1ml无菌吸管吸取1ml上述母液的菌悬液，加入9ml无菌水混匀成1：1×102稀释的菌悬液，这样依此稀释，直至得到1：106；1：107；1：108；1：109等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。
4.3向每个灭菌培养平皿中倒入约12ml培养基，混合均匀，待凝固后备用。
4.4用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释浓度菌悬液0.2ml，加至已凝固好的培养基中，用涂布棒涂匀，在无菌操作台中静置30min后，倒置于37℃的恒温培养箱内培养18h—24h。
每个样品取3个连续适宜稀释度，每个稀释度重复3次，同时加入无菌水的空白对照，每个稀释度取5个到10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。
5.菌落计数：5.1 以平板上出现20个——200个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数。
5.2 当只有一个稀释度，其平均菌落数在20个——200个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。
5.3 若有两个稀释度，其平均菌落数在20个——200个之间时，应按两者菌落数之比值来决定。
6、结果统计与计算根据菌落数特征判定，分别数出平板中的枯草芽孢杆菌菌数及杂菌数（杂菌是指除枯草芽孢杆菌外的其他菌种）。
枯草芽孢杆菌活菌计数方法
枯草芽孢杆菌活菌计数法
1.实验器材
培养箱,超净台,灭菌锅
90mm培养皿,玻璃涂布棒,三角瓶,5ml、1ml、100μl移液枪及枪头,试管架,
试管,无菌水(器具耗材均需提前高温高压灭菌)。
2.实验方法
1)配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
蛋白胨1%
牛肉膏0.3%
氯化钠0.5%
葡萄糖1%
琼脂2%
121℃高压灭菌20分钟。
2)接种
a)将已灭菌的营养琼脂培养基倒入已干灭好的培养皿中,约25mL/90mm培养皿,待凝固后备用。
b)以准确称取检样0.1g(或1.00mL)放入含有100mL无菌水的玻璃三角瓶中,
充分溶解,即配制成1:1000的稀释液。
c)取0.1mL 1:1000的稀释液注入含有9.9mL无菌水离心管中,涡旋混匀,此为10-5的稀释液。
d)按上述操作顺序做10倍递增稀释液,每稀释一次,换用一个1mL无菌吸头,根据对样品菌落生长情况的预实验,选择合适的稀释
度,最终选择10-7,10-8,10-9 三个稀释梯度。
e)吸取0.25mL稀释液于营养琼脂平板上,用涂布器将菌液涂布均匀,每个稀释度做3个平皿,倒置于30℃恒温培养箱中,培养24h 后取出,计算平板内枯草芽孢杆菌总数目,乘以稀释倍数,即得每克试样所含枯草芽孢杆菌总数。
3 计数
计算平板内枯草芽孢杆菌总数目,乘以稀释倍数,即得每克试样所含枯草芽孢杆菌总数。
枯草芽孢杆菌活菌计数方法
枯草芽孢杆菌活菌计数法
1．实验器材
培养箱，超净台，灭菌锅
90mm培养皿，玻璃涂布棒，三角瓶，5ml、1ml、100µl移液枪及枪头，试管架，试管，无菌水（器具耗材均需提前高温高压灭菌）。
2．实验方法
1）配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
蛋白胨1%
牛肉膏0.3%
氯化钠0.5%
葡萄糖1%
琼脂2%
121℃高压灭菌20分钟。
2）接种
a）将已灭菌的营养琼脂培养基倒入已干灭好的培养皿中，约25mL/90mm培养皿，待凝固后备用。
b）以准确称取检样0.1g（或1.00mL）放入含有100mL无菌水的玻璃三角瓶中，充分溶解，即配制成1：1000的稀释液。
c）取0.1mL 1：1000的稀释液注入含有9.9mL无菌水离心管中，涡旋混匀，此为10-5的稀释液。
d）按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一个1mL无菌吸头，根据对样品菌落生长情况的预实验，选择合适的稀释
度，最终选择10-7，10-8，10-9 三个稀释梯度。
e）吸取0.25mL稀释液于营养琼脂平板上，用涂布器将菌液涂布均匀，每个稀释度做3个平皿，倒置于30℃恒温培养箱中，培养24h 后取出，计算平板内枯草芽孢杆菌总数目，乘以稀释倍数，即得每克试样所含枯草芽孢杆菌总数。
3 计数
计算平板内枯草芽孢杆菌总数目，乘以稀释倍数，即得每克试样所含枯草芽孢杆菌总数。
芽孢的理化性质、芽孢率的定性与定量检测方法
芽孢杆菌定性定量检测方法近年来，微生态制剂在调控动物体内微生态平衡等方面的研究和应用正逐步深入，我国现在已经允许使用的安全微生物有很多种，枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）因具有稳定性好、抗性强、复活率高等自身优势，成为研究和应用较多的菌种之一。
它在目标动物肠道中，通过生物夺氧作用，拮抗致病微生物，并产生多种消化酶和多种营养物质，调节消化道健康，增强动物体的免疫功能，预防疾病的发生，达到促进目标动物的生长、提高饲料的转化率的目的。
在微生态制剂检测中芽孢杆菌的数量以及芽孢率是衡量微生态制剂产品质量的重要指标。
本文旨在介绍芽孢杆菌的特点及其快速、简便的定性、定量检测芽孢杆菌的方法。
一、枯草芽孢杆的理化性质枯草芽孢杆菌菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色（见图1），在液体培养基中生长时，常形成皱褶。
需氧菌。
单个细胞微米、着色均匀。
无荚膜，全身鞭毛能活动。
革兰氏阳性菌，芽孢微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大（显微形态见图2）。
图1 枯草芽孢杆菌平板菌落图2 枯草芽孢杆菌显微形态二、芽孢孢子的定性检测1、染色基本方法如下：（1）取微生态制剂样品1g，加入99mL无菌水，充分摇匀，37℃ 20-30min；（2）用接种环，取菌液，涂于载玻片，风干固定；（3）在涂菌液加入%孔雀绿饱和水溶液，染色10分钟后，用水冲洗至无绿色即可，再用%品红液染色1min，水冲洗、风干后镜检（100倍油镜加香柏油1滴）。
2、结果判断：芽孢孢子呈绿色，营养体呈红色。
三、芽孢孢子的定量检测1、血球计数板法（1）原理：利用血球计数板在光学显微镜下，查出芽孢个数，再用公式计算出1克样品中含芽孢个数。
（2）仪器：血球计数板（25×16格），光学显微镜，刻度吸管，三角瓶，振荡器和玻璃球。
（3）方法和步骤：?a、取样及样品制备：称取待测样品1克（精确到克）装入盛有99毫升水的三角瓶中，然后用振荡器或加玻璃球摇匀，使菌液均匀分布。
芽孢杆菌活菌数及芽孢数检测方法
芽孢杆菌活菌数及芽孢数检测方法1主题内容与适用范围本方法规定了芽孢杆菌总数的测定方法；本方法适用于测定微生物制剂中芽孢杆菌总数2方法提要芽孢杆菌总数是指水样在一定条件下培养后(培养基成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等)所得1mL水样所含菌落的总数。
按本方法规定所得结果只包含一群能在营养琼脂上发育的嗜中温的需氧的芽孢杆菌菌落总数。
3培养基与试剂3.1营养琼脂成分蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，琼脂20g，水1000mL。
3.2制法:将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.2，分装于玻璃容器中(如用国产含杂质较多的琼脂时，应先过滤)，经121℃灭菌20min，储存于冷暗处备用。
3.3生理盐水的制备：按总体积的0.9%称量NaCl并混合均匀，然后用移液枪或移液管吸取9ml生理盐水加入到试管中，并在121℃灭菌20min备用。
4仪器高压蒸汽灭菌器，干热灭菌箱，培养箱，36±1℃，电炉，天平，冰箱，pH计，灭菌试管，平皿(直经9cm)、刻度吸管等。
5活菌计数方法5.1取固体样品5.0g，溶于95mL蒸馏水(此时稀释20倍)，加入适量已灭菌玻璃珠，于200rpm摇床中振荡20min。
5.2用移液枪从锥形瓶取1ml样品液至装有9ml无菌水的试管中，逐步稀释至适当梯度。
5.3吸取0.2mL适当稀释梯度的菌液放入对应平板中，用已灭菌的涂布棒来回涂匀。
5.4涂匀的平板置于30℃培养箱中培养20~30h，待长出清晰可见的菌落，进行计数。
6菌落计数及报告方法作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。
在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。
若片状菌落不到平皿一半，而其余一半中菌落数发布又很均匀，则可将此平皿计数后乘2以代表全皿菌落数。
QBHHS JC009-2013 枯草芽孢杆菌活菌计数办法
1检测方法
平板菌落计数法
2
准备材料2.1普通肉汤培养基：试剂名称
添加数量试剂名称添加数量蛋白胨
10克琼脂15g 牛肉膏
5克蒸馏水1000毫升
NaCl 5克配好后高压灭菌倒平板，37℃培养箱置16h（无菌检查），备用。
2.2
0.05％的琼脂生理盐水，高压灭菌2.3
1ml 枪头，高压灭菌2.4
0.2ml 枪头，高压灭菌2.5灭菌的试管
3
试验步骤3.1
向各灭菌试管中加入4.5ml 琼脂生理盐水，每个样品准备至少7支试管；3.2无菌称取0.5g 混匀的新鲜样品，加入到第1支试管，充分混匀后，吸取0.5ml 至第2支试管，同样处理，直到第后一管；
注意：每支试管一定要充分混匀，这是试验成功与否的关键！
3.3分别从最后3管用移液器吸出20μl，再分别滴种到普通肉汤培养基上，每个梯度做三个重复；
注意：一定要从后向前做！
3.4将滴好的平板正置放置30min，使其充分干燥后，再将其拿出置37℃培养箱好氧培养约12h，即可观察结果；
4计数
培养结束后，取出平板，计数每个平板每滴的细菌数量，计算三个重复的平均数，再乘以相应的稀释倍数，即得原样品中的活菌数。
检测技术规范与标准方法
编号：QB/HHS JC009-2013修订：第1版第1次修改枯草芽孢杆菌活菌计数方法起草：赵丽霞
审核：刘永垒
批准：
执行日期：2013年6月15日。
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枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定操作规程
文档编制序号：[KKIDT-LLE0828-LLETD298-POI08]
目的：建立枯草芽孢杆菌活菌数含量的测定标准操作规程
范围：本方法适用于的枯草芽孢杆菌活芽孢的测定
责任人：
内容：
1.仪器与工具：电子天平、生物显微镜、摇床、18×180mm试管、500ml三角瓶、10ml刻度吸管、1ml刻度吸管
2．试剂与试液：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、无菌蒸馏水、等。
3.检测培养基配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、琼脂16g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，调至，121℃灭菌30min。
4.检测步骤：
菌液制备：采样量不少于500g，从所采的样品中精确称取试样，加入已灭菌的带玻璃珠（玻璃珠在80个左右）的500ml锥形瓶中，加入90ml已灭菌的无菌水，在摇床上200r/min摇动60min，即成母液的菌悬液。
用1ml无菌吸管吸取1ml上述母液的菌悬液，加入9ml无菌水混匀成1：1×102稀释的菌悬液，这样依此稀释，直至得到1：106；1：107；1：108；1：109等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。
向每个灭菌培养平皿中倒入约12ml培养基，混合均匀，待凝固后备用。
用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释浓度菌悬液，加至已凝固好的培养基中，用涂布棒涂匀，在无菌操作台中静置30min后，倒置于37℃的恒温培养箱内培养
18h—24h。
每个样品取3个连续适宜稀释度，每个稀释度重复3次，同时加入无菌水的空白对照，每个稀释度取5个到10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。
5.菌落计数：
以平板上出现20个——200个菌落数的稀释度平板为记数标准，并确定为稀释倍数。
当只有一个稀释度，其平均菌落数在20个——200个之间时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数。
若有两个稀释度，其平均菌落数在20个——200个之间时，应按两者菌落数之比值来决定。
6、结果统计与计算
根据菌落数特征判定，分别数出平板中的枯草芽孢杆菌菌数及杂菌数（杂菌是指除枯草芽孢杆菌外的其他菌种）。
统计算出同一稀释度三个平皿上菌落平均数（B）和杂菌数（E）。
有效活菌总数按式（1）计算；
A=10×B×C×5 (1)
式中：
A——有效活菌总数，cfu/g
B——菌落活菌数；
C——稀释倍数。
杂菌率按式（2）计算：
式中：
D——杂菌率，%
E——杂菌数。